Spinal Cord Transection dans le poisson zèbre larvaire

Summary

Après sectionnement de la moelle, le poisson zèbre adulte a la récupération fonctionnelle de six semaines après la lésion. Pour profiter de la transparence des larves et une récupération plus rapide, nous présentons une méthode pour sectionnant la moelle épinière larvaire. Après résection, nous observons la récupération sensorielle à partir de 2 jours après la lésion, et le mouvement C-coude de 3 jours après la lésion.

Abstract

Mammifères échouent dans la récupération sensitive et motrice après une lésion de la moelle épinière en raison du manque de repousse axonale dessous du niveau de la lésion ainsi que l'incapacité de relancer la neurogenèse vertébrale. Cependant, certains anamniotes y compris le poisson zèbre Danio rerio présentent à la fois sensible et la récupération fonctionnelle, même après section complète de la moelle épinière. Le poisson zèbre adulte est un organisme modèle établi pour l'étude de la régénération après une lésion de la moelle épinière, à la récupération motrice et sensorielle de six semaines après la lésion. Pour profiter de l'analyse in vivo du processus de régénération disponible chez le poisson zèbre larvaire transparent ainsi que des outils génétiques pas accessible chez l'adulte, nous utilisons le poisson zèbre larves d'étudier la régénération de la moelle après résection du cordon. Ici, nous démontrons une méthode pour reproductible et vérifiable sectionnant la moelle épinière larvaire. Après résection, nos données montrent récupération sensorielle début à deux jours après la lésion (ppp), l'esprith le mouvement de C-coude détectable par 3 dpi et la reprise de nage libre par 5 dpi. Ainsi, nous vous proposons le poisson zèbre larvaire comme un outil d'accompagnement pour le poisson zèbre adulte pour l'étude de la récupération après une blessure de la moelle épinière.

Introduction

Traumatisme majeur à la moelle épinière humaine se traduit souvent par une paralysie permanente et la perte de sensation au-dessous du niveau de la lésion, en raison de l'incapacité de repousser les axones ou relancer la neurogenèse ^1,2. Contrairement aux mammifères, cependant, anamniotes y compris les salamandres et le poisson zèbre (Danio rerio) montrent reprise robuste, même après résection complète de la moelle épinière ^3,4.

Le poisson zèbre adulte est un modèle bien établi pour étudier le processus de récupération après lésion médullaire ^5-7. Après résection complète de la moelle épinière, le rétablissement de la fonction sensorielle et de la locomotive est observé chez le poisson zèbre adulte 6 semaines après la lésion ^8. Afin d'examiner le processus de régénération in vivo, nous avons tourné à le poisson zèbre larvaire transparent ^9.

Nous présentons ici une méthode pour sectionner la moelle épinière d'un 5 jours après la fécondation (DPF) de poisson zèbre larvaire using une pipette de micro-injection biseauté comme un scalpel, modifié de Bhatt, et al. ¹⁰ Cette méthode prend en charge un débit élevé, une faible mortalité, et la reproductibilité. Avec la pratique, 300 larves / h peut être sectionné, et plus de 6 mois transections, y compris plus de 3600 animaux, 98,75% ± 0,72% ont survécu jusqu'à 7 jours après la lésion (dpi). Nos données montrent une reprise rapide de locomotion sensorielle et ainsi: à 1 dpi, tout mouvement par les poissons blessés est entraîné par pectoral locomotion fin seulement. Cependant, les larves commencent à répondre au tungstène aiguille touche caudale à sectionnement par 2 dpi, rétablir mouvement C-virage par 3 dpi, et afficher la natation prédateur de 5 dpi ^11. Utilisation de la coloration des anticorps contre la tubuline acétylée, nous avons confirmé que les axones sont absents du site de la lésion à 1 dpi, mais nous avons traversé le site de la lésion par 5 dpi. Nous croyons que ce protocole permettra une technique précieuse pour l'étude de la repousse axonale et la neurogenèse dans la moelle épinière suite à une blessure.

Protocol

Poisson zèbre ont été soulevées et élevés selon des procédures standard; expériences ont été approuvés par l'Université de comité de protection et d'utilisation des animaux dans l'Utah.

1. Préparation de chirurgie plaques

1. Fabriquer des plaques de chirurgie à l'aide de 60 mm des boîtes de Pétri et Sylgard 184 Kit d'élastomère silicone, suivant les instructions du fabricant. Remplissez plats pas plus de la moitié-plein et laisser polymériser. Magasin couvert à la température ambiante.

2. Préparation de Micropipettes

1. Fabriquer micropipettes en chauffant et en tirant à paroi mince tube borosilicate capillaire dans un extracteur micropipette utilisant les mêmes paramètres pour faire des aiguilles de microinjection.
2. Sous un microscope de dissection, casser pointe de micropipette à environ 200 m de diamètre avec une pince.
3. Biseau bord cassé avec un micromoteur initialement à 35 °, suivie d'une deuxième biseautage à 25 °. Assurez-pointe est forte et SMOOTH. Magasin terminé micropipette biseauté dans une boîte de Pétri sur une petite quantité d'argile.

