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Neuroscience

Immunhistochemischen und Calcium Imaging Methoden in der Wholemount Rat Retina

Published: October 13, 2014 doi: 10.3791/51396
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1,2,4, 1
1Department of Neurobiology, University of California, Los Angeles, 2Veterans Administration Greater Los Angeles Healthcare System, 3Departments of Physiology & Biophysics and Ophthalmology & Visual Sciences, Dalhousie University, 4Departments of Neurobiology and Medicine, Jules Stein Eye Institute, CURE-Digestive Diseases Research Center, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

Immunhistochemie Protokolle werden verwendet, um die Lokalisierung eines bestimmten Proteins in der Netzhaut zu untersuchen. Calcium-Imaging-Techniken verwendet werden, um Calciumdynamik in retinalen Ganglienzellen und ihre Axone zu studieren.

Abstract

In diesem Beitrag beschreiben wir die Werkzeuge, Reagenzien und die praktischen Schritte, die für notwendig: 1) erfolgreiche Vorbereitung von wholemount Netzhaut für die Immunhistochemie und 2) Kalzium-Imaging für die Untersuchung von spannungsabhängigen Calcium-Kanal (VGCC) vermittelt Calcium-Signalgebung in der Netzhaut Ganglienzellen. Die Kalzium-Imaging-Methode beschreiben wir circumvents Fragen über nicht-spezifische Belastung von Vertriebenen Amakrinzellen in der Ganglienzellschicht.

Introduction

Retinalen Ganglienzellen (RGCs) exprimieren L, N, P / Q-und T-Typ VGCC wie durch pharmakologische Blockade dieser Komponenten der gesamten Zelle bestimmt Ca-Kanalstrom 1,2. VGCC sind Trans multimeren Proteine, die in Transmitterfreisetzung, Gen-Transkription, Zellregulation und der synaptischen Plastizität 3,4,5 beteiligt sind. Groß, Trans α 1 porenbildenden Untereinheiten, die biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften des Kanals, in erster Linie Hilfsextrazellulären α-Untereinheiten und 2 δ intrazellulären β-Untereinheiten zu etablieren: Funktions VGCCs bestehen aus mindestens drei verschiedene Klassen von Untereinheiten. Die beiden letztgenannten Form heteromeren Komplexe mit verschiedenen α-Untereinheiten 1 und ändern Sie die Gating-Kinetik und den Handel mit den Kanälen in der Plasmamembran 6.

In den letzten Jahrzehnten wurden viele Techniken eingesetzt, um Protein expre studierenSpaltung, wie der Immunhistochemie, Enzyme-linked Immunosorbent Assay, Western-Analyse und Durchflusszytometrie. Diese Techniken erfordern die Verwendung spezifischer Antikörper zum Nachweis eines bestimmten Proteins von Interesse und liefern leistungsstarke Werkzeuge für die Lokalisierung und Verteilung spezifischer Proteine ​​in unterschiedlichen Geweben. Techniken zum Nachweis und zur Quantifizierung der mRNA Expression eines bestimmten Proteins, wie Northern-Blot-Analyse, RT-PCR, quantitative Echtzeit-RT-PCR, in situ-Hybridisierung, cDNA-Microarrays und Ribonuclease Protection Assay einen alternativen Ansatz bei der Antikörper nicht ohne weiteres verfügbar ist oder wenn die Expressionsniveaus eines bestimmten Proteins niedrig sind 7. , Eine Beschränkung auf die Verwendung von solchen molekularen Techniken ist jedoch die erforderliche Identifizierung der Gensequenz.

Um Proteine ​​in der Netzhaut zu lokalisieren, kann die Immunhistochemie auf wholemount Netzhaut durchgeführt werden. Aufgrund der Zugänglichkeit der RGCs, der WholemountVorbereitung bietet eine hervorragende Plattform, um die Lokalisierung von spezifischen Proteinen auf die RGC Somata und ihre Axone zu studieren.

Zusätzlich zu ihrer Lokalisierung, können einige funktionelle Eigenschaften der VGCCs in RGCs durch die Verwendung von Calcium-Imaging-Techniken nachgewiesen werden. Wir beschreiben eine Kalzium-Imaging-Protokoll, um selektive Markierung RGZ mit einem Calcium-Indikatorfarbstoff, um intrazelluläre Kalziumdynamik messen. Der Beitrag der unterschiedlichen VGCCs um das Calciumsignal in verschiedenen Zellkompartimenten können mit der Verwendung von subtypspezifischen Ca-Kanalblocker, isoliert werden.

