Summary
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het extraheren van kleine RNA uit menselijk serum. We hebben deze methode om microRNA kanker serum te isoleren voor gebruik in DNA arrays en ook singleplex kwantitatieve PCR. Het protocol maakt gebruik van fenol en guanidiniumthiocyanaat reagentia met modificaties van hoge kwaliteit RNA opleveren.
Abstract
De analyse van RNA en de expressie ervan is een gemeenschappelijk kenmerk in veel laboratoria. Van belang is het ontstaan van kleine RNAs, zoals microRNAs, die worden aangetroffen in zoogdiercellen. Deze kleine RNA's zijn krachtige gen regelgevers beheersen van vitale routes zoals groei, ontwikkeling en dood en veel belangstelling is gericht op hun expressie in lichaamsvloeistoffen. Dit komt door de ontregeling in menselijke ziekten zoals kanker en hun mogelijke toepassing als serumbiomarkers. Echter, de analyse van miRNA expressie in serum problematisch zijn. In de meeste gevallen is de hoeveelheid serum wordt beperkt en serum bevat geringe hoeveelheden totaal RNA, waarvan slechts kleine RNAs vormen 0,4-0,5% 1. Dus de isolatie van voldoende hoeveelheden van kwaliteit RNA uit serum is een grote uitdaging voor onderzoekers vandaag. In dit technische document tonen we een werkwijze die op 400 gl menselijk serum gebruikt om voldoende RNA voor zowel DNA arrays of qPCR analyse. De eendvantages van deze werkwijze zijn de eenvoud en het vermogen om hoge kwaliteit RNA opbrengst. Het vereist geen speciale kolommen voor zuivering van kleine RNA's en maakt gebruik van algemene reagentia en hardware gevonden in gemeenschappelijke laboratoria. Onze werkwijze gebruikt een Phase Lock Gel fenol verontreiniging te elimineren terwijl tegelijkertijd de hoge kwaliteit waardoor RNA. We introduceren ook een extra stap om alle verontreinigingen verder te verwijderen tijdens de isolatie stap. Dit protocol is zeer effectief bij het isoleren van totaal RNA opbrengst tot 100 ng / ul uit serum, maar kan ook worden aangepast voor andere biologische weefsels.
Introduction
In de afgelopen jaren is er een groeiende druk om nieuwe biomarkers te ontdekken voor de vroege opsporing van ziekten bij de mens. Veel aandacht is gericht op het gebruik van kleine RNA's zoals microRNA 2 (miRNAs of miRs) als potentiële markers. Deze kleine RNAs worden aangetroffen in lichaamsvloeistoffen zoals serum en studies hebben aangetoond ze bestand tegen afbraak en stabiel zijn over een bereik van variërende omgevingsomstandigheden 3. Gezien deze kenmerken, serum of circuleren miRNAs zijn de ideale biomarker 4, 5. Momenteel zijn er twee belangrijke benaderingen voor het isoleren van kleine RNA uit biologische vloeistoffen. De eerste benadering maakt gebruik van kolommen gebaseerde technologie te binden en elueren de kleine RNAs 6, terwijl de tweede benadering gebruikt de langdurige protocol met fenol en guanidine thiocyanaat reagentia 7. We hebben een eenvoudig, effectief, kolomvrije protocol om kleine RNA te isoleren uit humaan serum ontwikkeld. Het geïsoleerde RNA is onmiddellijklijk bruikbaar in afgeleide toepassingen, met inbegrip van DNA-oligonucleotide arrays en RNA sequencing.
Dit protocol is ontwikkeld omdat we werden geconfronteerd met een aantal problemen bij het gebruik van fenol gebaseerde methoden voor het isoleren van RNA uit serum. De traditionele benadering Chomczynski wordt vaak gebruikt in de meeste laboratoria met verschillende reagentia verkrijgbaar bij de meeste commerciële verkopers. Maar gezien de grootschalige toepassing ervan, strenge richtlijnen zijn niet ontwikkeld om consequent produceren hoogwaardige RNA van lichaamsvloeistoffen, met name bloed of serum.
