幼虫のゼブラフィッシュにおける脊髄切断

Summary

脊髄切断後、大人のゼブラフィッシュは、6週間後損傷によって機能回復を持っている。幼虫の透明性と迅速な復旧を活用するために、我々は、幼虫の脊髄を離断するための方法を提示する。切断後、我々は、3日後に傷害によって2日後の傷害、およびC-曲がり動きで始まる感覚の回復を観察します。

Abstract

哺乳類は軸索損傷のレベル以下の再成長だけでなく、脊髄神経発生を再開することができないことが不足しているため、脊髄損傷後の感覚と運動の回復に失敗します。しかし、脊髄の完全な切断後の感覚と機能回復の両方ゼブラフィッシュゼブラフィッシュの展示を含むいくつかのanamniotes。大人のゼブラフィッシュは、6週間後損傷によって感覚と運動の回復を、脊髄損傷後の再生を研究するための確立されたモデル生物である。透明幼虫ゼブラフィッシュで利用可能な再生過程のin vivo解析だけでなく、大人ではアクセスできません遺伝的なツールを活用するために、我々は脊髄切断後の再生を研究するため、幼虫のゼブラフィッシュを使用しています。ここでは、再現性と検証可能幼虫脊髄を離断するための方法を示しています。切断後、我々のデータは2日後損傷（DPI）から始まる感覚の回復を示しており、ウィット5解像度による自由遊泳の3解像度および再開によって検出可能なH C - 曲げ運動。したがって、私たちは、脊髄損傷後の回復の研究のための大人のゼブラフィッシュのコンパニオンツールとして幼虫のゼブラフィッシュを提案する。

Introduction

人間の脊髄への大きな外傷は、しばしば軸索を再成長や神経新生^1,2を再開することができないことに、永続的な麻痺や損傷のレベル以下の感覚の損失をもたらす。哺乳類とは対照的に、しかし、サンショウウオやゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）を含むanamniotesでも、完全な脊髄切断^の3,4の後に強固な回復を示している。

大人のゼブラフィッシュは、脊髄損傷の^5-7次の回復過程を研究するための十分に確立されたモデルである。完全な脊髄切断後、感覚や機関車の機能の再構築は、損傷後⁸ 6週間で成人のゼブラフィッシュで観察される。 インビボでの再生過程を調べるために、我々は、透明な幼虫のゼブラフィッシュ⁹になった。

ここでは、5日後に受精（DPF）幼虫ゼブラフィッシュUSIの脊髄を横断するための方法を提示バットから変更小刀などの面取りマイクロインジェクションピペットを、、Ng ら^。10この方法は、高スループット、低死亡率、および再現性をサポートしています。練習すれば300幼虫/ HRは横に切開することができ、3600以上の動物を含む離断の6ヶ月間にわたって、0.72％±98.75パーセントは、7日間、損傷後（DPI）まで生存した。我々のデータは、同様に、感覚と運動の急速な回復を示しています。1 dpiで、負傷した魚にすべての動きだけ胸びれ運動によって駆動される。しかし、幼虫は、2解像度によって離断にタッチ尾針タングステンに反応する3解像度によるC曲げ運動を再確立し、5解像度¹¹で捕食水泳を表示し始める。アセチル化チューブリンに対する抗体染色を用いて、我々は、軸索は1 dpiで損傷部位には存在しないことを確認したが、5解像度によって損傷部位を横断している。我々は、このプロトコルは、損傷後の脊髄における軸索再生および神経発生の研究のための貴重な技術を提供すると確信しています。

Protocol

ゼブラフィッシュは、標準的な手順に従って上昇して飼育した。実験は、ユタ大学の機関動物実験委員会によって承認された。

外科プレートの1。準備

1. 製造者の指示に従って、60ミリメートルペトリ皿とシルガード184シリコーンエラストマーキットを使用した手術プレートを作成します。ハーフフル超えない料理を記入し、重合させることができます。ストアは、室温でカバーした。

マイクロピペットの2。準備

1. 加熱およびマイクロインジェクションの針を作るために同じ設定を使用してマイクロピペットプラーで薄肉ホウケイ酸キャピラリーチューブを引っ張ってマイクロピペットを製作。
2. 解剖顕微鏡下では、ピンセットで直径約200μmのマイクロピペットの先端をオフにスナップします。
3. 25℃で第二面取りが続く35°に最初にmicrogrinderとベベル壊れエッジ。先端が鋭く、SMOであることを確認してくださいOTH。ストアは、粘土を少量にペトリ皿に傾斜したマイクロピペットを終えた。

