Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Immunohistokemiska och Kalcium avbildningstekniker i Wholemount Rat Retina

Published: October 13, 2014 doi: 10.3791/51396
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1,2,4, 1
1Department of Neurobiology, University of California, Los Angeles, 2Veterans Administration Greater Los Angeles Healthcare System, 3Departments of Physiology & Biophysics and Ophthalmology & Visual Sciences, Dalhousie University, 4Departments of Neurobiology and Medicine, Jules Stein Eye Institute, CURE-Digestive Diseases Research Center, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

Immunohistokemi-protokoll används för att studera lokalisering av ett specifikt protein i näthinnan. Kalcium avbildningstekniker används för att studera kalcium dynamiken i retinala ganglionceller och deras axoner.

Abstract

I detta dokument beskriver vi de verktyg, reagens och de praktiska åtgärder som behövs för: 1) utarbetandet av ett wholemount näthinnor för immunohistokemi och, 2) kalcium avbildning för studier av spänningen gated kalciumkanal (VGCC) förmedlad kalciumsignalering i retinal ganglionceller. Kalciumavbildningsmetod beskriver vi kringgår frågor om icke-specifik belastning av fördrivna amakrina celler i ganglion cellager.

Introduction

Näthinneganglieceller (RGC) uttrycker L-, N, P / Q och T-typ VGCC bestämd genom farmakologisk blockad av dessa komponenter i hela cellen Kalifornien Channel nuvarande 1,2. VGCC är transmulti proteiner som är involverade i transmittorfrisättning, gentranskription, cellreglering och synaptisk plasticitet 3,4,5. Funktionella VGCCs består av minst tre olika klasser av subenheter: stora, trans α 1 porbildande subenheter som etablerar kanalens biofysiska och farmakologiska egenskaper, främst extracellulärt hjälp α 2 δ subenheter och intracellulära β subenheter. De senare två formulär heteromera komplex med olika α 1 subenheter och ändra grind kinetik och trafficking av kanalerna till plasmamembranet 6.

Under de senaste decennierna har många tekniker använts för att studera protein Expression, såsom immunohistokemi, enzyme-linked immunosorbent assay, Western-analys och flödescytometri. Dessa tekniker kräver användning av specifika antikroppar för detektion av ett givet protein av intresse och ger kraftfulla verktyg för lokalisering och distribution av specifika proteiner i olika vävnader. Tekniker som används för att detektera och kvantifiera mRNA-expressionsnivåer av ett särskilt protein, såsom norra blot-analys, RT-PCR, realtids kvantitativ RT-PCR, in situ hybridisering, cDNA microarrays och ribonukleas skyddsanalys ger ett alternativt tillvägagångssätt när antikroppar inte är lätt tillgängliga eller om uttrycksnivåer av ett särskilt protein är låga 7. Emellertid en begränsning för användningen av sådana molekylära tekniker är den erforderliga identifieringen av gensekvensen.

För att lokalisera proteiner i näthinnan, kan immunohistokemi utföras på wholemount näthinnor. På grund av tillgängligheten till RGC, wholemountpreparatet ger en utmärkt plattform för att studera lokalisering av specifika proteiner till RGC somata och deras axoner.

Förutom deras lokalisering, kan vissa funktionella egenskaper hos de VGCCs i RGC demonstreras genom användning av kalciumavbildningstekniker. Vi beskriver en kalciumbildprotokoll för att selektivt märka RGC med en kalciumindikatorfärg för att mäta intracellulära kalcium dynamik. Bidraget från olika VGCCs till kalciumsignal i olika cellulära fack kan isoleras med användning av subtypspecifik Ca-kanalblockerare.

Kanske en av de mest positiva aspekterna av kalciumbildteknik som beskrivs här är förmågan att samtidigt och oberoende spela in från flera RGC och deras axoner. Även om många fysiologiska tekniker, såsom hel cell patch clamp inspelning, ger höga tidsupplösning inspelningar av membran strömmar, det somatiska eller axonal källa these strömmar inspelade kan inte diskrimineras och inspelningar kan endast göras från en enda neuron i taget. Multielektrodtyp arrayer (MEA) är samtidigt kunna spela in spikar från många celler, men kan varken upptäcka eller diskriminera aktivering av exempelvis olika undertyper av kalciumkanaler. MEAS preferentiellt spela in från celler som är lokaliserade i omedelbar närhet till en given elektrod 8 och spela in från celler som genererar stora spikar 9. Optiska avbildningsmetoder ger en alternativ strategi för att göra det möjligt för de samtidiga och oberoende inspelningar av hela populationer av celler som kan integreras med den information som erhållits från en enda cell mikroelektrod och patch clamp inspelning och MEA inspelning. Även om kalciumavbildningstekniker som beskrivs här användes för att studera kalcium dynamik RGC, kan patch klämma och MEA också användas parallellt för att ytterligare belysa jonströmmarnas och standardtillsatser egenskaper RGC.

10, vårt mål var att använda en lastteknik som selektivt märker RGC med en syntetisk kalciumindikatorfärgämne i en wholemount beredning. Även syntetiska kalciumindikatorfärger ger en utmärkt plattform för att studera intracellulära kalcium dynamik, dess utbredda användningen hindrats av oförmågan att effektivt ladda specifika populationer av nervceller inom ett givet nät. Många tekniker såsom bulk lastning 11 och elektro 8,12 har utförts för att ladda hela samlingar av celler, men sådana tekniker inte diskriminera mellan specifika celltyper. Genetiskt kodade kalcium indikatorer ger möjlighet att selektivt märka specifika populationer av celler, men sådana metoder kräver generering av transgena djur 13. Vår teknik beskriver en metod att selektivt märka RGC i wholemount preparatet via synnerven stubbe injektion av en kalciumindikatorfärg.

Sammantaget, de strukturella och fysiologiska metoder som beskrivs i denna artikel ger en plattform för att studera lokalisering och bidrag VGCCs till kalciumsignalen i RGC och deras axoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment utfördes i enlighet med riktlinjerna för välfärd försöksdjur som utfärdats av US Public Health Service Policy för Human Care och användning av försöksdjur och University of California-Los Angeles (UCLA) Djurforskningskommittén. Manliga och kvinnliga vuxna Sprague-Dawley (Charles River Lab, Wilmington, MA) i åldern 3-5 veckor användes.

1 Animaliska och Tissue Förberedelse för Wholemount Retina och immunohistokemi protokoll

  1. Förbered följande material och verktyg: En dissekera mikroskop, 2 pincett med mycket tunna spetsar, saxar, cellulosafilterpapper, plastpipetten och ett objektglas.
  2. Euthanize råttan i en sluten kammare med djupt anesthetizing djuret med 1-3% isofluran följt av dekapitering med en giljotin. Ta ögonen med ett par iris sax och lägg i en petriskål med den extracellulära lösningen. Viloläge A, Ames MeDIUM eller fysiologiska lösningar rekommenderas.
  3. [Ej steget om återfyllning av RGC med Fluo-4 önskas]. Utför Fluo-4 märkning som beskrivs i steg 2,3-2,4.
  4. Använda dissekera mikroskop (ljusintensitet: 1.6 x 10 8 fotoner / mm 2 ⋅sec), ta bort hornhinnan genom att skära av den främre delen av ögat bollen. Ta av lins och glas från den inre näthinnan ytan med pincett. För att ta bort glaskroppen, stabilisera ögongloben genom att hålla sklera stadigt med ena forcep. Dra försiktigt glaskroppen basen mot mitten av näthinnan med den andra forcep. Beredningen i detta skede kallas ögonmusslan, som används för kryosnitt. Mer detaljer om kryosnitt finns i referenser 14,15.
  5. Ta näthinnan från ögonmusslan. Sedan gör fyra snitt så att näthinnan att ligga platt. Montera försiktigt näthinnan på ett objektglas med ljusmätare lagret upp. Lägg en droppe av lösningen på näthinnan och sätta cellulose filterpapper på näthinnan. När näthinnan fäster på filterpapper, placera näthinnan tillbaka i lösning. Om det behövs, platta näthinnan med en borste eller pincett.
  6. Placera wholemounted näthinnor i 4% PFA i 10-15 min för fixering.
  7. Tvätta wholemounted näthinnor tre gånger under 30 min i 0,1 M fosfatbuffert (PB), pH 7,4. Blockera näthinnorna med 5% normalt getserum eller åsna serum i 0,1 PB innehållande 0,3% Triton-X 100 och 0,1% NaN3 vid 4 ° C över natten. Vi rekommenderar en slutlig volym på 500 l för alla steg för att spara blockerande lösningar och antikroppar.
  8. Nästa dag, inkubera retinae wholemounts med de primära antikropps 5-7 dagar vid 4 ° C. Optimala späd måste bestämmas av användaren.
  9. Tvätta näthinnor 3 x 30 min i PB 0,1 M och inkubera över natten vid 4 ° C i motsvarande fluorofor-konjugerad sekundär antikropp som är riktad mot de arter av den primära antikroppen (koncentration 1: 1000).
  10. Efter tre sista tvättar av 30 minuter vardera med PB, montera näthinnor i monteringsmedel. Täta täckglas med nagellack för långvarig lagring. Förvara proverna vid 4 ° C och skydda mot ljus.