Veel voorkomende problemen in verband met het isoleren van RNA uit het serum onder lage opbrengsten RNA en besmetting met reagentia gebruikt tijdens de isolatie, met name fenol. Onze aanpak elimineert deze fenol verontreinigingen van hoge kwaliteit RNA voor downstream-analyse zoals kwantitatieve PCR (qPCR) en RNA sequencing. We hebben verder getest dit RNA op miRNA arrays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Human serum monsters van gezonde patiënten of patiënten met kanker werden verkregen met geïnformeerde toestemming op grond van goedgekeurde menselijke ethische protocollen van het Royal Prince Alfred Hospital van Sydney (Protocolnummer X10-0016 en HREC/10/RPAH/24) en de University of Technology, Sydney. Serummonsters werden verzameld van patiënten voor de operatie uit verschillende Sydney ziekenhuizen en in opslag bij -80 ° C.
1. Kleine RNA isolatie uit serum
Totaal RNA werd bereid uit humaan serum met een aangepaste versie van de Tri-Reagent RT LS protocol.
- Ontdooi bevroren serum monster op ijs en vervolgens overbrengen 400 ul van de vers ontdooide serum in een gemerkte microcentrifugebuis.
- Verdun het serum met 100 ul RNase-free H2O en voeg proteinase K in een concentratie van 1 mg / ml.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 20 minuten om eiwitvertering zodat door proteïnase K
- To zorgen voor volledige oplossen, voeg 1,5 maal het volume van Tri-reagens RT LS en 100 ul van 4-broomanisol.
- Kort keren de homogenaat, repetitieve pipetteren voor 5 sec en overbrengen naar een gelabelde 2 ml Heavy Phase Lock buis.
- Draai het homogenaat bij 12.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
- Giet voorzichtig minimaal 1 ml van de verkregen waterige oplossing in een nieuwe DNA LoBind buis. De organische en interfase moeten worden gevangen onder de witte gel van de Phase Lock buis.
- Voeg 5,0 ui glycogeen (5 mg / ml) en 500 ul 100% isopropanol aan de waterige oplossing, te mengen door omkeren en incubeer O / N bij -20 ° C.
- Na O / N incubatie gecentrifugeerd het monster gedurende 20 minuten bij 12.000 xg bij 4 ° C gecentrifugeerd.
- Verwijder het supernatant helder en uitvoeren van een "flash" rotatie gedurende 2 min bij 16.000 xg bij 4 ° C gecentrifugeerd.
- Verwijder voorzichtig de heldere solution rondom de pellet met behulp van een pipet.
- Was de pellet met 1 ml 70% ethanol en centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 10 minuten. Giet het wassen oplossing en herhaal wasstap.
2. RNA Resuspension in Solution
- Resuspendeer de pellet in 10 ul RNase-free H2O, zodat de tablet volledig is opgelost. Om het RNA volledig opgelost het monster tot 55 ° C gedurende 5 minuten worden verwarmd. Gedurende deze tijd, meng het monster met herhaalde pipetteren. Voor een hogere totale RNA opbrengst, bundelen twee RNA voorbereidingen van dezelfde patiënt.
- Kwantificeren de geresuspendeerd RNA met behulp van een UV-Vis spectrofotometer en de RNA kwaliteit te beoordelen met behulp van een 2100 Bioanalyzer. Bewaar de samengevoegde RNA monsters bij -80 ° C voor gebruik in stroomafwaartse toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont een typische UV / Vis-spectrum van RNA geïsoleerd uit serum. Uit dit profiel hebben we vastgesteld eiwit verontreinigingen bij 280 nm met fenol en organische verontreinigingen zowel 270 nm en 230 nm respectievelijk. Residu guanidinium thiocyanaat werd waargenomen bij 260 nm. Om verontreinigingen te verminderen, een aantal optimalisatie stappen gezet naar de standaard Tri-reagens RT-LS procedure. We voegden 5 mg / ml glycogeen om zowel de totale RNA opbrengst te verhogen en te verminderen vervuiling (zwarte lijn, figuur 1A).
