Summary
يصف هذا البروتوكول وسيلة لاستخراج الرنا صغيرة من مصل الإنسان. وقد استخدمنا هذا الأسلوب لعزل microRNAs من مصل السرطان للاستخدام في صفائف الحمض النووي وأيضا singleplex PCR الكمي. بروتوكول يستخدم الفينول وثيوسيانات guanidinium الكواشف مع بعض التعديلات لانتاج الحمض النووي الريبي جودة عالية.
Abstract
تحليل الحمض النووي الريبي والتعبير هو سمة مشتركة في العديد من المختبرات. أهمية هو ظهور الرنا الصغيرة مثل microRNAs، والتي توجد في خلايا الثدييات. هذه الرناوات الصغيرة هي المنظمين الجينات القوية السيطرة على الممرات الحيوية مثل النمو والتنمية والموت والكثير من الاهتمام وقد وجهت في التعبير عنها في سوائل الجسم. ويرجع ذلك إلى التقلبات في الأمراض التي تصيب الإنسان مثل السرطان وإمكانية تطبيقها والمؤشرات الحيوية مصل هذا. ومع ذلك، فإن تحليل ميرنا التعبير في المصل قد يكون مشكلة. في معظم الحالات من كمية المصل يحد ويحتوي على كميات قليلة من المصل الحمض النووي الريبي مجموع، والتي تشكل الرنا صغيرة فقط 0.4-0.5٪ 1. وبالتالي عزل كميات كافية من نوعية الحمض النووي الريبي من المصل يشكل تحديا كبيرا للباحثين اليوم. في هذه الورقة التقنية، ونحن لشرح الطريقة التي يستخدم فقط 400 ميكرولتر من مصل الإنسان للحصول على الحمض النووي الريبي كافية لصفائف إما DNA أو تحليل QPCR. وعلىdvantages هذه الطريقة هي بساطتها والقدرة على انتاج الحمض النووي الريبي جودة عالية. لا يتطلب أي أعمدة متخصصة لتنقية الرنا صغيرة وتستخدم الكواشف العامة والأجهزة الموجودة في المختبرات المشتركة. يستخدم أسلوب لدينا قفل جل المرحلة للقضاء على التلوث الفينول بينما في نفس الوقت جودة عالية الغلة الحمض النووي الريبي. ونحن نقدم أيضا خطوة إضافية لمواصلة إزالة جميع الملوثات خلال الخطوة العزلة. هذا البروتوكول هو فعالة جدا في عزل الحمض النووي الريبي غلة إجمالية تصل إلى 100 نانوغرام / ميكرولتر من المصل ولكن يمكن أيضا أن تتكيف لالأنسجة البيولوجية الأخرى.
Introduction
في السنوات الأخيرة، كان هناك دفع المتزايد لاكتشاف مؤشرات حيوية جديدة للكشف المبكر عن الأمراض التي تصيب الإنسان. وقد تركز الكثير من الاهتمام على استخدام الرنا الصغيرة مثل microRNAs 2 (miRNAs أو ميرس) كعلامات محتملة. تم العثور على هذه الرناوات الصغيرة في سوائل الجسم مثل الدم والدراسات أظهرت أنها مقاومة للتدهور ومستقرة على مجموعة من الظروف البيئية المتباينة 3. ونظرا لهذه الميزات miRNAs، المصل أو المتداولة هي العلامات البيولوجية مثالية 4، 5. حاليا هناك نوعان من الأساليب الرئيسية لعزل الحمض النووي الريبي الصغيرة من السوائل البيولوجية. يستخدم النهج الأول التكنولوجيا القائمة على عمود لربط وأزل الرنا صغيرة 6، بينما يستخدم الأسلوب الثاني البروتوكول طويلة الأمد مع الفينول وثيوسيانات guanidinium الكواشف 7. وقد وضعنا بسيطة وفعالة وخالية من الأعمدة بروتوكول لعزل الرنا صغيرة من مصل الإنسان. الحمض النووي الريبي معزولة هو immediately صالحة للاستعمال في التطبيقات المصب، بما في ذلك صفائف قليل النوكليوتيد الحمض النووي RNA والتسلسل.