Vielleicht einer der vorteilhaften Aspekte des hier beschriebenen Calciumabbildungstechnik ist die Möglichkeit, gleichzeitig und unabhängig voneinander von mehreren RGCs und ihre Axone aufzuzeichnen. Obwohl viele physiologische Techniken, wie beispielsweise Voll Patch-Clamp-Aufnahme, eine hohe Zeitauflösung Aufnahmen Membranströme, die somatische oder axonale Quelle thesaufgezeichnet e Ströme nicht unterschieden werden und Aufnahmen können nur von einem einzelnen Neuron zu einem Zeitpunkt vorgenommen werden. Multielektroden-Arrays (MEA) sind in der Lage, gleichzeitig die Aufzeichnung Spitzen von vielen Zellen, aber weder erkennen noch zu benachteiligen die Aktivierung, beispielsweise unterschiedliche Subtypen von Calciumkanälen. MEAs bevorzugt von Zellen, die in der Nähe einer bestimmten Elektrode 8 und Satzes aus Zellen, die große Spitzen 9 erzeugen befinden aufzuzeichnen. Optischen bildgebenden Verfahren bieten eine alternative Strategie, um die gleichzeitige und unabhängige Aufnahmen von ganzen Populationen von Zellen, die mit dem von der Einzelzellmikroelektroden-und Patch-Clamp-Aufzeichnung und MEA Aufnahme gewonnenen Informationen integriert werden können ermöglichen. Obwohl die hier beschriebenen Kalzium-Imaging-Techniken wurden eingesetzt, um die Dynamik von Kalzium RGZ studieren können Patch-Clamp-und MEAs auch parallel zur weiteren Aufklärung der Ionenströme und Spick Eigenschaften der RGZ werden.

10, unser Ziel war es, eine Ladetechnik, die selektiv Etiketten RGZ mit einem synthetischen Kalzium-Indikator-Farbstoff in einer Gebrauchs wholemount Vorbereitung. Obwohl synthetische Calcium-Indikator-Farbstoffe eine ausgezeichnete Plattform für die Untersuchung der intrazellulären Calciumdynamik hat weitverbreitete Verwendung durch die Unfähigkeit behindert, um spezifische Populationen von Neuronen in einem bestimmten Netzwerk effektiv zu laden. Viele Techniken wie Bulkbeladung 11 und Elektroporation 8,12 durchgeführt, um zu laden ganze Populationen von Zellen, aber solche Techniken nicht zwischen bestimmten Zelltypen zu unterscheiden. Genetisch kodierte Calciumindikatoren liefern die Fähigkeit, selektiv zu markieren spezifischen Populationen von Zellen, jedoch erfordern solche Verfahren die Herstellung von transgenen Tieren 13. Unsere Technik beschreibt ein method selektiv beschriften RGZ in der wholemount Herstellung über Sehnerv Stumpf Injektion eines Kalzium-Indikator-Farbstoff.

Zusammengenommen, strukturelle und physiologische Techniken in diesem Artikel beschrieben eine Plattform bieten, um die Lokalisierung und den Beitrag der VGCCs auf die Kalzium-Signal in RGZ und ihre Axone zu studieren.

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Protocol

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für das Wohlergehen der von der US Public Health Service Politik Menschen Pflege und Verwendung von Labortieren und der University of California-Los Angeles (UCLA) Tierforschung Committee Versuchstieren durchgeführt. Männliche und weibliche erwachsene Sprague-Dawley-Ratten (Charles River Lab, Wilmington, MA) im Alter von 3-5 Wochen wurden verwendet.