ゼブラフィッシュ幼生の3。準備

1. 手術前7日間は、男性と女性のゼブラフィッシュの合わせタンクを設置しました。
2. ライトは最大収率を確保するために点灯3時間後、翌朝の胚を収集します。 28.5℃で、E3の25ミリリットル中^knu3、ソート受精胚100/100 mmプレート：などのTg（EGFP elevl3）トランスジェニックレポーターラインを使用している場合28.5℃で、E3の25ミリリットル中の野生型を使用している場合は、ソート受精胚100分の25 mmプレート
3. リポーターラインを使用している場合は、48 HPFの蛍光式の胚を選別。識別された胚は28.5℃で、E3の25ミリリットルで100分の25 mmプレートの密度で成熟することができます
4. 幼虫は5 DPFである場合には、E2 + 10 mg / Lの硫酸ゲンタマイシン（GS）+トリカインでシルガードを覆うことにより、手術プレートを準備します。
   1. 100ミリメートルペトリDISに25ミリリットルのE2 + GSを追加することで、回復の料理を準備しますH。
   2. 一緒に3綿棒をテーピングでメスを準備します。これは、3つの溝を有する三角形のツールを形成する。
   3. 溝の1にそれをテープで綿棒に準備されたマイクロピペットをマウントします。
5. 1ミリリットル注射器や綿棒に取り付ける前に27 G針を使用して、E2 + GSで透明になるまでフラッシュ、マイクロピペットを再利用する場合。

4。手術

1. トリカインとの時間（25 FISH）で幼虫の1プレートを麻酔。彼らはもはやタッチ応答を示さないときに魚が十分に麻酔する。それは、メスが接触した場合に、それ以外の場合はけいれんし、魚が完全に手術前に麻酔をかけることが重要です。手術は、解剖顕微鏡下で行われる。
2. 手術プレートに幼虫を移します。
   1. それはメスを持つ手に、その背中に最も近いとの側にあるように、最大​​倍率の下では、一度に1幼虫を回転させる。
   2. それらはシルガードに載るように位置が、鉗子幼虫の幅にわたって傾斜し。
   3. 鉗子のアームの1に対するガラスメスをブレー​​ス、必ず脊索の腹側縁部を越えて切らないようなので、肛門毛穴のレベルで幼虫の背側面にカット。脊髄を切断するメスをねじります。
   4. 残りの幼虫を繰り返します。
      注意：幼虫出血した場​​合、それは手術から回復しません。すぐに手術プレートから幼虫を削除し、トリカインの過剰摂取を経由して、それを安楽死させる。
3. 幼虫のバッチの手術が完了すると、転送が回復板に動物が負傷した。これは麻酔のクリアをサポートすることです。
   1. 注意：転送のため負傷した幼虫を収集する際、彼らが最初に頭や尾を収集していることを確認してください。幼虫を折り曲げて損傷部位を圧迫することはありません。
      注：手術のために使用するすべてのデバイスは、マイクロピペットを含め、再利用することができます。

5。復旧

1. TR25/plateの密度で、25ミリリットルE2 + GSが充填された100mmプレートに回収プレートからansfer負傷幼虫。 28.5℃のインキュベーターで回復することができます。
2. 病気や死んだ動物を除去し、日々のプレートを確認してください。 Coleps（淡水原虫）がメディアに表示されるまで、メディアを変更しないでください。メディアを変更する場合は、新しいプレートに魚を転送しない。代わりに、可能な限り多くのメディアを削除し、新しいメディアと同じプレートをあふれさせる。 Colepsの人口を減らすために、必要に応じて繰り返します。
3. 粉末状の稚魚食品の少量を毎日食べます。
   注意：ライブ食品（ 例えば 、ゾウリムシやワムシ）は、彼らが運動を回復した後まで負傷した幼虫に供給することができません。それ以外の場合は、ライブ食べ物は損傷部位を植民地化し、幼虫を殺すでしょう。

Representative Results

損傷部位の周囲の組織損傷の重症度を低減するために、マイクロピペットを適切に面取りが重要である。 図1（a）は正しくベベル先端を示している。広すぎる先端（ 図1B）を使用することで（ 図1C）が狭すぎる先端ながら、原因背側大動脈のニッキング可能性の増大に高い死亡者が発生する傾向がある肌オフ一目ではなく、組織を切断する傾向がある。