وقد تم تطوير هذا البروتوكول لأننا كنا نواجه العديد من القضايا عند استخدام الأساليب القائمة على الفينول لعزل الحمض النووي الريبي من المصل. وكثيرا ما يستخدم النهج Chomczynski التقليدية في معظم المختبرات مع مجموعة من الكواشف المتوفرة من معظم البائعين التجارية. ولكن النظر في استخدامها على نطاق واسع، لم يتم وضع مبادئ توجيهية صارمة لتنتج باستمرار جودة عالية من الحمض النووي الريبي سوائل الجسم، في الدم أو المصل معينة.
المشاكل الشائعة المرتبطة عزل الحمض النووي الريبي من المصل تشمل عوائد منخفضة الحمض النووي الريبي والتلوث مع الكواشف المستخدمة خلال العزلة، ولا سيما الفينول. نهجنا نتخلص من هذه الملوثات الفينول لتوفير الحمض النووي الريبي جودة عالية لتحليل المصب مثل PCR الكمي (QPCR) والحمض النووي الريبي التسلسل. لدينا المزيد من اختبار هذا الحمض النووي الريبي على صفائف ميرنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: عينات مصل الإنسان من المرضى الأصحاء أو المرضى الذين يعانون من السرطان تم الحصول عليها مع الموافقة المسبقة بموجب البروتوكولات المعتمدة الأخلاقية الإنسان من الأمير ألفريد الملكي مستشفى سيدني (عدد بروتوكول X10-0016 وHREC/10/RPAH/24) وجامعة للتكنولوجيا، سيدني. تم جمع عينات من مصل الدم من المرضى قبل الجراحة من مختلف مستشفيات سيدني وضعت في التخزين في -80 درجة مئوية.
1. عزل الحمض النووي الريبي الصغيرة من المصل
تم إعداد الحمض النووي الريبي مجموع من المصل البشري باستخدام نسخة معدلة من بروتوكول LS ثلاثي الكاشف RT.
- ذوبان الجليد عينة مصل المجمدة على الجليد ومن ثم نقل 400 ميكرولتر من المصل إذابة حديثا في أنبوب microcentrifuge المسمى.
- تمييع الدم مع 100 ميكرولتر من ريبونوكلياز H 2 O حرة وإضافة بروتين K بتركيز 1 ملغ / مل.
- احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة للسماح للهضم البروتين بواسطة بروتين K.
- Tس ضمان الانحلالية كاملة، إضافة 1.5 مرة من حجمه ثلاثي الكاشف RT LS و 100 ميكرولتر من 4 bromoanisole.
- لفترة وجيزة عكس جناسة، نفذ pipetting لمدة 5 ثوانى المتكررة ونقل إلى صفت أنبوب 2 مل الثقيلة المرحلة قفل.
- تدور جناسة في 12،000 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- صب بعناية لا يقل عن 1 مل من محلول مائي مما أدى إلى أنبوب DNA Lobind الطازجة. وينبغي المحاصرين في الطور البيني العضوية وتحت الجل الأبيض من أنبوب المرحلة قفل.
- إضافة 5.0 ميكرولتر من الجليكوجين (5 ملغ / مل) و 500 ميكرولتر من 100٪ الأيزوبروبانول إلى محلول مائي، مزيج من قبل انقلاب، واحتضان O / N في -20 درجة مئوية.
- التالية O / N الحضانة، الطرد المركزي العينة لمدة 20 دقيقة في 12،000 × ز في 4 ° C الطرد المركزي.
- تجاهل طاف واضحة وتنفيذ "فلاش" تدور لمدة 2 دقيقة في 16،000 × ز في 4 ° C الطرد المركزي.
- إزالة بعناية واضحة سولution المحيطة بيليه باستخدام ماصة.