1. Tier-und Gewebepräparation für Wholemount Retina und Immunhistochemie Protokoll

  1. Bereiten Sie die folgenden Materialien und Werkzeuge: einem Binokular, 2 Pinzetten mit sehr feinen Spitzen, Schere, Zellulosefilterpapier, Kunststoffpipette und einem Objektträger.
  2. Euthanize die Ratte in einer geschlossenen Kammer von tief Betäubung des Tieres mit 1-3% Isofluran gefolgt durch Enthauptung mit einer Guillotine. Die Augen mit einem Paar von Iris Schere und in eine Petrischale mit der extrazellulären Lösung zu entfernen. Hibernate A, Ames Medium oder physiologischen Lösungen empfohlen.
  3. [Optional Schritt, wenn Verfüllung der RGZ mit Fluo-4 ist erwünscht]. Führen Sie die Fluo-4 Kennzeichnung wie in den Schritten 2.3-2.4 beschrieben.
  4. Verwendung des Binokular (Lichtstärke: 1,6 x 10 8 Photonen / mm 2 ⋅sec), entfernen Sie die Hornhaut durch das Abschneiden der vor dem Auge Ball. Entfernen Sie die Linse und Glas von der inneren Netzhautoberfläche mit einer Pinzette. So entfernen Sie den Glaskörper, stabilisieren den Augapfel, indem die Lederhaut fest mit einer Zange. Ziehen Sie leicht dem Glaskörperbasis in Richtung der Mitte der Netzhaut, mit der anderen Zange. Die Zubereitung wird in diesem Stadium wird als Augenmuschel, die für Gefrierschnitte verwendet. Mehr Details über Gefrierschnitte können in den Referenzen 14,15 gefunden werden.
  5. Entfernen Sie die Netzhaut von der Augenmuschel. Dann stellen vier Schnitte, damit der Netzhaut flach zu legen. Halterung sanft auf die Netzhaut auf einem Objektträger mit der Photorezeptorschicht auf. Geben Sie einen Tropfen der Lösung auf die Netzhaut und legte cellulose Filterpapier auf der Netzhaut. Sobald die Netzhaut wird an der Filterpapier, legen die Netzhaut wieder in Lösung. Wenn nötig, glätten die Netzhaut mit einem Pinsel oder einer Pinzette.
  6. Legen Sie die Netzhäute wholemounted in 4% PFA für 10-15 min zur Fixierung.
  7. Dreimal Waschen der wholemounted Netzhaut für 30 min in 0,1 M Phosphatpuffer (PB), pH 7,4. Sperrung der Netzhaut mit 5% normalem Ziegenserum oder Esel Serum in 0,1 PB, enthaltend 0,3% Triton X-100 und 0,1% NaN 3 bei 4 ° C über Nacht. Wir empfehlen ein Gesamtvolumen von 500 ul für alle Schritte zur Blockierung Lösungen und Antikörper zu speichern.
  8. Am nächsten Tag, bebrüten die Netzhaut wholemounts mit dem primären Antikörper 5-7 Tage bei 4 ° C. Optimale Verdünnungen muss vom Anwender bestimmt werden.
  9. Waschen der Netzhaut 3 x 30 min in 0,1 M PB und Inkubation über Nacht bei 4 ° C in das entsprechende Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper, der gegen die Spezies des primären Antikörpers (Konzentration 1: 1000) gerichtet ist.
  10. Nach drei abschließenden Waschanlagen von 30 min mit je PB, montieren die Netzhaut in Montagemedium. Verschließen Sie die Deckgläser mit Nagellack für eine längere Lagerung. Proben bei 4 ° C und vor Licht schützen.

2. Kennzeichnung der Ganglienzellen und Axone in Rat Wholemount Netzhäute mit einem Calcium-Indikator-Farbstoff

  1. Bereiten 1000 ml Ringer-Säuger (in mM) 125 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 1 MgCl 2, 25 NaHCO 3 enthält, und 10 Glucose mit 95% O 2/5% CO geperlt ­ 2.
  2. Führen Sie die Präparation wie in den Schritten 1.2-1.4 beschrieben.
  3. Um retinalen Ganglienzellen (RGC) und ihre Axone mit einem Calcium-Indikator-Farbstoff in den Sehnerv Stumpf laden, injizieren 0,5 ul Fluo-4 Pentapotassium Salz (40 mM Stamm in H 2 O) ca. 1 mm hinter dem Augapfel mit einer Spritze . Zur Messung dynamischer Anstieg der Ganglienzelle [Ca2 + i eine Anzeige mit hoher Affinität, wie Fluo-4 mit K d von 345 nM, ist optimal. Fluo-4 bietet den zusätzlichen Vorteil, dass eine sehr hohe Quantenausbeute, was zu einer Emissionserhöhung von> 100-fach, wenn Calcium gebunden.
  4. Legen Sie die Augenmuschel in Säuger Ringer-mit 95% O sprudelte 5.2% CO ­ 2 für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.