この手法を実施するために、そのようなTgの（elevl3：eGFPの）などのレポーターラインを使用することが有利で ​​ある。：1 dpiでゼブラフィッシュ脊髄を可視化する^knu3 図2Aは、ライブのTg（eGFPをelevl3）の完全離断脊髄を示す図2Bは、3dpiで同じ生きた魚を示して2Cおよび2Dは ​​固定TG（dbx1a：EGFP）で3 dpiで、損傷部位の高倍率を示している。魚たCOmplete（ 図2C）または不完全（ 図2D）脊髄離断。脊髄（黄色の矢印）の腹側縁に沿ってニューロン標識連続した領域に注意してください。

図1。メスエッジの比較Aが手術に適し正しく面取りマイクロピペットチップを示しています。このサイズは、容易に再利用するために洗浄される。Bは 5 DPFの幼虫の手術のために広すぎる面取りマイクロピペットチップを示しています。Cが狭すぎるチップの一例です。このサイズは再使用のためにきれいにすることは非常に困難であり、代わりに、切断の離断のソーイング作用を促進する傾向があるD：lesioningツールアセンブリの漫画。三つの6 "綿棒はPYにネストされています形状をramidalと一緒にテープで固定。小刀は3綿棒によって形成された溝の一つにかかっている、所定の位置にテープで固定されている。

図2の完全な離断の確認蛍光共焦点顕微鏡、画像、ライブTG（elavl3：EGFP）を使用した。1解像度（A）は 、生体内で魚や3dpi（B）。 B C - -完全な離断を確認するために、これらの画像スタックは、その後に示されるように（rsbweb.nih.gov）最大強度の投射（MaxZ）を生成するImageJの中で処理されたHUC / DのD表示MaxZの突起がTG（dbx1aのラベル。：完全な脊髄離断（C）または不完全な離断（D）と3 dpiでEGFP）魚。黄色の矢印は、損傷部位を特定し、D =背、R =吻側。 = 100ミクロンスケールバー。

Discussion

当初はこの手法を学習するとき、我々は、単一のセッションにはもう50〜100以上の離断をしようとしてお勧めします。このテクニックをマスターした後、我々は時間当たり300胚まで横断することができます。しかし、スループットのレベルは、毎週の練習の数ヶ月を必要とします。また、レポーター線と練習および不完全脊髄切断の発生率が1％未満になるまで完全に離断を検証することをお勧めします。

大人のゼブラフィッシュにおける脊髄切断は、損傷後の軸索再生および神経発生を研究するための十分に確立された、堅牢な手法である。幼虫の生物にこの分析を移動させることにより、我々は、 インビボでの回復を検討することができる。さらに、我々はまた、 例えば 、再生過程でTcf7l1a ^12を種々の遺伝子の役割を調べるために大人のゼブラフィッシュでは使用できない遺伝的なツールを利用することができる。

もともとD負傷した動物は2解像度により損傷部位への尾に触れる応答を示し、軸索は5解像度によって損傷部位を越えた：脊髄離断以下の神経新生を研究するためにeveloped、この技術はまた、感覚機能の回復を調べるために使用することができる。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm Petri dish	VWR	82050-544
100 mm Petri dish	VWR	89038-968
PDMS, Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Fisher Scientific	NC9644388
borosilicate capillary tubing: OD 1.00 mm, ID 0.78 mm	Warner Instruments Inc.	64-0778
Forceps	Fine Scientific Tools Inc.	11252-30
Disssection microscope	Nikon	SMZ6454
Microgrinder	Narishige	EG-44
Gentamycin Sulfate	Amresco Inc.	0304-5G	dissolve in water 10 mg/ml, store at -20 °C
Tricaine	Acros Organics	118000100
Cotton tipped applicator, wood, 6-inch	Fisher Scientific	23-400-101
1 ml syringe	BD	309625
27 G needle	BD	305109
Fry food	Argent Labs	F-ARGE-PTL-CN	store at -20 °C
Micropipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-97	Box Filament FB330B
20x E2 (1 L); store at RT
17.5 g NaCl	Fisher Scientific	S671-500
0.75 g KCl	Fisher Scientific	P217-500
2.90 g CaCl2·2H2O	Sigma	C7902-500G
4.90 g MgSO4·7H2O	Merck	MX0070-1
0.41 g KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
0.12 g Na2HPO4	Sigma	S0876-500G
500x NaCO3 (10 ml); make fresh, discard extra
0.35 g NaCO3	Sigma	S5761
1x E2 (1 L); store at RT
50 ml 20x E2
2 ml fresh 500x NaCO3