- غسل بيليه مع 1 مل من الايثانول 70٪ والطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 10 دقيقة. صب محلول الغسيل وكرر الخطوة غسل.
2. RNA إعادة تعليق في الحل
- resuspend وبيليه في 10 ميكرولتر من ريبونوكلياز H 2 O حرة، وضمان يذوب بيليه تماما. لضمان أن الحمض النووي الريبي هو solubilized تماما يمكن تسخين العينة إلى 55 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. خلال هذا الوقت، ومزيج العينة مع pipetting لتكرارها. لأعلى مجموع العائد الحمض النووي الريبي، تجمع اثنين الاستعدادات الحمض النووي الريبي من نفس المريض.
- Quantitate الحمض النووي الريبي معلق باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية فيز وتقييم نوعية الحمض النووي الريبي باستخدام Bioanalyzer 2100. تخزين عينات الحمض النووي الريبي المجمعة في -80 درجة مئوية لاستخدامها في التطبيقات المصب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمثل الشكل 1 طيف الأشعة فوق البنفسجية / فيس نموذجية من الحمض النووي الريبي معزولة عن المصل. من هذا الملف لاحظنا التلوث البروتين في 280 نانومتر مع الفينول والملوثات العضوية على حد سواء في 270 نانومتر و 230 نانومتر، على التوالي. ولوحظ بقايا guanidinium ثيوسيانات أيضا في 260 نانومتر. للحد من الملوثات، وقدم سلسلة من الخطوات الأمثل لثلاثي الكاشف الإجراء RT-LS القياسية. أضفنا 5 ملغ / مل من الجليكوجين إلى زيادة كل من الحمض النووي الريبي مجموع العائد وتقليل التلوث (الخط الأسود، الشكل 1A).
المزيد لاحظنا أنه بعد إزالة الأيزوبروبانول كان هناك ما يقرب من 100-300 ميكرولتر من غسل العازلة المحيطة بيليه الحمض النووي الريبي. تم إضافة تدور أجهزة الطرد المركزي إضافية للبروتوكول وتمت إزالة الحل يغسل بقايا بعناية. أدى هذا التحول في التوصيف من 270 نانومتر إلى 280 نانومتر (تتبع الأحمر، الشكل 1B). استنتجنا أن هذا "فلاش" تدور خفضت التلوث الفينولفي 270 نانومتر، وخلصت إلى أن ذروة 280 نانومتر على الأرجح يمثل تلوث البروتين.
لزيادة العائد وتقليل البروتين RNA حمل من خلال أضفنا خطوة المرحلة قفل جل. هذه الخطوة سمحت لنقل كاملة من المرحلة المائية دون الملوثات العضوية (الشكل 1B). كما يحتوي المصل وفرة كبيرة من البروتين، قمنا بتقييم إذا تمييع حجم المصل الأصلي من شأنها أن تجعل أي فرق (الشكل 1C). في إجمالي حجم استخراج 500 ميكرولتر، ونحن مختلطة 400 و 250 ميكرولتر من المصل مع DH 2 O. حجم العائد أكبر تضاعف تقريبا كمية الحمض النووي الريبي مجموع عند مقارنة باستخدام 250 ميكرولتر من المصل. كان هناك أيضا انخفاض في الملوثات عندما خفض حجم الانطلاق (ملاحظة: وكما كان المتغير الوحيد في هذه الخطوة الأمثل حجم الدم، ويرتبط الذروة 230 نانومتر مباشرة مع وحدات التخزين المصل وليس قطعة أثرية من العزلة ثلاثي الكاشف) . ثم تم تقييم محتوى الحمض النووي الريبي الصغيرة من هذه الاستعدادات باستخدام Bioanalyzer في تركيبة مع كيت الحمض النووي الريبي الصغيرة. من التتبع Bioanalyzer، هناك ذروة متميزة في حوالي 20 اليلة التي تمثل السكان الرنا الميكروي (الشكل 2A). باستخدام هذا البروتوكول، تمثل هذا المكون الرنا الميكروي 93٪ من مجموع السكان الحمض النووي الريبي الصغيرة. هذا هو على مستوى عال من النقاء ويمكن الآن أن تستخدم الحمض النووي الريبي مجموع متفاوتة لفحوصات الجزيئية مثل المصفوفات وردود الفعل QPCR. ويرد موجز لسير العمل في الشكل 2B.
نحن ثم قياس التعبير microRNA في أربع عينات البيولوجية المختلفة باستخدام إما مجموعة نيوكليوتيدات دقيقة أو QPCR. يمثل الشكل 3A خريطة الحرارة الرنا الميكروي من هذه العينات الأربع. كما هو الحال في دراستنا السابقة، تم استخدام المجموعات الهرمية لتحليل البيانات والتعبير عينات المجموعة على أساس البيانات الشخصية الخاصة بهم التعبير microRNA 8. كميتم استخدام PCR (QPCR) أيضا لتقييم مستويات الرنا الميكروي في هذه الاستعدادات. باستخدام نفس أربع عينات، أجرينا ردود الفعل TaqMan QPCR singleplex للكشف مير-21-5P، مير 486-5P، مير-15B-5P، مير-16-5P والسماح-7A. كما هو مبين في المؤامرات التضخيم (أرقام 3B و 3C) تم الكشف عن جميع miRNAs بنجاح.
الشكل 1. الشخصى طيفية من الحمض النووي الريبي من مصل الإنسان. A. لمحة الأشعة فوق البنفسجية نموذجية من الحمض النووي الريبي معزولة عن مصل الإنسان (الخط الأزرق). تم اختبار الخطوات الأمثل للحد من الملوثات المختلفة وزيادة إجمالي العائد الحمض النووي الريبي. B. يقارن استخدام قفل جل المرحلة إلى العزلة العادية. C. الملف من اثنين من القياسات مع وحدات التخزين المختلفة بداية من المصل. زيادة حجم ح الإعلان ملحوظ أثر على عوائد الحمض النووي الريبي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. A. الممثل Bioanalyzer أثر يدل على ارتفاع واحد في حوالي 21 النيوكليوتيدات (محور س). ويمثل هذا الارتفاع في جزء ميرنا السكان RNA صغيرة من المصل. B. ملخص سير العمل لعزل الحمض النووي الريبي مجموع من المصل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
hres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/51443/51443fig3.jpg "/>
الرقم 3. واستخدمت microRNAs معزولة باستخدام هذا الأسلوب لمجموعة التنميط والتحليل QPCR. تم عزل A. ثلاثة سرطانات الرأس والعنق والأمصال طبيعية واحدة لالحمض النووي الريبي مجموع (بما في ذلك microRNAs) وتعرض لمجموعة التنميط باستخدام 8 X 60K ميرنا رقاقة. وقد تكرر هذا في مكررات التقنية. بعد البيانات الخام مراقبة الجودة (QC) معالجة، تم تحليل التعبير عن هذه microRNAs باستخدام التسلسل الهرمي للمجموعات (HCL) وقدم كخريطة الحرارة. الأحمر يشير يصل التنظيم والأزرق يشير إلى أسفل تنظيم microRNAs. B. الممثل QPCR منحنيات التضخيم للكشف عن مير 21، مير 486، مير 15، مير 16 والسماح-7A في أربعة الأمصال البشرية. C. جميع تم الكشف عن خمسة miRNAs ثم تم رسم القيم ط الخام لالمصل العادي. وكان هذا النمط من كشف مماثلة لثلاثة عينات أخرى (لا تظهر البيانات)..jove.com/files/ftp_upload/51443/51443fig3highres.jpg "الهدف =" _blank "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
سكان microRNAs يشكل حوالي 0.4-0.5٪ من الحمض النووي الريبي مجموع جدت في مصل الدم. مزيد من هناك أيضا ارتفاع محتوى البروتين وجدت في مصل الدم البشري. لتحسين RNA والبروتين والحد من كل الفينول يلوث قمنا بتعديل النهج Chomczynski التقليدية 9 مع إضافة العديد من الخطوات.