2 Märkning av ganglion celler och Axoner i Rat Wholemount näthinnor med kalcium Indikator Dye

  1. Bered 1000 ml däggdjurs Ringers innehållande (i mM) 125 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, 1,25 NaH 2 PO 4, 1 MgCl2, 25 NaHCOs 3 och 10 glukos bubblas med 95% O2 / 5% CO ­ 2.
  2. Utför dissekering enligt beskrivningen i steg 1,2-1,4.
  3. För att ladda näthinneganglieceller (RGC) och deras axoner med kalciumindikatorfärg, injicera 0,5 l av Fluo-4 Pentakaliumtrifosfat salt (40 mM lager i H2O) i synnerven stubben ca 1 mm posteriort ögongloben med hjälp av en spruta . För att mäta dynamiska ökningar av gangliecell [Ca2 + i en indikator med hög affinitet, som Fluo-4 med sin Kd på 345 nM, är optimal. Fluo-4 erbjuder den ytterligare fördelen att de har en mycket hög kvanteffektivitet vilket resulterar i en ökning av> 100-faldig för utsläpp när det är bundet till kalcium.
  4. Placera ögonmusslan i däggdjurs-Ringer-bubblades med 95% O2 / 5% CO ­ 2 för 1 h vid rumstemperatur i mörker.

3 Kalcium Imaging Protokoll för näthinneganglieceller och Axoner.

  1. Ta bort öga, lins och glaskropp som beskrivs i steg 1.1-1.4. Isolera näthinnan från ögonmusslan och dela i kvadranter. Montera en kvadrant gangliecell sidan upp på en glasskiva och använda en harpa slice rutnät för att stabilisera den. Behåll de andra bitarna mörk-anpassad i däggdjurs-Ringer-bubblades med 95% O2 / 5% CO ­ 2 på is för senare användning.
  2. Superfuse inspelningen kammaren med däggdjurs Ringers lösning ochhålla lösningen kontinuerligt bubblande med 95% O 2/5% CO2.
  3. Bild vävnaden i mikroskop. Utföra experiment vid rumstemperatur (~ 23 ° C) eller uppnå fysiologiska temperaturer genom att värma det stadium, upphetta vattenbad under provet eller applicera varm luft på ytan av provet.
    Observera: Det är viktigt att notera att många cellulära funktioner regleras av temperaturen, som spelar en nyckelroll i att upprätthålla intracellulär homeostas 16. Emellertid kan införande av uppvärmningen åtgärder öka graden av fotoblekning, indunstning av mediet och fokus avdrift orsakad av termisk expansion 17. Användning av rumstemperatur minskar intracellulär uppdelning av Fluo-4 18.
  4. Utför en kontroll av två parade höga K + pulser i frånvaro av läkemedel. Depolarize RGC och RGC axoner genom att höja [K +] o från 3 mm till 60 mm för 33 sek under varje puls för att aktiveraVGCCs med en åtta kanals gravitationsdrivna superfusion systemet. Minska Na + med 57 mM för att upprätthålla isosmolarity i förhöjda K +-lösning.
  5. Utvärdering av bidraget av olika VGCCs kalciumsignalen med hjälp av allmänna eller särskilda Ca kanalblockerare. Till exempel minskningen av kalciumsignal efter administrering av en icke-specifik kalciumkanalblockerare, kobolt, tillhandahålls en semikvantitativ mätning av bidraget av de VGCCs till den höga K + -evoked kalciumsignal.
  6. Skaffa fluorescensintensitetsvärdena genom att placera ett område av intresse (ROI) runt RGC av intresse (Figur 2).
  7. Normalisera förändringen i fluorescensintensiteten som produceras av andra höga K + topp till förändringen som produceras av den första höga K + topp. Då, för testning av specifika kalciumantagonister, tillämpa droger först under andra höga K + puls av ett par och normalisera denna topp motdet första toppvärdet. För att mäta effekten av läkemedlet på den höga K + topp, dividera amplituden av det andra K + topp genom den i den första. Analys bör utföras på dessa värden i förhållande till sina matchande kontroller härrör från parade hög K + toppar uppmätta i frånvaro av läkemedlet.
  8. Hämta bilder på 5 sek intervall. För att undvika fotoblekning, hålla laserexcitation så lite som möjligt. Tillhandahålla excitation av 488 nm-linjen av argonlaser, medan fotomultiplikatorröret samlar den fluorescerande emissionen genom en 505 nm LP filter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immunomärkning med specifika antikroppar ger en plattform för att studera lokalisering av speciella proteiner av intresse i näthinnan och kalciumavbildningsteknik gör det möjligt att studera bidraget från VGCCs till kalcium dynamiken i näthinneganglieceller och deras axoner.

Genom att använda en antikropp mot gangliecell protein RBPMS (RNA-bindande protein med flera splitsning) som selektivt etiketter RGC 19, kunde vi visa att Fluo-4 märkningen är begränsad till ganglion celler (Figur 1). Stump-injektionen inte leder till märkning av alla ganglieceller som kan förväntas från denna teknik.

En kanin polyklonal antikropp genererades mot N-terminalen av den RBPMS polypeptiden (RBPMS 4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, av en kommersiell leverantör (Tabell 1). RBPMS är mycket konserverad bland däggdjur och polypeptidsekvensen som används för immunisering är identiska i mus, råtta, apa och människa (NCBI Protein Bank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein ). Kaninsera samlades efter immunisering och affinitetsrenades med hjälp av en RBPMS polypeptid affinitetskolonn. Den affinitetsrenade antikroppen visades immunostain ganglieceller i mus och råtta näthinnan. För att utvärdera specificiteten hos RBPMS immunfärgning, var en förabsorption kontroll utförs med kaninantikropp. I korthet var den RBPMS antikropp utspädd i 0,1 M PB innehållande 0,5% Triton X-100 och blandades med RBPMS polypeptid vid en slutlig koncentration av 1 | ig / ml under 2 h vid RT. Ingen RBPMS immunfärgning var närvarande i vävnadssnitt inkuberade med förabsorberades kaninantikroppar att RBPMS och behandlas av standardiserade immunhistokemiska tekniker.

s.jpg "width =" 600 "/>
Figur 1: Post-hoc immunfärgning med antikroppar mot de RGC protein RBPMS (röd) för att visa Fluo-4 (grön) lokalisering till gangliecellerna En Alexa 568 get anti-kanin sekundär antikropp användes.. Skala bar: 20 mm.

Kalciumavbildningstekniker används för att studera bidraget av VGCCs till kalciumsignal i RGC och deras axoner. Fluorescerande intensitetsvärden förvärvades genom att placera ROI på RGC av intresse (Figur 2).

Figur 2
Figur 2: För att förvärva fluorescerande intensitetsvärden, var ROI placeras på gangliecell somata och / eller axoner Skala bar:. 50 mm.

Fluo-4 Pentakaliumtrifosfat salt användes för att märka RGC och deras axoner (Figur 3).


Figur 3: VGCC subtyper som bidrar till kalciumsignalering i gangliecell somata och deras axoner. (A) Confocal bild av en wholemount näthinnan på basnivåer. RGC och RGC axoner kan ses märkas med fluo-4. (B) Fluorescerande signaler från en enda RGC somata visar ökningen i medelfluorescensintensiteten som framkallas av parade pulser av hög K + (60 mM) bad lösning och den efterföljande minskning i fluorescens i närvaro av kobolt under den andra pulsen. Skala bar för A: 20 mm.

Den Zeiss LM5 Pascal-systemet var inställt på att ta bilder med en bildhastighet på 5 sek och varje hel bild skanning tog 1,57 sek vid de inställningar som används. En samling område på 318 nm x 318 nm ingick i det skannade området av 512 x 512 pixels ger en yta på 0,385 nm 2 per pixel. Dessa inställningar kan variera beroende på upplösning önskas. Systemet använder en 25 mW argonlaser för 488 nm excitation. Vi använde denna linje på 3% effekt. Mättnad minimerades genom att först välja den lägsta koncentrationen av kalciumindikatorfärg som gav de robusta svar på depolariserande stimulans och sedan genom att minska utgångsförstärkning. Reduktion av lasereffekt bidrog till att undvika blekning. Indikator koncentration mättes inte. Kalibrering av ej ratiometrisk avbildning är möjlig med hjälp av kalciumjonoforer, men återfyllningstekniken kan arbeta med ratiometriska färgämnen samt. För att bestämma den optimala indikatorkoncentrationen, jämförde vi depolarisation-framkallade förändringen i fluorescens med stump-injicerade koncentrationer av Fluo-4 som sträcker sig från 1 till 40 mM. Cirkulära och ovala ROI drogs runt RGC och deras axoner, respektive som uppvisade stabila fluorescensintensiteten. RGC och axoner som glidit ut urfokus på grund av rörelse som orsakas av superfusion inte valt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denna artikel har vi beskrivit två olika tekniker: 1) Immunohistokemi att visa Fluo-4 lokalisering till ganglion celler i näthinnan wholemounts, och 2) Kalcium avbildning att analysera kalcium dynamik i näthinneganglieceller och deras axoner.

Immunohistokemi med användning wholemounts har använts för att avslöja lokaliseringen av proteiner i gnagare näthinnan 20-23. Men det finns några begränsningar. Kvaliteten på färgning är starkt beroende på förmågan hos antikroppen att känna igen sin respektive antigen och dess förmåga att penetrera näthinnevävnad till den speciella skikt av intresse. Dessa frågor kan förbättras genom ökning av inkubationstiden i den primära antikroppen med upp till sju dagar, öka koncentrationen av Triton-X och / eller inkubering av näthinnan utan filterpapper för att tillåta diffusion av antikroppen genom gangliecell skiktet och fotoreceptorerna. En annan begränsning är de duratipå och koncentrationen av fixering. Vissa antikroppar fungerar bättre när vävnaden är fast i en timme, medan andra antikroppar kräver en kortare räntebindningstid. Likaså medan vissa antikroppar fungerar bäst i 4% PFA fixering, andra arbetar bättre vid reducerade koncentrationer. Vi rekommenderar att användaren bestämma den optimala varaktigheten och koncentrationen av fixering, varaktigheten av inkubationen, koncentrationen av Triton-X, såväl som koncentrationen av den primära antikroppen för optimala resultat.

Kalcium avbildning användes för att studera kalciumdynamiken i näthinneganglieceller och deras axoner. Superfusion av VGCC blockerande medel tillät bedömning av den relativa blockerande effekten av läkemedlen och förekomsten av olika Ca-kanalundertyper. I händelse av att RGC och axoner inte svarar på hög K +, försöka minska koncentrationen av kalciumindikatorfärg, så höga koncentrationer kan leda till mättnad. Ofullständigt avlägsnande av glaskroppenkan också fungera som ett hinder, förebygga hög K + från att nå RGC och deras axoner. Dessutom kan underlåtenhet att korrekt montera harpa ovanpå näthinnan orsaka rörelse, vilket resulterar i en oförmåga att förvärva fluorescensintensitetsvärden. Om näthinnan fortsätter att röra sig försiktigt bort harpa, torka området kring näthinnan och åter montera harpan genom att lägga till mer fett på dess omkrets. Fullständigt avlägsnande av glaskroppen och minimal rörelse av retinal wholemount är avgörande för framgången för experimentet.

Agonister av de kalcium permeabla glutamatreceptorer som uttrycks av RGC, såsom N-metyl-D-aspartat (NMDA), 24,25 α-amino-3-hydroxi-5-metylisoxazol-4-propionat (AMPA) receptorer och kainat-typ jonotropiska glutamatreceptorer 26-29, kan användas för att framkalla direkt inmatning av kalcium samt ge en depolariserande stimulans som aktiverar VGCCs. Utnyttjande av sådana agonister kan leda till en ickeEnhetliga gensvar på grund av differentiell expression av glutamatreceptorsubtyperna till de olika typerna av RGC. Två-foton mikroskopi kan också användas för att undersöka ljus framkallade kalciumsignaler i RGC 30 och deras dendriter 31.

Selektiv märkning av RGC uppnåddes på grund av membran impermeant egenskaperna för Fluo-4 Pentakaliumtrifosfat saltkalciumindikatorfärg. Dextran-konjugerad kalciumindikatorfärgämnen har också använts för att selektivt märka RGC och deras axoner via intraretinal injektioner i kanin 32 och rått-33. I båda studierna var selektiv märkning av RGC och deras axoner uppnås via intraretinal injektioner av dextran-konjugerade kalciumindikatorfärgämne, följt av en 2 timmars inkubering i kanin 32 eller en 7 timmars inkubering i råtta 33. Trots att tillhandahålla en lämplig inkubationstid för att säkerställa en enhetlig märkning i näthinnan, sådana metoder leder till ökad märkning av RGC och derasaxoner närmast injektionsstället jämfört med gles märkning i regioner distalt till injektionsstället. Som diskuterats i Baldrige (1996), icke enhetlig märkning vid injektionsstället har tillskrivits diffusion märkning av somat som ett resultat av färgämnesupptag vid den exponerade (cut) dendrit, medan märkning distala regioner beror sannolikt på retrograd transport från upptag av färgämnet vid den exponerade Axon 32. Vår teknik ger förbättrade metoder för att öka enhetlig märkning av RGC och deras axoner och att minimera den nödvändiga inkubationstiden.

Föreliggande färgämnesladdningsmetod som ger en alternativ strategi för konventionella tekniker, såsom bulklastning och elektroporering som resulterar i icke-specifik belastning av fördrivna amakrina celler i gangliecell skiktet. Med tillgången av transgena möss som uttrycker tdTomato eller EGFP under kontroll av promotorer som är i specifika ganglioncellpopulationer 34-38, framtida applications av denna teknik kan innefatta kalcium imaging studier av specifika näthinnegangliecell subtyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga upplysningar.

Acknowledgments

Vi tackar Dr S. Stella och Helen Vuong för bidrag till kalcium imaging-protokollet. Vi tackar Dr K. Ark för filma intervjuscener. Vi tackar Dr Arlene Hirano för hennes synpunkter på manuskriptet. Denna forskning och utvecklingsprojekt genomfördes av författarna vid David Geffen School of Medicine vid UCLA och är möjligt genom ett kontrakt avtal som tilldelades och administreras av US Army Medical Research & Materielverk (USAMRMC) och telemedicin och Advanced Technology Research Center (TATRC), vid Fort Detrick, MD enligt Kontraktsnummer: W81XWH-10-2-0077. Stöd för dessa studier kom också från NIH EY04067 och VA Merit Review (NB). NCB är en VA Career Research Scientist.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Straight scissors WPI 14124-G dissecting tools
Straight Forceps WPI 501985 dissecting tools
curved iris scissors WPI 504487 dissecting tools
Cellulose filter paper Millipore HABP04700
Hibernate A Invitrogen A12475-01 Media
Vectashield Vector H-1000 Mounting Media for Fluorescence
Fluo-4 pentapotassium Invitrogen F-14200
Isoflurane Abbott Laboratories 05260-05 anesthesia
Microscope slide Fisher Scientific 22-178-277
Zeiss LSM 5 Pascal microscope Zeiss
Axioplan 40X (NA 0.8) objective lens Zeiss
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Molecular Probes A-11034 Secondary antibody
RBPMS ProSci, Poway, CA A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guenther, E., et al. Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat. Brain Res. 633, 223-235 (1994).
  2. Farrell, S. R., et al. Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ganglion cells mediated by somatostatin receptor subtype 4. J Neurophysiol. 104, 1347-1354 (2010).
  3. Caterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 521-555 (2000).
  4. Berridge, M. J., et al. Calcium--a life and death signal. Nature. 395, 645-648 (1998).
  5. Berridge, M. J. Calcium microdomains Organization and function. Cell Calcium. 40, 405-412 (2006).
  6. Dolphin, A. C. Calcium channel diversity multiple roles of calcium channel subunits. Curr Opin Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
  7. Rottman, J. B. The ribonuclease protection assay a powerful tool for the veterinary pathologist. Vet Pathol. 39, 2-9 (2002).
  8. Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
  9. Segev, R., et al. Recording spikes from a large fraction of the ganglion cells in a retinal patch. Nat Neurosci. 7, 1154-1161 (2004).
  10. Jeon, C. J., et al. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18, 8936-8946 (1998).
  11. Blankenship, A. G., et al. Synaptic and extrasynaptic factors governing glutamatergic retinal waves. Neuron. 62, 230-241 (2009).
  12. Daniels, B. A., Baldridge, W. H. d-Serine enhancement of NMDA receptor-mediated calcium increases in rat retinal ganglion cells. J Neurochem. 112, 1180-1189 (2010).
  13. Weitz, A. C., et al. Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators. J Neurophysiol. 109, 1979-1988 (2013).
  14. Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Expression of voltage-gated calcium channel α(2)δ(4) subunits in the mouse and rat retina. J Comp Neurol. 521 (2), 2486-2501 (2013).
  15. Hirano, A. A., et al. SNAP25 expression in mammalian retinal horizontal cells. J Comp Neurol. 519, 972-988 (2011).
  16. Berridge, M. J., et al. Calcium signalling dynamics, homeostasis and remodeling. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-529 (2003).
  17. Dailey, M. E., et al. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harb ProtocI. , 373-379 (2011).
  18. Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring intracellular calcium ion dynamics in hair cell populations with Fluo-4. AM. PLoS One. 7, e51874 (2012).
  19. Kwong, J. M. K., et al. RNA binding protein with multiple splicing A new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1052-1058 (2010).
  20. Pérez deSevilla Müller, L., et al. Displaced amacrine cells of the mouse retina. J Comp Neurol. 505, 177-189 (2007).
  21. Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Tracer coupling of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells to amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 518, 4813-4824 (2010).
  22. Raymond, I. D., et al. Cyan fluorescent protein expression in ganglion and amacrine cells in a thy1-CFP transgenic mouse retina. Mol Vis. 14, 1559-1574 (2008).
  23. Raymond, I. D., et al. A Thy1-CFP DBA/2J mouse line with cyan fluorescent protein expression in retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 26, 453-465 (2009).
  24. Mayer, M. L., Westbrook, G. L. Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurones. J Physiol. 394, 501-527 (1987).
  25. Ascher, P., Nowak, L. The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurons in culture. J Physiol. 399, 247-266 (1988).
  26. Aizenman, E., et al. Responses mediated by excitatory amino acid receptors in solitary retinal ganglion cells from rat. J Physiol. 396, 75-91 (1988).
  27. Taschenberger, H., et al. Synaptic current kinetics in a solely AMPA-receptor-operated glutamatergic synapse formed by rat retinal ganglion neurons. J Neurophysiol. 74, 1123-1136 (1995).
  28. Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
  29. Jakobs, T. C., et al. Expression of mRNA for glutamate receptor subunits distinguishes the major classes of retinal neurons, but is less specific for individual cell types. Mol Vis. 13, 933-948 (2007).
  30. Margolis, D. J., Detwiler, P. B. Different mechanisms generate maintained activity in ON and OFF retinal ganglion cells. J NeurosciI. 27, 5994-6005 (2007).
  31. Margolis, D. J., et al. Dendritic calcium signaling in ON and OFF mouse retinal ganglion cells. J Neurosci. 30, 7127-7138 (2010).
  32. Baldridge, W. H. Optical recordings of the effects of cholinergic ligands on neurons in the ganglion cell layer of mammalian retina. J Neurosci. 16, 5060-5072 (1996).
  33. Hartwick, A. T., et al. Functional assessment of glutamate clearance mechanisms in a chronic rat glaucoma model using retinal ganglion cell calcium imaging. J Neurochem. 94, 794-807 (2005).
  34. Badea, T. C., Nathans, J. Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter. J Comp Neurol. 480, 331-351 (2004).
  35. Huberman, A. D., et al. Architecture and activity-mediated refinement of axonal projections from a mosaic of genetically identified retinal ganglion cells. Neuron. 59, 425-438 (2008).
  36. Kim, I. J., et al. Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion. Nature. 452, 478-482 (2008).
  37. Munch, T. A., et al. Approach sensitivity in the retina processed by a multifunctional neural circuit. Nat Neurosci. 12, 1308-1316 (2009).
  38. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).

Tags

Neuroscience immunohistokemi antikropp fluo-4 kalcium avbildning ganglieceller näthinna råtta
Immunohistokemiska och Kalcium avbildningstekniker i Wholemount Rat Retina
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N.… More

Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Pérez De Sevilla Müller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J. Vis. Exp. (92), e51396, doi:10.3791/51396 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter