Summary
Nach Durchtrennung des Rücken, erwachsenen Zebrafisch haben die funktionelle Erholung von 6 Wochen nach der Verletzung. Um die Vorteile der Larven Transparenz und schnellere Erholung zu nehmen, stellen wir ein Verfahren zur Durchtrennung des Rückenmarks Larven. Nach Durchtrennung beobachten wir sensorischen Erholung ab 2 Tage nach der Verletzung, und C-Bogen-Bewegung um 3 Tage nach der Verletzung.
Abstract
Säugetiere nicht in sensorischen und motorischen Erholung nach einer Rückenmarksverletzung aufgrund des Fehlens von axonalen Nachwachsen unter dem Niveau von Verletzungen sowie die Unfähigkeit, Rückenneurogenese wieder aufzunehmen. Doch einige anamniotes einschließlich der Zebrafisch Danio rerio Ausstellung auch nach der kompletten Durchtrennung des Rückenmarks sowohl sensorische und funktionelle Wiederherstellung. Die erwachsenen Zebrafisch ist ein Modellorganismus für das Studium Regeneration nach Rückenmarksverletzungen, mit sensorischen und motorischen Erholung von 6 Wochen nach der Verletzung. Um die Vorteile der in vivo Analyse der Regenerationsprozess in der transparenten Larven Zebrafisch als auch genetische Werkzeuge nicht in der Erwachsenen zugänglich zu machen, verwenden wir die Zebrafisch-Larven, um die Regeneration nach Rückenmarksdurchtrennung zu studieren. Hier zeigen wir ein Verfahren zur reproduzierbar und nachweisbar Trennung des Larvenrückenmark. Nach Durchtrennung, zeigt unsere Daten sensorischen Erholung Anfang mit 2 Tagen nach der Verletzung (dpi), Witzh ist der C-Bogen-Bewegung um 3 dpi und die Wiederaufnahme des freien Schwimmen von 5 dpi nachweisbar. So schlagen wir die Zebrafisch-Larven als Begleiter Werkzeug an die erwachsenen Zebrafisch für das Studium der Regeneration nach Rückenmarksverletzungen.
Introduction
Schweres Trauma an den menschlichen Rückenmarks oft zu bleibenden Lähmungen und Gefühlsverlust unterhalb der Ebene der Schädigung aufgrund der Unfähigkeit, die Axone wieder wachsen oder reinitiate Genese 1,2. Im Gegensatz zu Säugetieren, aber anamniotes einschließlich Salamander und Zebrafisch (Danio rerio) zeigen kräftige Erholung auch nach der kompletten Rückenmarksdurchtrennung 3,4.
Die erwachsenen Zebrafisch ist ein gut etabliertes Modell für die Untersuchung der Wiederherstellungsprozess folgende Verletzungen des Rückenmarks 5-7. Nach der vollständigen Durchtrennung des Rückenmarks, ist Wiederherstellung der sensorischen und Lok-Funktion im erwachsenen Zebrafisch von 6 Wochen nach der Verletzung 8 beobachtet. Um den Regenerationsprozess in vivo zu untersuchen, wandten wir uns an der transparenten Larven Zebrafisch-9.
Hier präsentieren wir eine Methode, um das Rückenmark zu durchtrennen eines 5 Tage nach der Befruchtung (DPF) Larvenzebrafisch using eine abgeschrägte Mikroinjektionspipette wie ein Skalpell, von Bhatt geändert, et al. 10. Diese Methode unterstützt hohen Durchsatz, geringe Mortalität und Reproduzierbarkeit. Mit etwas Übung können 300 Larven / h durchtrennt werden, und über 6 Monate von Querschnitten erhalten, darunter mehr als 3.600 Tiere, 98,75% ± 0,72% überlebten bis 7 Tage nach der Verletzung (dpi). Unsere Daten zeigen eine schnelle Wiederherstellung der sensorischen und Fortbewegung als auch: bei 1 dpi, wird jede Bewegung, die der Geschädigte Fisch nur Brustflosse Fortbewegung angetrieben. Allerdings Larven beginnen zu reagieren, um die Nadel zu berühren Schwanztrennung Wolfram von 2 dpi, wiederherzustellen C-Bogen-Bewegung um 3 dpi und zeigen räuberische Schwimm von 5 11 dpi. Mit Antikörperfärbung gegen acetyliertes Tubulin haben wir bestätigt, dass Axone fehlen in der Verletzungsstelle bei 1 dpi, haben aber die Verletzungsstelle um 5 dpi gekreuzt. Wir glauben, dass dieses Protokoll eine wertvolle Technik für die Untersuchung von axonalen Nachwachsen und Neurogenese im Rückenmark nach einer Verletzung bereitzustellen.
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Protocol
Zebrafisch wurden angehoben und nach Standardverfahren gezüchtet; Experimente wurden von der Universität von Utah Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.
1. Vorbereitung für Chirurgie Platten
- Machen Chirurgie Platten mit 60 mm Petrischalen und Sylgard 184 Silikonelastomer Kit nach Herstellerangaben. Füllen Gerichte nicht mehr als halb voll und lassen Sie polymerisieren. Shop abgedeckt bei Raumtemperatur.
2. Herstellung von Mikropipetten
- Fertigen Mikropipetten durch Erhitzen und Ziehen Dünnwand Borosilikat Kapillarrohr in einer Mikropipette Puller mit den gleichen Einstellungen für die Herstellung von Mikroinjektionsnadeln.
- Unter einem Dissektionsmikroskop, snap off Spitze des Mikropipette auf ca. 200 um im Durchmesser mit einer Pinzette.
- Kegel gebrochene Kante mit einem microgrinder zunächst auf 35 °, gefolgt von einer zweiten Abschrägung bei 25 °. Stellen Sie sicher, Spitze ist scharf und smooth. Laden beendet abgeschrägten Mikro in einer Petrischale auf einer kleinen Menge von Ton.
3. Vorbereitung der Zebrafisch-Larven
- 7 Tage vor der Operation, bis Gegen Tanks von männlichen und weiblichen Zebrafisch gesetzt.
- Sammeln Embryonen am folgenden Morgen, 3 h nach die Lichter angehen, um maximalen Ertrag zu gewährleisten. Bei Verwendung eines transgenen Reporter Linie wie Tg (elevl3: eGFP) knu3, sortieren befruchteten Embryonen 100/100 mm-Platte in 25 ml E3 bei 28,5 ° C. Bei der Verwendung von Wildtyp, Art befruchteten Embryonen 25/100 mm-Platte in 25 ml E3 bei 28,5 ° C.
- Wenn Sie einen Reporter Linie, Bildschirm Embryonen für Leuchtstofflampen Ausdruck bei 48 hpf. Ermöglichen identifiziert Embryonen bei einer Dichte von 25/100 mm Platte in 25 ml E3 bei 28,5 ° C reifen
- Als Larven sind 5 dpf, bereiten Chirurgie Platte durch Abdecken mit Sylgard E2 + 10 mg / L Gentamycin Sulfat (GS) + Tricaine.
- Bereiten Erholung Gericht durch Zugabe von 25 ml E2 + GS in einen 100-mm-Petri dish.
- Bereiten Skalpell durch Abkleben zusammen drei Tupfer. Dadurch wird eine dreieckige Werkzeug mit drei Nuten zu bilden.
- Montieren Sie eine Mikropipette vorbereitet auf den Tupfer durch Abkleben es in eine der Rillen.
- Bei Wiederverwendung Mikropipetten, spülen, bis klar mit E2 + GS mit einer 1 ml-Spritze und einer 27 G-Nadel vor der Montage auf Tupfer.
4. Chirurgie
- Anesthetize 1 Platte von Larven in einer Zeit (25 Fische) mit Tricaine. Die Fische werden ausreichend betäubt, wenn sie Touch-Reaktion nicht mehr ausstellen. Es ist wichtig, dass die Fische vor der Operation vollständig betäubt, sonst werden sie zucken, wenn sie das Skalpell berührt. Die Operation wird unter einem Mikroskop Dissektion durchgeführt.
- Übertragen Larven der Operation Platte.
- Bei maximaler Vergrößerung, drehen eine Larve in einer Zeit, so dass es auf seiner Seite liegt mit dem Rücken am nächsten an der Hand, die das Skalpell.
- Zange Position, so dass sie auf der Sylgard ruhen,abgewinkelt über die Breite der Larve.
- Verspannen des Glas Skalpell gegen einen der Arme der Zange, schneiden in den dorsalen Seitenfläche der Larve auf der Ebene der analen Poren, wird Sie sicher nicht über die ventralen Rand der Chorda geschnitten. Drehen Sie das Skalpell, um das Rückenmark zu durchtrennen.