تم عزل الحمض النووي الريبي مجموع من المصل باستخدام معيار ثلاثي الكاشف RT-LS (مركز الأبحاث الجزيئية) ولكن عندما أجريت في مختبرنا، أثمرت هذه الطريقة RNA بكميات منخفضة مع مختلف الملوثات.
ويبين الشكل 1 لمحة RNA الطيفي للأشعة فوق البنفسجية مع دليل على تلوث البروتين في 280 نانومتر، وتلوث الفينول في 270 نانومتر، والملوثات العضوية الأخرى في 230 نانومتر. كاشف، guanidinium ثيوسيانات، تم الكشف أيضا في 260 نانومتر.
لمعالجة مشاكل انخفاض غلة الحمض النووي الريبي في الدم وتقليل التلوث، سلسلة من optimizatوأضيفت إلى الخطوات أيون ثلاثي الكاشف الإجراء RT-LS القياسية. أولا، وجدنا أن تمييع الدم 1 في 5 تخفيض التلوث البروتين. وقد أوصت هذه الخطوة من قبل دراسات أخرى 10 ولقد ثبت للحد من تلوث البروتين. وعلاوة على ذلك، استخدمنا تركيز 1 ملغ / مل من بروتين K. كنا قد اختبرت مجموعة من التركيزات من 100، 500، و 1،000 ميكروغرام. لم يكن هناك فرق بين تركيزات بالتالي فإننا استخدام تركيزات أعلى وفترات الحضانة أقصر.
وكان التعديل الثاني لإدخال استخدام 2.0 مل أنابيب المرحلة قفل. الثقيلة المرحلة قفل جل الفخاخ معظم الملوثات مثل الفينول والبروتينات في المرحلة العضوية. أنه يوفر حاجزا الكثافة لنقل الحد الأقصى من المرحلة المائية دون التعرض لخطر التلوث. تطبيق قفل جل المرحلة باعتبارها مائي / المرحلة العضوية المواد حاجز يمكن أن تقلل من وقت المعالجة وزيادة تحسين RECOV الحمض النوويريها بنسبة تصل إلى 30٪، بينما في الوقت نفسه القضاء على المستخدم من التعرض لالعضوية المتطايرة الضارة 11. أدى التعديل الثالث على تحسن كبير في نوعية الحمض النووي الريبي. وكان إدخال "فلاش" تدور الطرد المركزي في 12،000 × ز هاما في إزالة أي تلوث المتبقية من بيليه الحمض النووي الريبي قبل يغسل الايثانول.
عند مقارنة نهجنا في منهجيات أخرى نشرت 6، 12، 13، أدخلنا استخدام قفل جل المرحلة لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش من الرنا غير المكودة صغيرة من المرحلة المائية. واحدة من القيود المفروضة على بروتوكول لدينا وغيرها هي التي قد تكون هناك حاجة إلى تكرار العزلة للحصول على ما يكفي من الحمض النووي الريبي لتحليل التعبير. من تجاربنا، ونحن نفضل أن مقارنة الأساليب Trizol القائمة على الإفراط في مجموعات على أساس العمود ودراسات عديدة مزايا كلا النظامين 6، 14-16. من أبرزها الاهتمامكانت دراسة حديثة خلصت إلى أن miRNAs مع محتوى GC منخفضة، مثل مير 141، مير 29B، مير 21، مير 106B، مير-15A، ومير 34A، يتم فقدان انتقائي أثناء إعداد العينات باستخدام طريقة Trizol 17. تم حل هذه المشكلة عن طريق إضافة المغنيسيوم خلال عينة العزلة.
باختصار، لدينا بروتوكول يستخدم الطرق التقليدية لعزل الرنا صغيرة من المصل. هذه miRNAs المصل يمكن أن تستمد من الجسيمات الدقيقة، exosomes أو الخلايا الميتة. سيكون هذا البروتوكول عزل كل هذه miRNAs لانتاج نوعية عالية الحمض النووي الريبي والتي يمكن استخدامها لمختلف التطبيقات الجزيئية المصب. هذا الأسلوب هو استخراج اضحة إلى حد ما، وتعتمد على الأجهزة المشتركة التي وجدت في معظم المختبرات، وبسيطة بما فيه الكفاية بالنسبة لمعظم المبتدئين المهتمين في قياس miRNAs التعبير في مصل الدم البشري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس هناك شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
معتمدة سامانثا خوري وباميلا Ajuyah من قبل جائزة الدراسات العليا الاسترالية. نود أيضا أن نعترف شبكة بالحركة أبحاث السرطان، لوي مركز أبحاث السرطان في جامعة نيو ساوث ويلز وحدة أبحاث السرطان الشمالية بالحركة لدعمهم إضافية من سامانثا خوري.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tri-Reagent RT LS | Molecular Research Center, USA | TR 118 | |
| RNase free H2O | GIBCO Invitrogen | 10977-023 | |
| Proteinase K | Finnzymes, Finland | EO0491 | |
| Heavy Phase Lock tube | 5PRIME | 2302830 | 2 ml capacity |
| DNA Lobind tube | Eppendorf | 0030 108.078 | 1.5 ml capacity |
| Glycogen | Invitrogen, USA | 10814-010 | 5 mg/ml |
| RNA grade isopropanol | Sigma Aldrich, USA | I9516 | 100% |
| Refrigerated centrifuge | John Morris | ||
| Nanodrop UV-Vis spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| RNA grade ethanol | Sigma Aldrich, USA | E7023 | 70% |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent, USA |
References
- Babu, S. Monitoring extraction efficiency of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer and the Small RNA Kit. Agilent Application Note. , (2010).
- Tran, N., Hutvagner, G. Biogenesis and the regulation of the maturation of miRNAs. Essays Biochem. 54, 17-28 (2013).
- Chim, S. S., et al. Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma. Clin. Chem. 54, 482-490 (2008).
- Lodes, M. J., et al. Detection of cancer with serum miRNAs on an oligonucleotide microarray. PLoS One. 4, (2009).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 18, 997-1006 (2008).
- Burgos, K. L., et al. Identification of extracellular miRNA in human cerebrospinal fluid by next-generation sequencing. RNA. 19, 712-722 (2013).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987).
- Zhang, X., et al. Alterations in miRNA processing and expression in pleomorphic adenomas of the salivary gland. Int. J. Cancer. 124, 2855-2863 (2009).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, (2011).
- Murphy, N. R., Hellwig, R. J. Improved nucleic acid organic extraction through use of a unique gel barrier material. Biotechniques. 21, 934-936 (1996).
- Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereira e Cotta, M. V., Joglekar, M. V. A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum. Experimental Diabetes Research. 2012, (2012).
- Ichikawa, M., Akiyama, H. A Combination of Extraction Reagent and DNA Microarray That Allows for the Detection of Global MiRNA Profiles from Serum/Plasma. Methods Mol. Biol. 1024, 247-253 (2013).
- Fromm, B., Harris, P. D., Bachmann, L. MicroRNA preparations from individual monogenean Gyrodactylus salaris-a comparison of six commercially available totalRNA extraction kits. BMC Res. Notes. 4, 217 (2011).
- Li, Y., Kowdley, K. V. Method for microRNA isolation from clinical serum samples. Anal. Biochem. 431, 69-75 (2012).
- McAlexander, M. A., Phillips, M. J., Witwer, K. W. Comparison of Methods for miRNA Extraction from Plasma and Quantitative Recovery of RNA from Cerebrospinal Fluid. Frontiers in Genetics. 4, 83 (2013).
- Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Mol. Cell. 46, 893-895 (2012).