3. Calcium Imaging Protokoll zur retinalen Ganglienzellen und Axonen.

  1. Entfernen Sie das Auge, Linse und Glaskörper wie in den Schritten 1.1-1.4 beschrieben. Isolieren Sie die Netzhaut von der Augenmuschel und teilen sich in Quadranten. Hängen Sie eine Quadranten Ganglienzellseite nach oben auf einem Glasobjektträger und verwenden Sie eine Harfe Scheibe Raster, um es zu stabilisieren. Halten Sie die anderen Stücke dunkeladaptierten in Säuger Ringer-mit 95% O sprudelte 5.2% CO ­ 2 auf Eis für die spätere Verwendung.
  2. Superfuse die Aufzeichnungskammer, die mit Säuger-Ringer-Lösung undhalten Sie die Lösung kontinuierlich sprudelnde mit 95% O 2/5% CO 2.
  3. Bild das Gewebe unter dem Mikroskop. Verhaltensexperimente bei Raumtemperatur (~ 23 ° C) zu erreichen oder physiologischen Temperaturen durch Erwärmen der Stufe Erhitzen des Wasserbades unter der Probe oder der Anwendung warmer Luft auf die Oberfläche der Probe.
    Hinweis: Es ist wichtig zu beachten, dass viele Zellfunktionen werden durch Temperatur, die eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase intrazellulären 16 spielt geregelt. Jedoch können Einführung Erwärmung misst die Rate des Photobleichen, Verdampfung des Mediums und Fokusdrift durch thermische Ausdehnung verursachte 17 zu erhöhen. Verwendung von Raumtemperatur sinkt intrazellulären Kompartimentierung Fluo-4 18.
  4. Durchführen einer Steuerung von zwei gepaarten hohen K +-Impulse in der Abwesenheit von Arzneimittel. Depolarisieren RGZ und RGC Axone durch die Erhöhung der [K +] o von 3 mm bis 60 mm für 33 sec bei jedem Impuls zu aktivierenVGCCs mit einem Acht-Kanal-Schwerkraft Superfusionssystem. Reduzieren Na + von 57 mM bis isosmolarity in der erhöhten K +-Lösung zu erhalten.
  5. Den Beitrag der verschiedenen VGCCs auf die Kalzium-Signal mit der Verwendung von allgemeinen oder spezifischen Ca-Kanal-Blocker. Zum Beispiel kann die Verringerung der Calcium-Signal nach der Verabreichung einer nicht-spezifische Calciumkanal-Blocker, Kobalt, ein semi-quantitatives Maß für den Beitrag der VGCCs der hohen K + -evoked Calciumsignals.
  6. Erwerben Fluoreszenzintensität Werte, indem Sie eine Region of Interest (ROI) um die RGZ von Interesse (Abbildung 2).
  7. Normalisieren der Änderung der durch den zweiten Hoch K + Peak, der durch den ersten Hoch K + Peak erzeugt Änderung erzeugten Fluoreszenzintensität. Dann zum Testen spezifischer Calcium-Kanal-Blocker, gelten Medikamente nur während der zweiten Hoch K + Impuls eines Paares und normalisieren diese Spitze gegender erste Spitzenwert. So messen Sie die Auswirkungen der Droge auf der hohen K + Peak, teilen Sie die Amplitude der zweiten K + Peak durch die des ersten. Analyse sollte dieser Werte in Bezug auf ihre Übereinstimmungen Steuerungen von gepaarten hohen K + Peaks in Abwesenheit des Arzneimittels gemessen abgeleitet geführt werden.
  8. Erwerben Sie Bilder mit 5 Sekunden-Intervallen. Auf Foto-Bleich zu vermeiden, halten Sie die Laseranregung so gering wie möglich. Bereitzustellen Anregung durch den 488 nm-Linie des Argon-Lasers, während der Photovervielfacherröhre sammelt die Fluoreszenzemission durch einen 505 nm-LP-Filter.

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Representative Results

Immunmarkierung mit spezifischen Antikörpern bietet eine Plattform, um die Lokalisierung von bestimmten Proteinen von Interesse in der Netzhaut und des Calciumbildgebungstechnik zu untersuchen erlaubt die Untersuchung der Beiträge der VGCCs den Calciumdynamik in den retinalen Ganglienzellen und ihre Axone.

Durch die Verwendung eines Antikörpers gegen den Ganglienzellprotein RBPMS (RNA-Bindeprotein mit mehreren Spleißen), die selektiv markiert RGCs 19, konnten wir zeigen, dass der Fluo-4-Kennzeichnung ist auf Ganglienzellen (Abbildung 1). Stumpf-Injektion nicht auf die Kennzeichnung aller Ganglienzellen wie man es von dieser Technik zu rechnen führen.

Ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen den N-Terminus des Polypeptids RBPMS (RBPMS 4-24) GGKAEKENTPSEANLQEEEVR von einem kommerziellen Lieferanten (Tabelle 1) erzeugt. RBPMS ist hoch unter den Säugetieren konserviert und das Polypeptid-Sequenz verwendet für die Immunisierung ist in Maus, Ratte, Affe und Mensch (NCBI Protein Bank, identische http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein ). Kaninchenseren wurde nach der Immunisierung und Affinität mit einem Polypeptid RBPMS Affinitätssäule gereinigt gesammelt. Der affinitätsgereinigte Antikörper wurde gezeigt, Ganglienzellen Immunfärbung in der Maus und Rattennetzhaut. Um die Spezifität der Immunfärbung RBPMS zu bewerten, wurde ein Kontroll Präabsorption mit dem Kaninchen-Antikörper durchgeführt. Kurz gesagt wurde die RBPMS Antikörper in 0,1 M PB, enthaltend 0,5% Triton X-100 und mit dem RBPMS Polypeptid in einer Endkonzentration von 1 ug / ml für 2 Stunden bei RT, verdünnt. Kein RBPMS Immunfärbung war in Gewebeschnitten mit den präabsorbiert Kaninchen-Antikörper zu RBPMS und durch Standard immunhistochemischen Techniken verarbeitet inkubiert vorhanden.

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Abbildung 1: Post-hoc-Immunfärbung mit Antikörpern gegen die RGC-Protein RBPMS (rot) an Fluo-4 (grün)-Lokalisierung in den Ganglienzellen zeigen ein Alexa 568 Ziege-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper verwendet wurde.. Maßstab: 20 mm.

Calcium-Imaging-Techniken verwendet, um den Beitrag zu VGCCs Kalziumsignals in der RGCs und ihre Axone zu studieren. Fluoreszenzintensitätswerte wurden hergestellt, indem ROIs auf die RGZ von Interesse (Abbildung 2) erworben.

Figur 2
Abbildung 2:. 50 mm: Um Fluoreszenzintensitätswerte zu erwerben, wurden ROIs auf der Ganglienzelle Somata und / oder Axone Maßstabsleiste platziert.

Fluo-4 Pentapotassium Salz wurde verwendet, um RGZ und ihre Axone (Abbildung 3) zu kennzeichnen.


Abbildung 3: VGCC Subtypen, die Calcium-Signal in Ganglienzellen und ihre Axone Somata beitragen. (A) Konfokale Bild einer wholemount Netzhaut das Ausgangsniveau. RGCs und RGC Axone mit Fluo-4 erkennbar markiert werden. (B) Fluoreszenzsignale aus einem einzigen RGC somata Nachweis der Zunahme der mittleren Fluoreszenzintensität von gepaarten Impulsen von Hoch K + (60 mM) Badelösung und die anschließende Reduktion hervorgerufen Fluoreszenz in Gegenwart von Kobalt während des zweiten Impulses. Maßstab für A: 20 mm.

Die Zeiss LM5 Pascal System wurde eingestellt, um Bilder mit einer Bildrate von 5 Sekunden zu erfassen und jede Vollformat-Scan dauerte 1,57 Sekunden bei den Einstellungen verwendet. Einen Sammelbereich von 318 um · 318 um wurde in dem abgetasteten Bereich von 512 x 512 PI enthaltenxels geben eine Fläche von 0.385 um 2 pro Pixel. Diese Einstellungen können abhängig von der gewünschten Auflösung variiert werden. Das System verwendet einen 25 mW Argon-Laser für die 488 nm-Anregung. Wir haben diese Linie bei 3% Leistung. Sättigung wurde, indem zuerst die niedrigste Konzentration der Calcium-Indikator-Farbstoff, der die stabilen Antworten auf die depolarisierenden Stimulus ergab, und dann durch Verringerung der Ausgangsverstärkung minimiert. Reduktion der Laserleistung beigetragen, Bleich vermeiden. Indikatorkonzentration wurde nicht gemessen. Kalibrierung nicht-ratiometrische Bildgebung ist möglich durch die Verwendung von Calcium-Ionophore, aber das Verfüllungstechnik kann mit ratiometrische Farbstoffe so gut funktionieren. Um die optimale Anzeige Konzentration zu bestimmen, verglichen wir die Depolarisation hervorgerufene Veränderung der Fluoreszenz mit Stumpf-injizierten Konzentrationen von Fluo-4 im Bereich von 1 bis 40 mM. Rundschreiben und ovalen ROIs wurden um RGZ und ihre Axone bzw. die stabile Fluoreszenzintensität zeigte gezogen. RGZ und Axonen, die aus driftetekonzentrieren aufgrund der Bewegung durch Superfusion verursacht wurden nicht ausgewählt.

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Discussion

1) Immunhistochemie auf Fluo-4-Lokalisierung in den Ganglienzellen in der Netzhautwholemounts zeigen, und 2) Calcium Imaging, Kalzium Dynamik in retinalen Ganglienzellen und ihre Axone zu analysieren: In diesem Artikel haben wir zwei verschiedene Techniken beschrieben.

Immunhistochemie unter Verwendung wholemounts wurde verwendet, um die Lokalisierung von Proteinen in den Nager Retina 20-23 offenbaren. Es gibt jedoch einige Einschränkungen. Die Qualität der Färbung hängt stark von der Fähigkeit des Antikörpers zu seinem jeweiligen Antigen und seiner Fähigkeit, die Netzhautgewebe auf die jeweilige Schicht von Interesse durchdringen zu erkennen. Diese Probleme können durch eine Erhöhung der Inkubationszeit in dem primären Antikörper um bis zu sieben Tage, eine Erhöhung der Konzentration von Triton-X und / oder Inkubieren der Retina ohne das Filterpapier, um die Diffusion des Antikörpers durch die Ganglienzellschicht ermöglichen, verbessert werden, und die Photorezeptoren. Eine weitere Einschränkung ist die duratiauf und die Konzentration der Fixierung. Einige Antikörper funktionieren besser, wenn das Gewebe für eine Stunde festgelegt, während andere Antikörper eine kürzere Zinsbindung. Ebenso, während bestimmte Antikörper funktionieren am besten in 4% PFA Fixierung, andere besser zu reduzierten Konzentrationen. Wir empfehlen, dass der Benutzer die optimale Dauer und Konzentration der Fixierung, der Dauer der Inkubation, die Konzentration von Triton-X, sowie die Konzentration des primären Antikörpers, um optimale Ergebnisse zu bestimmen.

Calcium-Bildgebung verwendet, um die Calcium-Dynamik in retinalen Ganglienzellen und ihre Axone zu studieren. Superfusion VGCC Blockierungsmittel gestattet Bewertung der relativen Sperr Wirksamkeit der Medikamente und die Anwesenheit von verschiedenen Ca-Kanal-Subtypen. In dem Fall, dass RGZ Axone und nicht zu hohe K + reagiert, versuchen die Verringerung der Konzentration der Kalzium-Indikator-Farbstoff, wie hohe Konzentrationen können zur Sättigung führen. Unvollständige Entfernung des Glaskann auch als Barriere wirken, verhindern hohe K + vom Erreichen der RGZ und ihre Axone. Darüber hinaus können Nichteinhaltung dieser die Harfe auf der Netzhaut Bewegung verursachen, was zu einer Unfähigkeit, die Fluoreszenzintensität Werte zu erwerben. Wenn die Netzhaut weiter zu bewegen, vorsichtig die Harfe, trocknen Sie den Bereich rund um die Netzhaut und wieder montieren die Harfe, indem mehr Fett auf seinen Umfang. Vollständige Entfernung des Glaskörpers und mit minimaler Bewegung des retinalen Wholemount ist entscheidend für den Erfolg des Experiments.

Agonisten der Calcium-permeable Glutamatrezeptoren von RGCs, wie N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) ausgedrückt, 24,25 α-Amino-3-hydroxy-5-methylisoxazol-4-propionat (AMPA)-Rezeptoren und Kainat-Typ ionotropen Glutamat-Rezeptoren 26-29, kann verwendet werden, um die direkte Eingabe von Calcium hervorrufen sowie eine depolarisierende Reiz, VGCCs aktiviert werden. Verwendung solcher Agonisten können zu einem nicht führenEinheitliche Kollisionsantwort aufgrund der differentiellen Expression der Glutamat-Rezeptor-Subtypen zu den verschiedenen Arten von RGCs. Zwei-Photonen-Mikroskopie kann auch verwendet werden, um Licht hervorgerufenen Calciumsignale in RGCs 30 und Dendriten 31 zu untersuchen.

Selektive Markierung der RGCs wurden durch die Membran impermeant Eigenschaften des Fluo-4 Calciumsalz Pentakaliumtriphosphat Indikatorfarbstoff gelöst. Dextran-konjugierten Calciumindikatorfarbstoffe sind auch verwendet worden, um selektiv zu markieren RGCs und ihre Axone über intraretinale Injektionen bei Kaninchen 32 und 33 Ratten. In beiden Studien wurde eine selektive Markierung der RGCs und ihre Axone über intraretinale Injektionen des Dextran-konjugierten Calcium-Indikator-Farbstoff, gefolgt von einer 2-stündigen Inkubation bei 32 Kaninchen oder einem 7-stündigen Inkubation in Ratten 33 erreicht. Trotz ein angemessenes Inkubationszeit einheitliche Kennzeichnung in der Netzhaut zu gewährleisten, führen solche Methoden in erhöhter Kennzeichnung von RGZ und derenAxone nächsten Injektionsstelle gegenüber spärlich Kennzeichnung Regionen distal zur Injektionsstelle. Wie in Baldridge (1996), nicht-einheitliche Kennzeichnung an der Injektionsstelle diskutiert wurde Diffusions Kennzeichnung Soma als Ergebnis der Farbstoffaufnahme in den belichteten (geschnitten) Dendriten wurden durch retrograden Transport zurückzuführen, während die Markierung in distalen Bereichen dürfte ab Aufnahme des Farbstoffs an der freiliegenden Axon 32. Unsere Technik stellt verbesserte Verfahren zur einheitlichen Kennzeichnung von RGCs und ihre Axone zu erhöhen und um die erforderliche Inkubationszeit minimieren.

Die vorliegende Farbstoffbeladung Verfahren stellt eine alternative Strategie, um herkömmliche Techniken, wie Bulkbeladung und Elektroporation, die in nicht-spezifische Belastung des verlagert Amacrinzellen in der Ganglienzellschicht führen. Mit der Verfügbarkeit von transgenen Mauslinien tdTomato oder EGFP unter der Kontrolle von Promotoren zum Ausdruck, die in bestimmten Ganglienzellpopulationen 34-38, zukünftiger Anwen sindons dieser Technik kann Kalzium-Imaging-Studien von spezifischen retinalen Ganglienzellen Untertypen gehören.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Angaben.