- Wiederholen Sie mit den restlichen Larven.
Hinweis: Wenn eine Larve blutet, wird es nicht von der Operation zu erholen. Die Larve sofort entfernen von der Operation Platte und einschläfern es über Tricaine Überdosis.
- Nach der Operation an der Charge von Larven abgeschlossen ist, die Übertragung der Erholung Platte verletzte Tiere. Dies ist auf die Lichtung der Anästhesie unterstützen.
- Achtung: Bei der Erfassung verletzt Larven für den Transfer, sicherzustellen, dass sie Kopf oder Schwanz zunächst gesammelt: die Schadens Website nicht betonen, durch Biegen der Larven.
Anmerkung: Alle für die Operation verwendeten Vorrichtungen wiederverwendet werden können, einschließlich der Mikropipetten.
- Achtung: Bei der Erfassung verletzt Larven für den Transfer, sicherzustellen, dass sie Kopf oder Schwanz zunächst gesammelt: die Schadens Website nicht betonen, durch Biegen der Larven.
5. Rettung
- Transfer verletzt Larven von der Erholung Platte auf 100-mm-Platten mit 25 ml E2 + GS bei einer Dichte von 25/plate gefüllt. Lassen Sie in einem 28,5 ° C Inkubator erholen.
- Überprüfen Sie täglich Platten, Entfernen kranker und toter Tiere. Sie verändern die Medien erst Coleps (Süßwasser Protozoen) in den Medien zu sehen sind. Beim Wechsel der Medien, nicht die Fische auf eine neue Platte übertragen; statt, entfernen Sie so viel wie möglich und Medien überfluten die gleiche Platte mit neuen Medien. Bei Bedarf wiederholen, um Coleps Bevölkerung zu reduzieren.
- Feed-täglich mit einer kleinen Menge von pulverförmigen Lebensmitteln braten.
Hinweis: Lebendfutter (zB Pantoffeltierchen oder Rädertierchen) nicht zu verletzten, bis Larven, nachdem sie die Fortbewegung wiederzugeführt werden. Andernfalls wird das Lebendfutter die Verletzungsstelle besiedeln und töten die Larven.
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Representative Results
Um die Schwere der Gewebeschädigung die Verletzungsstelle umgebenden reduzieren, ist die richtige Abschrägung der Mikropipette kritisch. 1A zeigt eine korrekt abgeschrägte Spitze. Mit einem Tipp, der zu breit ist (Abbildung 1B) neigt dazu, in höheren Todesopfer führen durch die erhöhte Wahrscheinlichkeit von nicking die dorsale Aorta, während ein Tipp, der zu schmal ist (Abbildung 1C) neigt dazu, Blick von der Haut statt Schneiden von Gewebe.
Um diese Technik zu üben, ist es vorteilhaft, einen Reporter Leitung zB Tg (elevl3: eGFP) knu3 um das Rückenmark zu visualisieren 2A zeigt eine vollständig durchtrennten Rückenmark von einer Live-Tg (elevl3: eGFP). Zebrafisch bei 1 dpi, . während 2B zeigt die gleiche lebende Fische bei 3DPI 2C und 2D zeigen die Vergrößerung auf die verletzte Stelle bei 3 dpi in festen Tg (dbx1a: eGFP) Fische mit Cosolute (2C) oder unvollständig (2D) Rückenmarksdurchtrennung. Beachten Sie den zusammenhängenden Bereich von Neuron Kennzeichnung entlang der ventralen Rand des Rückenmarks (gelber Pfeil).
Abbildung 1. Vergleich Skalpell Kanten. A zeigt einen richtig schrägen Mikropipettenspitze für Chirurgie. Diese Größe wird leicht zur Wiederverwendung gereinigt. B zeigt eine abgeschrägte Mikropipettenspitze zu breit für die Operation auf einer 5 dpf Larve. C ist ein Beispiel für eine Spitze, die zu schmal ist. Diese Größe ist sehr schwierig, für die Wiederverwendung zu reinigen, und neigt dazu, eine Säge-Aktion Trennung statt Schneid fördern D:. Cartoon der Läsion Werkzeuganordnung. Three 6 "Tupfer werden in einem verschachtelten pyramidal Form und mit Klebeband zusammen. Das Skalpell ruht in einer der durch die drei Tupfer gebildeten Nuten, und an Ort und Stelle geklebt.
.. Fische in vivo bei 1 dpi (A) und 3DPI (B): Abbildung 2 komplette Durchtrennung Überprüfen Fluorescent konfokalen Mikroskopie wurde an Live-Bild Tg (eGFP elavl3) verwendet. Um eine vollständige Durchtrennung zu bestätigen, wurden diese dann in Bildstapeln ImageJ verarbeitet (rsbweb.nih.gov) bis Maximum Intensity Projections (MaxZ), wie in A gezeigt erzeugen - B C - D zeigen MaxZ Projektionen HuC / D beschriftet Tg (dbx1a.: eGFP) Fische bei 3 dpi mit kompletten Rückenmarksdurchtrennung (C) oder unvollständige Durchtrennung (D).Gelbe Pfeile identifizieren Verletzungsstelle, D = Rücken-, R = rostral. Maßstabsbalken = 100 um.
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Discussion
Wenn zunächst das Erlernen dieser Technik, empfehlen wir versuchen nicht mehr als 50-100 Querschnitten erhalten in einer einzigen Sitzung. Nach Beherrschung dieser Technik sind wir in der Lage, bis 300 Embryonen pro Stunde durchschneiden sich; aber dieses Niveau der Durchsatz erfordert ein paar Monaten der wöchentlichen Praxis. Wir empfehlen auch, gemeinsam mit einem Reporter-Linie und Überprüfung komplette Durchtrennung bis das Auftreten von unvollständiger Durchtrennung des Rückenmarks auf weniger als 1% reduziert.
Durchtrennung des Rückenmarks in der erwachsenen Zebrafisch ist eine gut etablierte und robuste Technik zur Untersuchung der axonalen Nachwachsen und Neurogenese nach der Verletzung. Durch Bewegen dieser Analyse in die Larven Organismus, wir sind in der Lage, Erholung in vivo zu untersuchen. Darüber hinaus sind wir auch in der Lage, genetische Werkzeuge nicht in der erwachsenen Zebrafisch zu nutzen, um die Rolle der verschiedenen Gene in der regenerativen Prozess zu untersuchen, z. B. Tcf7l1a 12.
Ursprünglich dntwickelt Neurogenese nach Durchtrennung des Rückenmarks zu studieren, kann diese Technik auch zur Wiederherstellung der sensorischen Funktion zu prüfen: verletzte Tiere zeigen eine Reaktion auf die Schwanz zum Ort der Verletzung von zwei dpi berühren, und Axone haben die Verletzungsstelle um 5 dpi gekreuzt.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir sind auf die Universität von Utah Zebrafisch-Anlage für die Tierhaltung verschuldet. RID wurde von NIH R56NS053897 unterstützt und LKB war ein Promotions Auszubildenden durch die HHMI Med-In-Grad-Initiative unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm Petri dish | VWR | 82050-544 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 89038-968 | |
| PDMS, Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| borosilicate capillary tubing: OD 1.00 mm, ID 0.78 mm | Warner Instruments Inc. | 64-0778 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools Inc. | 11252-30 | |
| Disssection microscope | Nikon | SMZ6454 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Gentamycin Sulfate | Amresco Inc. | 0304-5G | dissolve in water 10 mg/ml, store at -20 °C |
| Tricaine | Acros Organics | 118000100 | |
| Cotton tipped applicator, wood, 6-inch | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| 1 ml syringe | BD | 309625 | |
| 27 G needle | BD | 305109 | |
| Fry food | Argent Labs | F-ARGE-PTL-CN | store at -20 °C |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Box Filament FB330B |
| 20x E2 (1 L); store at RT | |||
| 17.5 g NaCl | Fisher Scientific | S671-500 | |
| 0.75 g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| 2.90 g CaCl2·2H2O | Sigma | C7902-500G | |
| 4.90 g MgSO4·7H2O | Merck | MX0070-1 | |
| 0.41 g KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| 0.12 g Na2HPO4 | Sigma | S0876-500G | |
| 500x NaCO3 (10 ml); make fresh, discard extra | |||
| 0.35 g NaCO3 | Sigma | S5761 | |
| 1x E2 (1 L); store at RT | |||
| 50 ml 20x E2 | |||
| 2 ml fresh 500x NaCO3 | |||
References
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