3. Préparation du poisson zèbre larves

1. 7 jours avant l'intervention chirurgicale, mis en place des réservoirs d'accouplement de poisson zèbre mâle et femelle.
2. Recueillir des embryons le lendemain matin, 3 heures après les lumières s'allument pour assurer un rendement maximal. Si vous utilisez une ligne de reporter transgénique comme Tg (elevl3: eGFP) ^knu3, embryons fécondés genre 100/100 mm de plaque de 25 ml de l'E3 à 28,5 ° C. Si vous utilisez de type sauvage, sorte fécondé embryons 25/100 mm plaque dans 25 ml de l'E3 à 28,5 ° C.
3. Si vous utilisez une ligne de journaliste, l'écran d'embryons pour l'expression de fluorescence à 48 HPF. Permettre aux embryons identifiés à échéance à une densité de 25/100 mm plaque dans 25 ml de l'E3 à 28,5 ° C.
4. Lorsque les larves sont 5 dpf, préparer la plaque de la chirurgie en couvrant Sylgard avec E2 + 10 mg / L de sulfate de gentamycine (GS) + Tricaine.
   1. Préparer bac de récupération en ajoutant 25 ml E2 + GS à un 100 mm dis Petrih.
   2. Préparer scalpel en collant ensemble trois tampons. Cela formera un outil triangulaire avec trois rainures.
   3. Monter une micropipette sur les écouvillons préparé en collant dans l'une des rainures.
5. En cas de réutilisation micropipettes, rincer jusqu'à ce clair avec E2 + GS en utilisant une seringue de 1 ml et une aiguille de calibre 27 avant de monter sur écouvillons.

Chirurgie 4.

1. Anesthésier une plaque de larves à la fois (25 poissons) avec Tricaine. Les poissons sont suffisamment anesthésiée quand ils ne présentent plus la réponse au toucher. Il est important que les poissons sont complètement anesthésiés avant la chirurgie, sinon ils vont se contracter lorsque le scalpel les touche. La chirurgie est réalisée sous un microscope à dissection.
2. Transférer les larves à la plaque de la chirurgie.
   1. Sous grossissement maximum, tourner une larve à un moment de sorte qu'il se trouve sur le côté avec le dos plus proche de l'exploitation, le scalpel à la main.
   2. Pince de position de sorte qu'elles reposent sur le Sylgard,coudé sur la largeur de la chenille.
   3. Fixation du scalpel de verre contre l'un des bras de la pince, couper dans la face latérale dorsale de la larve au niveau de l'anus, en étant sûr de ne pas couper au-delà du bord ventral de la notochorde. Tournez le scalpel pour sectionner la moelle épinière.
   4. Répéter avec le reste des larves.
      Remarque: si une larve saigne, il ne se relèvera pas de la chirurgie. Retirer immédiatement la larve de la plaque de la chirurgie et de l'euthanasier par surdosage Tricaine.
3. Une fois la chirurgie sur le lot de larves est terminé, le transfert des animaux blessés à la plaque de recouvrement. C'est pour soutenir la clairière de l'anesthésie.
   1. Attention: lors de la collecte de larves blessés pour le transfert, assurez-vous qu'ils sont collectées queue ni tête première: ne pas insister sur le site de la lésion par flexion des larves.
      Remarque: Tous les appareils utilisés pour la chirurgie peuvent être réutilisés, y compris les micro-pipettes.

5. Recovery

1. Transfer blessé larves à partir de la plaque de recouvrement de 100 mm remplis de plaques 25 ml E2 + GS à une densité de 25/plate. Permettre de récupérer dans un incubateur à 28,5 ° C.
2. Vérifiez plaques quotidienne, retrait des animaux malades ou morts. Ne pas modifier le support jusqu'à Coleps (eau douce protozoaires) sont visibles dans les médias. Lors du changement de support, ne pas transférer le poisson à une nouvelle plaque; à la place, retirer autant que possible des médias et inonder la même plaque avec les nouveaux médias. Répéter au besoin pour réduire la population Coleps.
3. Nourrir tous les jours avec une petite quantité de poudre de nourriture frite.
   Remarque: La nourriture vivante (par exemple, paramécie ou rotifères) ne peuvent pas être envoyés à des larves blessé avant d'avoir récupéré la locomotion. Sinon, la nourriture vivante sera coloniser le site de la lésion et de tuer les larves.

Representative Results

Afin de réduire la gravité des lésions des tissus entourant le site de la lésion, bon biseautage de la micropipette est critique. Figure 1A montre une pointe biseautée correctement. En utilisant une pointe qui est trop large (figure 1B) tend à entraîner le décès plus élevés en raison de la probabilité accrue d'entailler l'aorte dorsale, tandis qu'une astuce qui est trop étroite (figure 1C) a tendance à ricocher sur la peau plutôt que couper le tissu.

Pour pratiquer cette technique, il est avantageux d'utiliser une ligne de rapporteur tel que Tg (elevl3: eGFP) ^knu3 pour visualiser la moelle épinière figure 2A montre une moelle épinière complètement sectionné de Tg (elevl3: eGFP) en direct. Poisson-zèbre à 1 dpi, . tandis que la figure 2B montre le même poisson vivant à 3dpi figures 2C et 2D montrent des grossissements plus élevés de l'endroit de la blessure à 3 dpi en Tg fixe (dbx1a: eGFP) poissons ayant complete (figure 2C) ou incomplète (figure 2D) moelle sectionnement de la moelle. Notez la région contiguë de l'étiquetage des neurones le long de la partie ventrale de la moelle épinière (flèche jaune).

Figure 1. Comparaison des bords de scalpel. A montre une pointe de micropipette correctement biseauté adapté à la chirurgie. Cette taille est facile à nettoyer pour la réutilisation. B montre une pointe de micropipette biseauté trop large pour une intervention chirurgicale sur une larve de 5 dpf. C est un exemple d'une pointe qui est trop étroite. Cette taille est très difficile à nettoyer pour la réutilisation, et tend à promouvoir une action de sciage de sectionnement à la place de la coupe D:. Bande dessinée de l'ensemble d'outils de lesioning. Trois tampons de 6 "sont imbriquées dans un pyramidal forme et collées ensemble. Le scalpel repose dans l'une des rainures formées par les trois tampons, et est collé en place.

.. Figure 2 Vérification section complète la microscopie confocale fluorescent a été utilisé pour l'image en direct Tg (elavl3: eGFP) poissons in vivo à 1 dpi (A) et 3dpi (B). Pour confirmer section complète, ces piles d'images ont ensuite été traitées dans ImageJ (rsbweb.nih.gov) pour générer des projections d'intensité maximale (MaxZ) comme indiqué dans A - B C - D projections spectacle de MaxZ de HuC / D étiquetés Tg (de dbx1a.: eGFP) poisson à 3 ppp avec résection complète de la moelle (C) ou résection incomplète (D).Les flèches jaunes identifient site de la lésion, D = dorsale, R = rostral. Barre d'échelle = 100 um.

Discussion

Lors de l'apprentissage d'abord cette technique, nous vous recommandons d'essayer pas plus de 50-100 transections en une seule séance. Après avoir maîtrisé cette technique, nous sommes en mesure de transect de 300 embryons par heure; Toutefois, ce niveau de débit nécessite quelques mois de pratique hebdomadaire. Nous vous recommandons également de pratiquer avec une ligne de journaliste et de vérifier section complète jusqu'à ce que l'incidence de la résection incomplète de la moelle épinière est réduite à moins de 1%.

Spinal sectionnement de la moelle chez le poisson zèbre adulte est une technique bien établie et solide pour l'étude de repousse axonale et la neurogenèse après une blessure. En déplaçant cette analyse dans l'organisme larvaire, nous sommes en mesure d'examiner la récupération in vivo. En outre, nous sommes également en mesure d'utiliser des outils génétiques ne sont pas disponibles chez le poisson zèbre adulte d'examiner les rôles des différents gènes dans le processus de régénération, par exemple, Tcf7l1a ^12.

Origine developed d'étudier la neurogenèse suivante moelle sectionnement de la moelle, cette technique peut aussi être utilisée pour examiner la reprise de la fonction sensorielle: les animaux blessés présentent une réponse au toucher caudale au site de la lésion par 2 dpi, et les axones ont traversé le site de la lésion par 5 dpi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm Petri dish	VWR	82050-544
100 mm Petri dish	VWR	89038-968
PDMS, Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Fisher Scientific	NC9644388
borosilicate capillary tubing: OD 1.00 mm, ID 0.78 mm	Warner Instruments Inc.	64-0778
Forceps	Fine Scientific Tools Inc.	11252-30
Disssection microscope	Nikon	SMZ6454
Microgrinder	Narishige	EG-44
Gentamycin Sulfate	Amresco Inc.	0304-5G	dissolve in water 10 mg/ml, store at -20 °C
Tricaine	Acros Organics	118000100
Cotton tipped applicator, wood, 6-inch	Fisher Scientific	23-400-101
1 ml syringe	BD	309625
27 G needle	BD	305109
Fry food	Argent Labs	F-ARGE-PTL-CN	store at -20 °C
Micropipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-97	Box Filament FB330B
20x E2 (1 L); store at RT
17.5 g NaCl	Fisher Scientific	S671-500
0.75 g KCl	Fisher Scientific	P217-500
2.90 g CaCl2·2H2O	Sigma	C7902-500G
4.90 g MgSO4·7H2O	Merck	MX0070-1
0.41 g KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
0.12 g Na2HPO4	Sigma	S0876-500G
500x NaCO3 (10 ml); make fresh, discard extra
0.35 g NaCO3	Sigma	S5761
1x E2 (1 L); store at RT
50 ml 20x E2
2 ml fresh 500x NaCO3