Verder waargenomen dat na het verwijderen van isopropanol was ongeveer 100-300 pl wasbuffer rond de RNA pellet. Een extra centrifuge draaien werd aan het protocol toegevoegd en het residu wassen oplossing werd zorgvuldig verwijderd. Dit resulteerde in een profiel verschuiving van 270 nm tot 280 nm (rood spoor, figuur 1B). We afgeleid dat deze "flash" draai de fenol besmetting had verminderdbij 270 nm en concludeerde dat de 280 nm piek waarschijnlijk vertegenwoordigd eiwit besmetting.
Om verder te verhogen RNA opbrengst en verminderen eiwit doorvoeren voegden we een Phase Lock Gel stap. Deze stap termijn voor de volledige overdracht van de waterfase zonder organische verontreinigingen (Figuur 1B). Als serum bevat een grote overvloed aan eiwit, we geëvalueerd als verdunning van de oorspronkelijke serumvolume enig verschil (figuur 1C) zou maken. In totaal extract volume van 500 ul, gemengd we 400 en 250 gl serum met dH 2 O. Het grotere volume opbrengst bijna verdubbeld de hoeveelheid totaal RNA bij vergelijken met 250 pl serum. Er was ook een vermindering van verontreinigingen bij het verminderen van het uitgangsvolume (Opmerking: Als enige variabele in de optimalisatie stap was het volume van serum, wordt de 230 nm piek rechtstreeks verbonden met serum volumes en geen artefact van de Tri-Reagent isolatie) . De kleine RNA inhoud van deze preparaten werd vervolgens gemeten met de Bioanalyzer in combinatie met de kleine RNA Kit. Uit de Bioanalyzer spoor, is er een duidelijke piek bij ongeveer 20 nts die microRNA populatie (figuur 2A) vertegenwoordigt. Met dit protocol deze microRNA component vertegenwoordigde 93% van de totale kleine RNA populatie. Dit is een hoge mate van zuiverheid en de totale RNA kan nu worden gebruikt voor het variëren van moleculaire assays zoals arrays en qPCR reacties. Een samenvatting van de workflow is weergegeven in figuur 2B.
We vervolgens gemeten microRNA expressie in vier verschillende biologische monsters met behulp van een oligonucleotide array of qPCR. Figuur 3A is een microRNA warmte kaart van deze vier monsters. Zoals in onze vorige studie, werd hiërarchische clustering gebruikt om de expressie data en groep monsters op basis van hun microRNA expressie profiel 8 analyseren. KwantitatiefPCR (qPCR) werd ook gebruikt om microRNA niveaus in deze preparaten te beoordelen. Met dezelfde vier monsters, voerden we singleplex TaqMan qPCR reacties op miR-21-5p, miR-486-5p, miR-15b-5p, miR-16-5p en laat-7a te detecteren. Zoals in de amplificatie plots (Figuren 3B en 3C) Alle miRNAs succesvol gedetecteerd.
Figuur 1. Spectrofotometrisch profiel van RNA van humaan serum. A. Een typische UV-profiel van RNA geïsoleerd uit humaan serum (blauwe lijn). Verschillende optimalisaties werden getest om verontreinigingen te verminderen en totaal RNA opbrengst. B. Vergelijkt het gebruik van Phase Lock Gel een normale isolatie. C. profiel van twee metingen met verschillende uitgangspunten volumes serum. Volume verhogen h advertentie gemarkeerd impact op RNA opbrengsten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. A. vertegenwoordiger Bioanalyzer trace met een enkele piek op ongeveer 21 nucleotiden (x-as). Deze piek vertegenwoordigt de miRNA-fractie in de kleine RNA bevolking uit serum. B. Samenvatting van de workflow om totaal RNA te isoleren uit serum. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51443/51443fig3.jpg "/>
Figuur 3. De microRNA geïsoleerd met behulp van deze methode werd gebruikt voor array-profilering en qPCR analyse. A. Drie hoofd-halskanker en een normale sera werden geïsoleerd voor totaal RNA (inclusief microRNA) en onderworpen aan array-profilering met de 8 X 60K miRNA chip. Dit werd herhaald in technische replicaten. Na ruwe data Quality Control (QC) verwerking, werd de expressie van deze microRNA's geanalyseerd met behulp van hiërarchische clustering (HCL) en gepresenteerd als een heat map. Rood geeft tot regelgeving en blauw geeft neerwaartse regulatie van de microRNA's. B. Vertegenwoordiger qPCR amplificatiecurven voor de detectie van miR-21, miR-486, miR-15, miR-16 en laat-7a in vier humane sera. C. Alle vijf miRNAs werden gedetecteerd en rauwe Ct-waarden werden vervolgens uitgezet voor de normale serum. Dit patroon detectie was vergelijkbaar voor de andere drie monsters (gegevens niet getoond)..jove.com/files/ftp_upload/51443/51443fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De bevolking van microRNA vormt ongeveer 0,4-0,5% van het totaal RNA in het serum gevonden. Verder is er ook een hoog eiwitgehalte in humaan serum. RNA verbeteren en zowel eiwit en fenol verontreinigt hebben we de traditionele benadering Chomczynski 9 gemodificeerd met de toevoeging van verschillende stappen.
Totaal RNA werd geïsoleerd uit serum met behulp van de standaard Tri-reagens RT-LS (Molecular Research Centre) maar wanneer deze wordt uitgevoerd in ons laboratorium, deze methode leverde RNA in kleine hoeveelheden met diverse verontreinigingen.
Figuur 1 toont een UV spectrofotometrische RNA profiel bewijs van eiwit verontreinigingen bij 280 nm, fenol verontreiniging bij 270 nm, en andere organische verontreinigingen bij 230 nm. Het reagens, guanidinium thiocyanaat, werd gedetecteerd bij 260 nm.
Om de problemen van lage serum RNA opbrengst pakken en besmetting, een reeks Optimizat verminderenion stappen werden toegevoegd aan de standaard Tri-Reagent RT-LS procedure. Ten eerste, bleek dat het verdunnen van de serum 1 in 5 gereduceerde eiwit verontreinigingen. Deze stap is aanbevolen door andere studies 10 en is aangetoond dat eiwit verontreiniging te verminderen. Daarnaast gebruikten we 1 mg / ml concentratie van proteïnase K We hadden een concentratiebereik van 100 getest, 500 en 1000 ug. Er was geen verschil tussen de concentraties zo gebruikte we hogere concentraties en kortere incubatie.
De tweede wijziging was het gebruik van 2,0 ml Phase Lock buizen voeren. De zware Phase Lock Gel vallen de meeste verontreinigingen zoals fenol en eiwitten in de organische fase. Het biedt een dichtheid barrière voor de maximale overdracht van de waterige fase zonder het risico van besmetting. De toepassing van de Phase Lock Gel als een waterige / organische fase barrièremateriaal kan de verwerkingstijd te verminderen en verdere verbetering DNA RECOVery met maar liefst 30%, terwijl tegelijkertijd het elimineren van de gebruiker van blootstelling aan schadelijke vluchtige organische 11. De derde wijziging heeft geleid tot een aanzienlijke verbetering van RNA kwaliteit. De invoering van een "flash" centrifugatie centrifugeren op 12.000 xg belangrijk was verwijderen van resterende verontreinigingen uit de RNA pellet vóór de ethanol wasbeurten.
Bij het vergelijken van onze benadering andere gepubliceerde methoden 6, 12, 13, hebben wij het gebruik van een Phase Lock Gel herstel van kleine niet-coderende RNA van de waterige fase te maximaliseren geïntroduceerd. Een van de beperkingen van ons protocol en anderen die repliceren isolatie nodig zijn om voldoende RNA voor expressie analyse. Van onze ervaringen, we geven de voorkeur aan Trizol gebaseerde methoden over de kolommen gebaseerde kits en talrijke studies hebben de voordelen van beide systemen 6, 14-16 vergeleken. Van het bijzonder belangwas een recente studie waarin wordt geconcludeerd dat miRNAs met een laag GC-gehalte, zoals miR-141, miR-29b, miR-21, miR-106b, miR-15a en miR-34a, worden selectief verloren tijdens de voorbehandeling met behulp van de methode Trizol 17. Dit probleem werd opgelost door de toevoeging van magnesium in monster geïsoleerd.
Kortom, ons protocol gebruikt de traditionele methoden voor kleine RNA te isoleren uit serum. Deze serum miRNAs kunnen worden verkregen uit micro-deeltjes exosomes of stervende cellen. Dit protocol zou isoleren al deze miRNAs hoge kwaliteit RNA dat kan worden gebruikt voor verschillende stroomafwaartse moleculaire toepassingen. De extractiemethode is vrij eenvoudig, gebaseerd op gemeenschappelijke hardware in de meeste laboratoria en is eenvoudig genoeg voor de meeste beginners vindt het meten miRNAs expressie in humaan serum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er is niets te onthullen.
Acknowledgments
Samantha Khoury en Pamela Ajuyah worden ondersteund door de Australische Postgraduate Award. We willen ook graag de Translational Cancer Research Network, Lowy Cancer Research Centre, Universiteit van New South Wales en de noordelijke Translational Cancer Research Unit erkennen voor hun extra ondersteuning van Samantha Khoury.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tri-Reagent RT LS | Molecular Research Center, USA | TR 118 | |
| RNase free H2O | GIBCO Invitrogen | 10977-023 | |
| Proteinase K | Finnzymes, Finland | EO0491 | |
| Heavy Phase Lock tube | 5PRIME | 2302830 | 2 ml capacity |
| DNA Lobind tube | Eppendorf | 0030 108.078 | 1.5 ml capacity |
| Glycogen | Invitrogen, USA | 10814-010 | 5 mg/ml |
| RNA grade isopropanol | Sigma Aldrich, USA | I9516 | 100% |
| Refrigerated centrifuge | John Morris | ||
| Nanodrop UV-Vis spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| RNA grade ethanol | Sigma Aldrich, USA | E7023 | 70% |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent, USA |
References
- Babu, S. Monitoring extraction efficiency of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer and the Small RNA Kit. Agilent Application Note. , (2010).
- Tran, N., Hutvagner, G. Biogenesis and the regulation of the maturation of miRNAs. Essays Biochem. 54, 17-28 (2013).
- Chim, S. S., et al. Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma. Clin. Chem. 54, 482-490 (2008).
- Lodes, M. J., et al. Detection of cancer with serum miRNAs on an oligonucleotide microarray. PLoS One. 4, (2009).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 18, 997-1006 (2008).
- Burgos, K. L., et al. Identification of extracellular miRNA in human cerebrospinal fluid by next-generation sequencing. RNA. 19, 712-722 (2013).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987).
- Zhang, X., et al. Alterations in miRNA processing and expression in pleomorphic adenomas of the salivary gland. Int. J. Cancer. 124, 2855-2863 (2009).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, (2011).
- Murphy, N. R., Hellwig, R. J. Improved nucleic acid organic extraction through use of a unique gel barrier material. Biotechniques. 21, 934-936 (1996).
- Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereira e Cotta, M. V., Joglekar, M. V. A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum. Experimental Diabetes Research. 2012, (2012).
- Ichikawa, M., Akiyama, H. A Combination of Extraction Reagent and DNA Microarray That Allows for the Detection of Global MiRNA Profiles from Serum/Plasma. Methods Mol. Biol. 1024, 247-253 (2013).
- Fromm, B., Harris, P. D., Bachmann, L. MicroRNA preparations from individual monogenean Gyrodactylus salaris-a comparison of six commercially available totalRNA extraction kits. BMC Res. Notes. 4, 217 (2011).
- Li, Y., Kowdley, K. V. Method for microRNA isolation from clinical serum samples. Anal. Biochem. 431, 69-75 (2012).
- McAlexander, M. A., Phillips, M. J., Witwer, K. W. Comparison of Methods for miRNA Extraction from Plasma and Quantitative Recovery of RNA from Cerebrospinal Fluid. Frontiers in Genetics. 4, 83 (2013).
- Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Mol. Cell. 46, 893-895 (2012).