Acknowledgments

Wir danken Dr. S. Stella und Helen Vuong für Beiträge zur Kalzium-Imaging-Protokoll. Wir danken Herrn Dr. K. Blätter für Dreharbeiten für den Interview-Szenen. Wir danken Dr. Arlene Hirano für ihre Kommentare zum Manuskript. Diese Forschung und Entwicklungsprojekt wurde von den Autoren an der David Geffen School of Medicine an der UCLA durchgeführt und wird von einer vertraglichen Vereinbarung, die von der US Army Medical Research & Materiel Command (USAMRMC) vergeben und verwaltet wurde möglich gemacht und die Telemedizin & Advanced Technology Forschungszentrum (TATRC) in Fort Detrick, unter Vertragsnummer MD: W81XWH-10-2-0077. Unterstützung für diese Studien kam auch von NIH EY04067 und VA Merit Review (NB). NZB ist ein VA Karriere Research Scientist.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Straight scissors WPI 14124-G dissecting tools
Straight Forceps WPI 501985 dissecting tools
curved iris scissors WPI 504487 dissecting tools
Cellulose filter paper Millipore HABP04700
Hibernate A Invitrogen A12475-01 Media
Vectashield Vector H-1000 Mounting Media for Fluorescence
Fluo-4 pentapotassium Invitrogen F-14200
Isoflurane Abbott Laboratories 05260-05 anesthesia
Microscope slide Fisher Scientific 22-178-277
Zeiss LSM 5 Pascal microscope Zeiss
Axioplan 40X (NA 0.8) objective lens Zeiss
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Molecular Probes A-11034 Secondary antibody
RBPMS ProSci, Poway, CA A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guenther, E., et al. Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat. Brain Res. 633, 223-235 (1994).
  2. Farrell, S. R., et al. Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ganglion cells mediated by somatostatin receptor subtype 4. J Neurophysiol. 104, 1347-1354 (2010).
  3. Caterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 521-555 (2000).
  4. Berridge, M. J., et al. Calcium--a life and death signal. Nature. 395, 645-648 (1998).
  5. Berridge, M. J. Calcium microdomains Organization and function. Cell Calcium. 40, 405-412 (2006).
  6. Dolphin, A. C. Calcium channel diversity multiple roles of calcium channel subunits. Curr Opin Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
  7. Rottman, J. B. The ribonuclease protection assay a powerful tool for the veterinary pathologist. Vet Pathol. 39, 2-9 (2002).
  8. Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
  9. Segev, R., et al. Recording spikes from a large fraction of the ganglion cells in a retinal patch. Nat Neurosci. 7, 1154-1161 (2004).
  10. Jeon, C. J., et al. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18, 8936-8946 (1998).
  11. Blankenship, A. G., et al. Synaptic and extrasynaptic factors governing glutamatergic retinal waves. Neuron. 62, 230-241 (2009).
  12. Daniels, B. A., Baldridge, W. H. d-Serine enhancement of NMDA receptor-mediated calcium increases in rat retinal ganglion cells. J Neurochem. 112, 1180-1189 (2010).
  13. Weitz, A. C., et al. Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators. J Neurophysiol. 109, 1979-1988 (2013).
  14. Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Expression of voltage-gated calcium channel α(2)δ(4) subunits in the mouse and rat retina. J Comp Neurol. 521 (2), 2486-2501 (2013).
  15. Hirano, A. A., et al. SNAP25 expression in mammalian retinal horizontal cells. J Comp Neurol. 519, 972-988 (2011).
  16. Berridge, M. J., et al. Calcium signalling dynamics, homeostasis and remodeling. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-529 (2003).
  17. Dailey, M. E., et al. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harb ProtocI. , 373-379 (2011).
  18. Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring intracellular calcium ion dynamics in hair cell populations with Fluo-4. AM. PLoS One. 7, e51874 (2012).
  19. Kwong, J. M. K., et al. RNA binding protein with multiple splicing A new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1052-1058 (2010).
  20. Pérez deSevilla Müller, L., et al. Displaced amacrine cells of the mouse retina. J Comp Neurol. 505, 177-189 (2007).
  21. Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Tracer coupling of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells to amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 518, 4813-4824 (2010).
  22. Raymond, I. D., et al. Cyan fluorescent protein expression in ganglion and amacrine cells in a thy1-CFP transgenic mouse retina. Mol Vis. 14, 1559-1574 (2008).
  23. Raymond, I. D., et al. A Thy1-CFP DBA/2J mouse line with cyan fluorescent protein expression in retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 26, 453-465 (2009).
  24. Mayer, M. L., Westbrook, G. L. Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurones. J Physiol. 394, 501-527 (1987).
  25. Ascher, P., Nowak, L. The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurons in culture. J Physiol. 399, 247-266 (1988).
  26. Aizenman, E., et al. Responses mediated by excitatory amino acid receptors in solitary retinal ganglion cells from rat. J Physiol. 396, 75-91 (1988).
  27. Taschenberger, H., et al. Synaptic current kinetics in a solely AMPA-receptor-operated glutamatergic synapse formed by rat retinal ganglion neurons. J Neurophysiol. 74, 1123-1136 (1995).
  28. Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
  29. Jakobs, T. C., et al. Expression of mRNA for glutamate receptor subunits distinguishes the major classes of retinal neurons, but is less specific for individual cell types. Mol Vis. 13, 933-948 (2007).
  30. Margolis, D. J., Detwiler, P. B. Different mechanisms generate maintained activity in ON and OFF retinal ganglion cells. J NeurosciI. 27, 5994-6005 (2007).
  31. Margolis, D. J., et al. Dendritic calcium signaling in ON and OFF mouse retinal ganglion cells. J Neurosci. 30, 7127-7138 (2010).
  32. Baldridge, W. H. Optical recordings of the effects of cholinergic ligands on neurons in the ganglion cell layer of mammalian retina. J Neurosci. 16, 5060-5072 (1996).
  33. Hartwick, A. T., et al. Functional assessment of glutamate clearance mechanisms in a chronic rat glaucoma model using retinal ganglion cell calcium imaging. J Neurochem. 94, 794-807 (2005).
  34. Badea, T. C., Nathans, J. Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter. J Comp Neurol. 480, 331-351 (2004).
  35. Huberman, A. D., et al. Architecture and activity-mediated refinement of axonal projections from a mosaic of genetically identified retinal ganglion cells. Neuron. 59, 425-438 (2008).
  36. Kim, I. J., et al. Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion. Nature. 452, 478-482 (2008).
  37. Munch, T. A., et al. Approach sensitivity in the retina processed by a multifunctional neural circuit. Nat Neurosci. 12, 1308-1316 (2009).
  38. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).

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Neuroscience Ausgabe 92 Immunhistochemie Antikörper Fluo-4 Calcium Imaging Ganglienzellen Netzhaut Ratte
Immunhistochemischen und Calcium Imaging Methoden in der Wholemount Rat Retina
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Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N.… More

Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Pérez De Sevilla Müller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J. Vis. Exp. (92), e51396, doi:10.3791/51396 (2014).

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