Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Wholemount चूहा रेटिना में immunohistochemical और कैल्शियम इमेजिंग तरीकों

Published: October 13, 2014 doi: 10.3791/51396
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1,2,4, 1
1Department of Neurobiology, University of California, Los Angeles, 2Veterans Administration Greater Los Angeles Healthcare System, 3Departments of Physiology & Biophysics and Ophthalmology & Visual Sciences, Dalhousie University, 4Departments of Neurobiology and Medicine, Jules Stein Eye Institute, CURE-Digestive Diseases Research Center, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

Immunohistochemistry प्रोटोकॉल रेटिना में एक विशिष्ट प्रोटीन का स्थानीयकरण अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है. कैल्शियम इमेजिंग तकनीक रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं और उनके axons में कैल्शियम गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए कार्यरत हैं.

Abstract

इस पत्र में हम उपकरण, अभिकर्मकों, और के लिए आवश्यक हैं कि व्यावहारिक कदम वर्णन: immunohistochemistry के लिए wholemount retinas की 1) सफल तैयारी और, रेटिना में कैल्शियम संकेतन मध्यस्थता वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल (VGCC) के अध्ययन के लिए 2) कैल्शियम इमेजिंग नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं. कैल्शियम इमेजिंग विधि हम नाड़ीग्रन्थि सेल परत में विस्थापित amacrine कोशिकाओं की गैर विशिष्ट लोडिंग के विषय में गतिरोध उत्पन्न मुद्दों का वर्णन.

Introduction

वर्तमान 1,2 चैनल Ca पूरे सेल के इन घटकों के औषधीय नाकाबंदी के माध्यम से निर्धारित रूप में रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (RGCs) एल, एन, पी / क्यू और टी प्रकार VGCC व्यक्त करते हैं. VGCC ट्रांसमीटर रिहाई, जीन प्रतिलेखन, सेल विनियमन और synaptic plasticity 3,4,5 में शामिल कर रहे हैं कि transmembrane multimeric प्रोटीन होते हैं. 1 ताकना चैनल के biophysical और औषधीय गुणों, मुख्य रूप से बाह्य सहायक α 2 δ सब यूनिटों और intracellular β सब यूनिटों की स्थापना कि सब यूनिटों के गठन α बड़े, transmembrane: कार्यात्मक VGCCs सब यूनिटों के कम से कम तीन अलग वर्गों से बना रहे हैं. अलग α 1 सब यूनिटों के साथ बाद के दो फार्म heteromeric परिसरों और प्लाज्मा झिल्ली से 6 चैनलों के gating कैनेटीक्स और तस्करी में परिवर्तन.

हाल के दशकों में, कई तकनीकों प्रोटीन expre अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया हैऐसे immunohistochemistry, एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख, पश्चिमी विश्लेषण और प्रवाह cytometry के रूप में ssion,. इन तकनीकों में रुचि का एक दिया प्रोटीन का पता लगाने के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के उपयोग की आवश्यकता है और विभिन्न ऊतकों में स्थानीयकरण और विशिष्ट प्रोटीन के वितरण के लिए शक्तिशाली उपकरण प्रदान करते हैं. एंटीबॉडी आसानी से नहीं कर रहे हैं जब इस तरह के उत्तरी धब्बा विश्लेषण के रूप में एक विशेष प्रोटीन का mRNA अभिव्यक्ति के स्तर का पता लगाने और यों इस्तेमाल की तकनीक, आरटी पीसीआर, वास्तविक समय मात्रात्मक आरटी पीसीआर, सीटू संकरण में, सीडीएनए प्रोटीन और ribonuclease संरक्षण परख एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान एक विशेष प्रोटीन की उपलब्ध या तो अभिव्यक्ति के स्तर 7 कम कर रहे हैं. हालांकि, इस तरह के आणविक तकनीक का उपयोग करने के लिए एक सीमा जीन अनुक्रम की आवश्यक पहचान है.

रेटिना में प्रोटीन स्थानीय बनाना, immunohistochemistry wholemount retinas पर प्रदर्शन किया जा सकता है. RGCs की पहुंच के लिए, wholemount कारणतैयारी RGC somata और उनके axons के लिए विशिष्ट प्रोटीन का स्थानीयकरण अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मंच प्रदान करता है.

उनके स्थानीयकरण के अलावा, RGCs में VGCCs के कुछ कार्यात्मक गुण कैल्शियम इमेजिंग तकनीक के उपयोग के माध्यम से प्रदर्शन किया जा सकता है. हम चुनिंदा intracellular कैल्शियम की गतिशीलता को मापने के लिए एक कैल्शियम सूचक डाई के साथ RGCs लेबल करने के लिए एक कैल्शियम इमेजिंग प्रोटोकॉल का वर्णन. विभिन्न सेलुलर डिब्बों में कैल्शियम संकेत के लिए अलग VGCCs का योगदान उप प्रकार विशिष्ट सीए चैनल ब्लॉकर्स के उपयोग के साथ अलग किया जा सकता है.

शायद यहाँ वर्णित कैल्शियम इमेजिंग तकनीक का सबसे अधिक लाभकारी पहलुओं में से एक एक साथ और स्वतंत्र रूप से कई RGCs और उनके axons से रिकॉर्ड करने की क्षमता है. इस तरह पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के रूप में कई शारीरिक तकनीक, उच्च अस्थायी समाधान झिल्ली धाराओं की रिकॉर्डिंग, दैहिक या thes के axonal स्रोत प्रदान करते हैंदर्ज ई धाराओं भेदभाव नहीं किया जा सकता और रिकॉर्डिंग एक बार में केवल एक न्यूरॉन से बनाया जा सकता है. Multielectrode सरणियों (MEAS) एक साथ कई कोशिकाओं से spikes रिकॉर्डिंग करने में सक्षम हैं, लेकिन पता लगा है और न ही की सक्रियता भेदभाव, कैल्शियम चैनल के उदाहरण के लिए, विभिन्न उपप्रकार कर सकते हैं भी नहीं. Preferentially बड़े spikes 9 उत्पन्न कि कोशिकाओं से एक दिया इलेक्ट्रोड 8 और रिकॉर्ड के करीब निकटता में स्थित हैं कि कोशिकाओं से रिकॉर्ड Meas. ऑप्टिकल इमेजिंग तरीकों एकल कक्ष microelectrode और पैच दबाना रिकॉर्डिंग और विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग से प्राप्त जानकारी के साथ एकीकृत किया जा सकता है कि कोशिकाओं की पूरी आबादी का एक साथ और स्वतंत्र रिकॉर्डिंग सक्षम करने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति प्रदान करते हैं. यहाँ वर्णित कैल्शियम इमेजिंग तकनीक RGCs के कैल्शियम गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है, पैच दबाना और Meas भी आगे आयनिक धाराओं और RGCs के spiking गुणों को स्पष्ट करने के लिए समानांतर में इस्तेमाल किया जा सकता है.

10 रेटिना माउस में नाड़ीग्रन्थि सेल परत में neuronal जनसंख्या का लगभग 60% है के बाद से, हमारे लक्ष्य के चुनिंदा एक में एक सिंथेटिक कैल्शियम सूचक डाई के साथ RGCs लेबल है कि एक लोडिंग तकनीक का उपयोग किया गया wholemount तैयारी. सिंथेटिक कैल्शियम सूचक रंजक intracellular कैल्शियम की गतिशीलता के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मंच प्रदान करते हैं, इसके व्यापक उपयोग को प्रभावी ढंग से एक दिया नेटवर्क में न्यूरॉन्स की विशिष्ट आबादी को लोड करने में असमर्थता द्वारा बाधा कर दिया गया है. इस तरह के थोक लोड हो रहा है 11 और electroporation 8,12 के रूप में कई तकनीकों कोशिकाओं की पूरी आबादी, हालांकि, इस तरह की तकनीक विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के बीच भेदभाव नहीं करते लोड करने के लिए प्रदर्शन किया गया है. आनुवांशिक रूप से कैल्शियम संकेतक चुनिंदा कोशिकाओं की विशिष्ट आबादी लेबल करने की क्षमता प्रदान करते हैं इनकोडिंग, हालांकि, इस तरह के तरीकों ट्रांसजेनिक जानवरों की 13 पीढ़ी की आवश्यकता होती है. हमारी तकनीक एक metho का वर्णनडी चुनिंदा एक कैल्शियम सूचक डाई का ऑप्टिक तंत्रिका स्टंप इंजेक्शन के माध्यम से wholemount तैयारी में RGCs लेबल करने के लिए.

साथ में ले ली, इस आलेख में दिए गए संरचनात्मक और शारीरिक तकनीक RGCs और उनके axons में स्थानीयकरण और कैल्शियम संकेत को VGCCs के योगदान का अध्ययन करने के लिए एक मंच प्रदान करते हैं.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी प्रयोगों मानव केयर और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग और कैलिफोर्निया लॉस एंजिल्स विश्वविद्यालय (यूसीएलए) पशु अनुसंधान समिति पर अमेरिका के सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा नीति द्वारा जारी किए गए प्रायोगिक पशुओं के कल्याण के लिए दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया. पुरुष और महिला वयस्क Sprague-Dawley चूहों 3-5 सप्ताह की आयु के बीच (चार्ल्स नदी लैब, विल्मिंगटन, एमए) का इस्तेमाल किया गया.

Wholemount रेटिना और Immunohistochemistry प्रोटोकॉल के लिए 1 पशु और ऊतक तैयारी

  1. एक विदारक माइक्रोस्कोप, बहुत ठीक टिप्स, कैंची, सेल्यूलोज फिल्टर पेपर, प्लास्टिक पिपेट और एक खुर्दबीन स्लाइड के साथ 2 संदंश: निम्नलिखित सामग्री और उपकरण तैयार करें.
  2. गहराई से एक गिलोटिन के साथ कत्ल के द्वारा पीछा 1-3% isoflurane के साथ पशु anesthetizing द्वारा एक बंद कक्ष में चूहा euthanize. कोशिकी समाधान युक्त एक पेट्री डिश में परितारिका कैंची और जगह की एक जोड़ी के साथ आंखों निकालें. एक, एम्स मुझे हाइबरनेटdium या शारीरिक समाधान की सिफारिश की है.
  3. [वैकल्पिक कदम Fluo-4 के साथ RGCs के backfilling वांछित है]. कदम 2.3-2.4 में वर्णित के रूप में Fluo-4 लेबलिंग प्रदर्शन करना.
  4. विदारक माइक्रोस्कोप (प्रकाश की तीव्रता 1.6 x 10 8 फोटॉनों / 2 मिमी ⋅sec) का उपयोग करना, आंख गेंद के सामने बंद काटने से कॉर्निया को हटा दें. संदंश के साथ भीतरी रेटिना सतह से लेंस और शीशे निकालें. शीशे को निकालने के लिए एक forcep के साथ मजबूती से श्वेतपटल धारण करके नेत्रगोलक स्थिर. धीरे अन्य forcep के साथ रेटिना के केंद्र की ओर कांच का आधार छील. इस स्तर पर तैयारी cryosections के लिए प्रयोग किया जाता है जो eyecup, कहा जाता है. Cryosections के बारे में अधिक जानकारी के संदर्भ 14,15 में पाया जा सकता है.
  5. Eyecup से रेटिना निकालें. फिर, चार कटौती रेटिना फ्लैट करना करने की अनुमति देती है. धीरे फोटोरिसेप्टर परत के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड पर रेटिना माउंट. रेटिना का हल की एक बूंद जोड़ें और CE डालरेटिना पर llulose फिल्टर पेपर. रेटिना फिल्टर पेपर के लिए देता है एक बार, वापस समाधान में रेटिना जगह है. यदि आवश्यक हो, एक ब्रश या संदंश के साथ रेटिना समतल.
  6. निर्धारण के लिए 10-15 मिनट के लिए 4% पीएफए ​​में wholemounted retinas रखें.
  7. 0.1 एम फॉस्फेट बफर (पंजाब), 7.4 पीएच में 30 मिनट के लिए wholemounted retinas तीन बार धोएं. 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर 0.3% ट्राइटन एक्स 100 और 0.1% NaN 3 युक्त 0.1 पंजाब में 5% सामान्य बकरी सीरम या गधा सीरम के साथ retinas ब्लॉक. हम अवरुद्ध समाधान और एंटीबॉडी को बचाने के लिए सभी कदम के लिए 500 μl के अंतिम मात्रा सलाह देते हैं.
  8. अगले दिन, 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी 5-7 दिनों के साथ दृष्टिपटल wholemounts सेते हैं. इष्टतम dilutions उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए.
  9. पंजाब 0.1 एम में retinas 3 एक्स 30 मिनट धो लें और प्राथमिक एंटीबॉडी (एकाग्रता 1: 1,000) की प्रजातियों के खिलाफ निर्देशित है कि इसी फ्लोरोफोरे संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी में 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं.
  10. पंजाब के साथ 30 मिनट प्रत्येक के तीन अंतिम washes के बाद, मध्यम बढ़ते में retinas माउंट. लंबे समय तक भंडारण के लिए नेल पॉलिश के साथ coverslips सील. स्टोर नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर और प्रकाश से रक्षा करते हैं.

एक कैल्शियम सूचक डाई के साथ चूहा wholemount Retinas में नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं और axons की 2 लेबल

  1. 95% 2 हे / 5% सीओ के साथ bubbled स्तनधारी घंटी युक्त 125 NaCl, 3 KCl, 2 2 CaCl, 1.25 नाह 2 पीओ 4, 1 2 MgCl, 25 NaHCO 3 (मिमी में) के 1000 मिलीलीटर, और 10 ग्लूकोज की तैयारी ­ 2.
  2. कदम 1.2-1.4 में वर्णित के रूप में विच्छेदन प्रदर्शन.
  3. एक सिरिंज का उपयोग नेत्रगोलक के लिए लगभग 1 मिमी पीछे ऑप्टिक तंत्रिका स्टंप में Fluo-4 pentapotassium नमक (एच 2 ओ में 40 मिमी स्टॉक) के 0.5 μl, एक कैल्शियम सूचक डाई के साथ रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (RGCs) और उनके axons लोड इंजेक्षन . [सीए नाड़ीग्रन्थि सेल में गतिशील बढ़ जाती है को मापने के लिए 2 + मैं ऐसी Fluo-4 345 एनएम का अपने कश्मीर डी के साथ ही उच्च आत्मीयता के साथ एक संकेतक, इष्टतम है. Fluo-4 कैल्शियम के लिए बाध्य जब> 100 गुना की एक उत्सर्जन में वृद्धि में जिसके परिणामस्वरूप एक बहुत ही उच्च मात्रा दक्षता होने के अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है.
  4. स्तनधारी घंटी 95% ओ के साथ bubbled 2/5% सीओ में eyecup रखें ­ 2 अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए.

रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं और axons के लिए 3 कैल्शियम इमेजिंग प्रोटोकॉल.

  1. कदम 1.1-1.4 में वर्णित के रूप में आंख, लेंस और शीशे निकालें. Eyecup से रेटिना अलग और quadrants में विभाजित करते हैं. माउंट एक वृत्त का चतुर्थ भाग नाड़ीग्रन्थि सेल एक गिलास स्लाइड पर पक्ष और इसे स्थिर करने के लिए एक वीणा टुकड़ा ग्रिड का उपयोग करें. काले अनुकूलित अन्य टुकड़े रखें स्तनधारी घंटी 95% ओ के साथ bubbled 2/5% सीओ में ­ बाद में उपयोग के लिए बर्फ पर 2.
  2. स्तनधारी घंटी समाधान के साथ रिकॉर्डिंग कक्ष Superfuse और95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ लगातार बुदबुदाती समाधान रखना.
  3. छवि खुर्दबीन के नीचे ऊतक. कमरे के तापमान (~ 23 डिग्री सेल्सियस) या कम से आचार प्रयोगों, चरण वार्मिंग नमूना के तहत पानी के स्नान हीटिंग या नमूना की सतह को गर्म हवा को लागू करने से शारीरिक तापमान को प्राप्त.
    नोट: यह कई सेलुलर कार्यों intracellular homeostasis 16 को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है जो तापमान, द्वारा विनियमित रहे हैं कि नोट करना महत्वपूर्ण है. हालांकि, वार्मिंग उपायों की शुरूआत, थर्मल विस्तार 17 की वजह से मध्यम और ध्यान बहाव के वाष्पीकरण photobleaching की दर में वृद्धि हो सकती है. कमरे के तापमान का उपयोग Fluo-4 18 के intracellular compartmentalization कम हो जाती है.
  4. दवाओं के अभाव में दो बनती उच्च + K दालों के नियंत्रण कार्य करें. सक्रिय करने के लिए प्रत्येक नाड़ी के दौरान 33 सेकंड के लिए 60 मिमी के लिए 3 मिमी से ओ [+ K] को ऊपर उठाने के द्वारा RGCs और RGC axons बिगाड़नाएक आठ चैनल गुरुत्वाकर्षण संचालित superfusion प्रणाली के साथ VGCCs. ऊंचा + K समाधान में isosmolarity बनाए रखने के लिए 57 मिमी से ना + कम करें.
  5. सामान्य या विशिष्ट सीए चैनल ब्लॉकर्स के उपयोग के साथ कैल्शियम संकेत के लिए अलग VGCCs के योगदान का आकलन करें. उदाहरण के लिए, एक गैर विशिष्ट कैल्शियम चैनल ब्लॉकर, कोबाल्ट के प्रशासन के बाद कैल्शियम संकेत में कमी, उच्च + K -evoked कैल्शियम संकेत को VGCCs के योगदान की एक अर्द्ध मात्रात्मक उपाय प्रदान की है.
  6. (चित्रा 2) ब्याज की RGCs के आसपास ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र रखकर प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों मोल.
  7. पहली उच्च + K शिखर द्वारा उत्पादित परिवर्तन करने के लिए दूसरा उच्च + K शिखर द्वारा उत्पादित प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन सामान्यकरें. फिर, विशिष्ट कैल्शियम चैनल ब्लॉकर्स के परीक्षण के लिए, केवल एक जोड़ी के दूसरे उच्च + K नाड़ी दौरान दवाओं लागू करते हैं और के खिलाफ इस शिखर को सामान्यपहली शिखर मूल्य. उच्च कश्मीर + चोटी पर दवा के असर को मापने के लिए, पहले के उस ने दूसरा कश्मीर + चोटी के आयाम विभाजित करते हैं. विश्लेषण दवा के अभाव में मापा बनती उच्च + K चोटियों से व्युत्पन्न उनके मिलान नियंत्रण के संबंध में इन मूल्यों पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
  8. 5 सेकंड के अंतराल पर छवियों मोल. फोटो विरंजन से बचने के लिए जितना संभव हो कम लेजर उत्तेजना रखना. Photomultiplier ट्यूब एक 505 एनएम एल.पी. फिल्टर के माध्यम से फ्लोरोसेंट उत्सर्जन को जमा करता है, जबकि आर्गन लेजर के 488 एनएम लाइन द्वारा उत्तेजना प्रदान करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ immunolabeling रेटिना और कैल्शियम इमेजिंग तकनीक में ब्याज की विशेष प्रोटीन का स्थानीयकरण अध्ययन करने के लिए एक मंच प्रदान करता है रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं और उनके axons में कैल्शियम की गतिशीलता को VGCCs के योगदान का अध्ययन परमिट.

नाड़ीग्रन्थि सेल प्रोटीन RBPMS के खिलाफ चुनिंदा RGCs 19 लेबल कि (एकाधिक splicing के साथ शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन) एक एंटीबॉडी का उपयोग करके, हम Fluo-4 लेबलिंग नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (चित्रा 1) तक सीमित है कि दिखाने के लिए सक्षम थे. स्टंप इंजेक्शन इस तकनीक से अनुमान किया जा सकता है के रूप में सभी नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं की लेबलिंग के लिए नेतृत्व नहीं करता है.

एक खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी एक वाणिज्यिक विक्रेता (1 टेबल) द्वारा, RBPMS पॉलीपेप्टाइड (RBPMS 4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR के एन टर्मिनस के खिलाफ तैयार की गई थी. RBPMS अत्यधिक स्तनधारियों में संरक्षित है और पॉलीपेप्टाइड अनुक्रम का इस्तेमाल किया टीकाकरण के लिए माउस, चूहा, बंदर और मानव (एन सी बी आई प्रोटीन बैंक में समान है http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein ). खरगोश सीरा एक RBPMS पॉलीपेप्टाइड आत्मीयता स्तंभ का उपयोग कर शुद्ध टीकाकरण और आत्मीयता निम्नलिखित एकत्र किया गया था. आत्मीयता शुद्ध एंटीबॉडी माउस और चूहा रेटिना में नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं immunostain को दिखाया गया था. RBPMS immunostaining की विशिष्टता का मूल्यांकन करने के लिए, एक preabsorption नियंत्रण खरगोश एंटीबॉडी के साथ प्रदर्शन किया गया था. संक्षेप में, RBPMS एंटीबॉडी आरटी पर 2 घंटे के लिए 1 ग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता में RBPMS पॉलीपेप्टाइड साथ 0.5% ट्राइटन X-100 और मिश्रित युक्त 0.1 एम पंजाब में पतला था. कोई RBPMS immunostaining RBPMS और मानक immunohistochemical तकनीक द्वारा संसाधित करने preabsorbed खरगोश एंटीबॉडी के साथ incubated ऊतक वर्गों में उपस्थित थे.

s.jpg "चौड़ाई =" 600 "/>
चित्रा 1: RGC प्रोटीन RBPMS (लाल) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ पोस्ट अस्थायी immunostaining नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं को Fluo-4 (हरा) स्थानीयकरण दिखाने के लिए एक Alexa 568 बकरी विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया गया था.. स्केल बार: 20 मिमी.

कैल्शियम इमेजिंग तकनीक RGCs और उनके axons में कैल्शियम संकेत को VGCCs के योगदान का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है. फ्लोरोसेंट तीव्रता मूल्यों ब्याज की RGCs (चित्रा 2) पर ROIs रखकर हासिल किया गया.

चित्रा 2
चित्रा 2:. 50 मिमी: फ्लोरोसेंट तीव्रता मूल्यों का अधिग्रहण करने के लिए, ROIs नाड़ीग्रन्थि सेल somata और / या axons स्केल बार पर रखा गया था.

Fluo-4 pentapotassium नमक RGCs और उनके axons (चित्रा 3) लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.


चित्रा 3: नाड़ीग्रन्थि सेल somata और उनके axons में कैल्शियम संकेतन में योगदान VGCC उपप्रकार. (ए) आधारभूत स्तर पर एक wholemount रेटिना की confocal छवि. RGCs और RGC axons Fluo-4 के साथ लेबल देखा जा सकता है. (बी) उच्च कश्मीर की बनती दालों + (60 मिमी) स्नान समाधान और बाद में कमी से हासिल मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि का प्रदर्शन एक भी RGC somata से फ्लोरोसेंट संकेत दूसरी नाड़ी दौरान कोबाल्ट की उपस्थिति में प्रतिदीप्ति. एक के लिए स्केल बार: 20 मिमी.

जीस LM5 पास्कल प्रणाली 5 सेकंड के एक फ्रेम दर पर छवियों पर कब्जा करने के लिए सेट और प्रत्येक पूर्ण फ्रेम स्कैन का इस्तेमाल किया सेटिंग्स में 1.57 सेकंड में ले लिया गया था. 318 माइक्रोन x 318 माइक्रोन का एक संग्रह क्षेत्र 512 x 512 गड़बड़ी की स्कैन क्षेत्र में शामिल किया गया थापिक्सेल प्रति 0.385 माइक्रोन 2 के एक क्षेत्र को देने xels. इन सेटिंग्स वांछित संकल्प के आधार पर अलग किया जा सकता है. प्रणाली 488 एनएम उत्तेजना के लिए एक 25 मेगावाट आर्गन लेजर का उपयोग करता है. हम 3% बिजली पर इस लाइन का इस्तेमाल किया. संतृप्ति पहली depolarizing प्रोत्साहन के लिए मजबूत प्रतिक्रियाओं झुकेंगे और फिर उत्पादन लाभ को कम करके कि कैल्शियम सूचक डाई की सबसे कम एकाग्रता का चयन करके कम से कम किया गया था. लेजर बिजली की कमी विरंजन से बचने में मदद की. संकेतक एकाग्रता नहीं मापा गया था. गैर ratiometric इमेजिंग की कैलिब्रेशन कैल्शियम ionophores के उपयोग के साथ संभव है, लेकिन backfilling तकनीक के रूप में अच्छी तरह से ratiometric रंगों के साथ काम कर सकते हैं. इष्टतम सूचक एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए, हम 1-40 मिमी से लेकर Fluo-4 के स्टंप इंजेक्शन सांद्रता के साथ प्रतिदीप्ति में विध्रुवण पैदा परिवर्तन की तुलना में. परिपत्र और अंडाकार ROIs स्थिर प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रदर्शन किया है कि क्रमश RGCs और उनके axons, चारों ओर खींचा गया. RGCs और से बाहर हो गए कि axonsकारण superfusion की वजह से आंदोलन करने के लिए ध्यान केंद्रित चयनित नहीं थे.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

1) Immunohistochemistry रेटिना wholemounts में नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं को Fluo-4 स्थानीयकरण दिखाने के लिए, और 2) कैल्शियम इमेजिंग रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं और उनके axons में कैल्शियम की गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए: इस लेख में, हम दो विभिन्न तकनीकों का वर्णन किया है.

Wholemounts का उपयोग Immunohistochemistry 20-23 रेटिना कृंतक में प्रोटीन का स्थानीयकरण प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, कुछ सीमाएं हैं. धुंधला की गुणवत्ता अपने संबंधित प्रतिजन और ब्याज की विशेष परत को रेटिना ऊतक घुसना करने की क्षमता को पहचान करने के लिए एंटीबॉडी की क्षमता पर काफी निर्भर करता है. इन मुद्दों नाड़ीग्रन्थि सेल परत के माध्यम से एंटीबॉडी के प्रसार की अनुमति के लिए फिल्टर पेपर के बिना, ऊपर से सात दिन से प्राथमिक एंटीबॉडी में ऊष्मायन अवधि बढ़ती ट्राइटन एक्स की एकाग्रता बढ़ती है और / या रेटिना incubating द्वारा सुधार किया जा सकता है और फोटोरिसेप्टर. एक और सीमा durati हैपर और निर्धारण की एकाग्रता. ऊतक एक घंटे के लिए तय हो गई है जब अन्य एंटीबॉडी एक छोटी निर्धारण अवधि की आवश्यकता होती है, जबकि कुछ एंटीबॉडी, बेहतर काम करते हैं. कुछ एंटीबॉडी 4% पीएफए ​​निर्धारण में सबसे अच्छा काम है, जबकि इसी तरह,, दूसरों को कम सांद्रता में बेहतर काम करते हैं. हम उपयोगकर्ता के इष्टतम अवधि और निर्धारण की एकाग्रता, ऊष्मायन की अवधि, ट्राइटन एक्स की एकाग्रता, साथ ही इष्टतम परिणामों के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी की एकाग्रता का निर्धारण सलाह देते हैं.

कैल्शियम इमेजिंग रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं और उनके axons में कैल्शियम गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. VGCC अवरुद्ध एजेंटों की superfusion दवाओं के रिश्तेदार अवरुद्ध प्रभावकारिता और विभिन्न सीए चैनल उपप्रकार की उपस्थिति का आकलन अनुमति दी. RGCs और axons उच्च + K का जवाब नहीं है कि घटना में, के रूप में उच्च सांद्रता संतृप्ति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, कैल्शियम सूचक डाई की एकाग्रता को कम करने का प्रयास करें. कांच की अधूरी हटानेयह भी RGCs और उनके axons पहुंचने से उच्च + K रोकने, एक बाधा के रूप में कार्य कर सकते हैं. इसके अलावा, ठीक से रेटिना के शीर्ष पर वीणा माउंट करने के लिए विफलता प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों का अधिग्रहण करने में असमर्थता, जिसके परिणामस्वरूप आंदोलन पैदा कर सकता है. रेटिना को स्थानांतरित करने के लिए जारी है, ध्यान से रेटिना के आसपास के क्षेत्र के लिए सूखी, वीणा को हटाने और इसकी परिधि को अधिक तेल जोड़कर वीणा फिर से माउंट. रेटिना wholemount के शीशे और न्यूनतम आंदोलन की पूरी हटाने प्रयोग की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है.

ऐसे एन मिथाइल-D-aspartate (NMDA) के रूप में RGCs द्वारा व्यक्त कैल्शियम पारगम्य ग्लूटामेट रिसेप्टर्स, 24,25 α -amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionate (AMPA) रिसेप्टर्स और kainate प्रकार की agonists ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स 26-29, कैल्शियम की सीधे प्रवेश आह्वान के साथ ही VGCCs सक्रिय है कि एक depolarizing प्रोत्साहन प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ऐसे एगोनिस्ट के उपयोग के एक गैर करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैंRGCs के विभिन्न प्रकार के ग्लूटामेट रिसेप्टर subtypes के अंतर अभिव्यक्ति के कारण -uniform प्रतिक्रिया. दो photon माइक्रोस्कोपी भी RGCs 30 और उनके डेन्ड्राइट 31 में प्रकाश पैदा कैल्शियम संकेतों की जांच करने के लिए उपयोग किया जा सकता है.

RGCs के चुनिंदा लेबलिंग Fluo-4 pentapotassium नमक कैल्शियम सूचक डाई की झिल्ली impermeant गुण की वजह से हासिल की थी. Dextran संयुग्मित कैल्शियम सूचक रंजक भी चुनिंदा खरगोश 32 और चूहे 33 में intraretinal इंजेक्शन के माध्यम से RGCs और उनके axons लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. दोनों अध्ययनों में, RGCs और उनके axons की चुनिंदा लेबलिंग खरगोश 32 में एक 2 घंटा ऊष्मायन या चूहा 33 में एक 7 घंटा ऊष्मायन द्वारा पीछा dextran संयुग्मित कैल्शियम सूचक डाई का intraretinal इंजेक्शन के माध्यम से हासिल की थी. रेटिना में वर्दी लेबलिंग सुनिश्चित करने के लिए एक पर्याप्त ऊष्मायन अवधि प्रदान करने के बावजूद इस तरह के तरीकों RGCs और की वृद्धि की लेबलिंग में परिणाम उनकेइंजेक्शन साइट निकटतम axons इंजेक्शन साइट के लिए बाहर क्षेत्रों में विरल लेबलिंग की तुलना में. Baldrige (1996), इंजेक्शन साइट पर गैर वर्दी लेबलिंग में चर्चा की डिस्टल क्षेत्रों में लेबलिंग की संभावना है, जबकि कारण प्रतिगामी परिवहन को उजागर (कटौती) डेन्ड्राइट पर डाई तेज का एक परिणाम के रूप में सोमा के diffusional लेबलिंग करने के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है उजागर अक्षतंतु 32 में डाई के तेज से. हमारी तकनीक में सुधार के तरीकों RGCs और उनके axons की वर्दी लेबलिंग को बढ़ाने के लिए और आवश्यक ऊष्मायन अवधि कम करने के लिए प्रदान करता है.

वर्तमान डाई लोड हो विधि नाड़ीग्रन्थि सेल परत में विस्थापित amacrine कोशिकाओं की गैर विशिष्ट लोडिंग में परिणाम है कि इस तरह के थोक लदान और electroporation के रूप में पारंपरिक तकनीक के लिए एक वैकल्पिक रणनीति प्रदान करता है. विशिष्ट नाड़ीग्रन्थि सेल आबादी 34-38, भविष्य अनुप्रयोगों में हैं कि प्रमोटरों के नियंत्रण में tdTomato या EGFP व्यक्त ट्रांसजेनिक माउस लाइनों की उपलब्धता के साथइस तकनीक की पसंदः विशिष्ट रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल उपप्रकार की कैल्शियम इमेजिंग अध्ययन शामिल हो सकते हैं.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों कोई खुलासे है.

Acknowledgments

हम कैल्शियम इमेजिंग प्रोटोकॉल के योगदान के लिए डॉ एस स्टेला और हेलेन Vuong धन्यवाद. हम साक्षात्कार के दृश्य फिल्माने के लिए डॉ लालकृष्ण शीट्स धन्यवाद. हम पांडुलिपि पर उसकी टिप्पणी के लिए डॉ एरलीन Hirano धन्यवाद. इस अनुसंधान और विकास परियोजना टेलीमेडिसिन और उन्नत प्रौद्योगिकी यूसीएलए मेडिसिन में दाऊद Geffen स्कूल में लेखकों द्वारा आयोजित किया गया था और अमेरिकी सेना चिकित्सा अनुसंधान और materiel कमान (USAMRMC) द्वारा सम्मानित किया गया और प्रशासित किया गया था कि एक अनुबंध समझौते से संभव बनाया है और अनुबंध संख्या के तहत एमडी किले Detrick में अनुसंधान केंद्र (TATRC),: W81XWH-10-2-0077. इन अध्ययनों के लिए समर्थन भी एनआईएच EY04067 और एक वीए मेरिट समीक्षा (नो बॉल) से आया है. एनसीबी एक VA कैरियर रिसर्च साइंटिस्ट है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Straight scissors WPI 14124-G dissecting tools
Straight Forceps WPI 501985 dissecting tools
curved iris scissors WPI 504487 dissecting tools
Cellulose filter paper Millipore HABP04700
Hibernate A Invitrogen A12475-01 Media
Vectashield Vector H-1000 Mounting Media for Fluorescence
Fluo-4 pentapotassium Invitrogen F-14200
Isoflurane Abbott Laboratories 05260-05 anesthesia
Microscope slide Fisher Scientific 22-178-277
Zeiss LSM 5 Pascal microscope Zeiss
Axioplan 40X (NA 0.8) objective lens Zeiss
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Molecular Probes A-11034 Secondary antibody
RBPMS ProSci, Poway, CA A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guenther, E., et al. Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat. Brain Res. 633, 223-235 (1994).
  2. Farrell, S. R., et al. Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ganglion cells mediated by somatostatin receptor subtype 4. J Neurophysiol. 104, 1347-1354 (2010).
  3. Caterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 521-555 (2000).
  4. Berridge, M. J., et al. Calcium--a life and death signal. Nature. 395, 645-648 (1998).
  5. Berridge, M. J. Calcium microdomains Organization and function. Cell Calcium. 40, 405-412 (2006).
  6. Dolphin, A. C. Calcium channel diversity multiple roles of calcium channel subunits. Curr Opin Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
  7. Rottman, J. B. The ribonuclease protection assay a powerful tool for the veterinary pathologist. Vet Pathol. 39, 2-9 (2002).
  8. Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
  9. Segev, R., et al. Recording spikes from a large fraction of the ganglion cells in a retinal patch. Nat Neurosci. 7, 1154-1161 (2004).
  10. Jeon, C. J., et al. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18, 8936-8946 (1998).
  11. Blankenship, A. G., et al. Synaptic and extrasynaptic factors governing glutamatergic retinal waves. Neuron. 62, 230-241 (2009).
  12. Daniels, B. A., Baldridge, W. H. d-Serine enhancement of NMDA receptor-mediated calcium increases in rat retinal ganglion cells. J Neurochem. 112, 1180-1189 (2010).
  13. Weitz, A. C., et al. Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators. J Neurophysiol. 109, 1979-1988 (2013).
  14. Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Expression of voltage-gated calcium channel α(2)δ(4) subunits in the mouse and rat retina. J Comp Neurol. 521 (2), 2486-2501 (2013).
  15. Hirano, A. A., et al. SNAP25 expression in mammalian retinal horizontal cells. J Comp Neurol. 519, 972-988 (2011).
  16. Berridge, M. J., et al. Calcium signalling dynamics, homeostasis and remodeling. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-529 (2003).
  17. Dailey, M. E., et al. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harb ProtocI. , 373-379 (2011).
  18. Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring intracellular calcium ion dynamics in hair cell populations with Fluo-4. AM. PLoS One. 7, e51874 (2012).
  19. Kwong, J. M. K., et al. RNA binding protein with multiple splicing A new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1052-1058 (2010).
  20. Pérez deSevilla Müller, L., et al. Displaced amacrine cells of the mouse retina. J Comp Neurol. 505, 177-189 (2007).
  21. Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Tracer coupling of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells to amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 518, 4813-4824 (2010).
  22. Raymond, I. D., et al. Cyan fluorescent protein expression in ganglion and amacrine cells in a thy1-CFP transgenic mouse retina. Mol Vis. 14, 1559-1574 (2008).
  23. Raymond, I. D., et al. A Thy1-CFP DBA/2J mouse line with cyan fluorescent protein expression in retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 26, 453-465 (2009).
  24. Mayer, M. L., Westbrook, G. L. Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurones. J Physiol. 394, 501-527 (1987).
  25. Ascher, P., Nowak, L. The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurons in culture. J Physiol. 399, 247-266 (1988).
  26. Aizenman, E., et al. Responses mediated by excitatory amino acid receptors in solitary retinal ganglion cells from rat. J Physiol. 396, 75-91 (1988).
  27. Taschenberger, H., et al. Synaptic current kinetics in a solely AMPA-receptor-operated glutamatergic synapse formed by rat retinal ganglion neurons. J Neurophysiol. 74, 1123-1136 (1995).
  28. Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
  29. Jakobs, T. C., et al. Expression of mRNA for glutamate receptor subunits distinguishes the major classes of retinal neurons, but is less specific for individual cell types. Mol Vis. 13, 933-948 (2007).
  30. Margolis, D. J., Detwiler, P. B. Different mechanisms generate maintained activity in ON and OFF retinal ganglion cells. J NeurosciI. 27, 5994-6005 (2007).
  31. Margolis, D. J., et al. Dendritic calcium signaling in ON and OFF mouse retinal ganglion cells. J Neurosci. 30, 7127-7138 (2010).
  32. Baldridge, W. H. Optical recordings of the effects of cholinergic ligands on neurons in the ganglion cell layer of mammalian retina. J Neurosci. 16, 5060-5072 (1996).
  33. Hartwick, A. T., et al. Functional assessment of glutamate clearance mechanisms in a chronic rat glaucoma model using retinal ganglion cell calcium imaging. J Neurochem. 94, 794-807 (2005).
  34. Badea, T. C., Nathans, J. Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter. J Comp Neurol. 480, 331-351 (2004).
  35. Huberman, A. D., et al. Architecture and activity-mediated refinement of axonal projections from a mosaic of genetically identified retinal ganglion cells. Neuron. 59, 425-438 (2008).
  36. Kim, I. J., et al. Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion. Nature. 452, 478-482 (2008).
  37. Munch, T. A., et al. Approach sensitivity in the retina processed by a multifunctional neural circuit. Nat Neurosci. 12, 1308-1316 (2009).
  38. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 92 immunohistochemistry एंटीबॉडी Fluo-4 कैल्शियम इमेजिंग नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं रेटिना चूहा
Wholemount चूहा रेटिना में immunohistochemical और कैल्शियम इमेजिंग तरीकों
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N.… More

Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Pérez De Sevilla Müller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J. Vis. Exp. (92), e51396, doi:10.3791/51396 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter