Summary
척추 절개 한 후, 성인 zebrafish의 육주 후 손상에 의한 기능 회복이있다. 유생의 투명성과 빠른 복구를 이용하려면, 우리는 애벌레 척수에 병행하는 방법을 제시한다. 절개 한 후, 우리는 3 일 후 부상으로 이일 후 상해에서 시작 감각 회복을 관찰하고 C-굴곡 운동.
Abstract
포유 동물에 의한 부상의 수준 이하로 축삭 재성장의 부족뿐만 아니라 척추 신경을 재개하는 무능력에 척수 손상을 다음과 감각과 운동 회복에 실패합니다. 그러나, 척수의 완전 절개 후 감각과 기능 회복을 모두 제브라 다니오의 rerio 전시 등 일부 anamniotes. 성인 zebrafish의 6 주 후 부상으로 감각과 운동 회복, 척수 손상 후 재생을 연구하기위한 설립 모델 생물이다. 투명 애벌레 제브라 피쉬에서 사용할 수있는 재생 과정의 생체 내 분석의 장점뿐만 아니라 성인의 유전 도구에 액세스 할 수 없습니다를 사용하려면, 우리는 척수를 절단 한 후 재생을 연구하는 애벌레 제브라 피쉬를 사용합니다. 여기에서 우리는 재생 가능하고 검증 가능한 애벌레 척수에 병행하는 방법을 보여줍니다. 절개 한 후, 우리의 데이터도 2 일 후 부상 수 (dpi)에 감각 복구 시작을 보여줍니다, 재치H 3 dpi로 5 dpi로 무료 수영의 재개에 의해 검출 C-굽힘 운동. 따라서 우리는 척수 손상 후 복구의 연구를위한 성인 제브라 피쉬에 동반자 도구로 애벌레 제브라 피쉬를 제안한다.
Introduction
인간의 척수에 큰 외상은 종종 인해 축삭을 자라게 또는 신경 1,2를 재개 할 수 없다는으로, 영구적 인 마비와 부상의 수준 이하로 감각의 손실이 발생합니다. 포유 동물과는 달리, 그러나, 도롱뇽과 제브라 피쉬 (다니오 rerio) 등의 anamniotes도 완전 척수 절개 3,4 후 강력한 회복을 보여줍니다.
성인 zebrafish의 척수 손상 5-7 다음 복구 프로세스를 연구하기위한 기초가 튼튼한 모델입니다. 완전 척수를 절단 한 다음, 감각 및 기관차 기능의 회복은 육주 후 부상 (8)에 의해 성인 제브라 피쉬에서 관찰된다. 생체 내 재생 과정을 조사하기 위해, 우리는 투명 유생 제브라 9 돌렸다.
여기서 우리는 오일 후 수정 (DPF) 애벌레 제브라 피쉬의 USI의 척수를 절개하는 방법을 제시한다밧의에서 수정 메스로 경 사진 미세 주입 피펫을,, 겨 등. 10이 방법은 높은 처리량, 낮은 사망률과 재현성을 지원합니다. 연습으로, 300 유생 / 시간은 가로로 할 수 있으며, 98.75 % 0.72 % ± 3,600 이상의 동물을 포함 transections 6 개월 이상, 7 일 후 부상 (dpi)로 될 때까지 살아 남았다. 우리의 데이터뿐만 아니라 감각과 운동의 빠른 회복을 보여줍니다 : 1 dpi로에서 부상당한 물고기의 모든 움직임은 가슴 지느러미 운동에 의해 구동된다. 그러나 애벌레 2 dpi로하여 절개에 바늘 터치 꼬리 텅스텐에 응답하기 시작, 3 dpi로하여 C-굽힘 운동을 다시 설정하고, 5 dpi로 (11)에 의해 약탈 수영을 표시합니다. 아세틸 튜 불린에 대한 항체 염색법을 사용하여, 우리는 축삭 1 dpi 해상도에서 부상 사이트에서없는 것을 확인했지만, 5 dpi로하여 부상 사이트를 넘었다. 우리는이 프로토콜은 다음과 같은 부상 척수에있는 축삭 재성장과 신경의 연구를위한 가치있는 기술을 제공 할 것입니다 믿습니다.
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Protocol
제브라 피쉬는 표준 절차에 따라 제기 자란 있었다; 실험은 유타 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인되었습니다.
수술 플레이트 1. 준비
- 제조업체의 지침에 따라, 60mm 페트리 접시와 실 가드 184 실리콘 엘라스토머 키트를 사용하여 수술 판을 확인합니다. 반 전체보다는 더 이상 요리를 채우고 중합 할 수 있습니다. 스토어는 실내 온도에 덮여.
마이크로 피펫 2. 준비
- 가열 및 마이크로 인젝션 용 바늘을 제조하기위한 동일한 설정을 사용하여 마이크로 피펫 풀러에서 얇은 벽 붕규산 모세관 튜브를 당겨 마이크로 피펫을 제조.
- 해부 현미경, 집게로 직경 약 200 ㎛에 마이크로 피펫의 팁을 떼어냅니다.
- 베벨 깨진 25 °에서의 두 번째 베벨 다음 35 °에 처음 microgrinder와 가장자리. 끝이 날카로운 SMO 있는지 확인OTH. 스토어는 점토의 작은 금액에 페트리 접시에 경 마이크로 피펫을 완료했다.
Zebrafish의 유충 3. 준비
- 수술 전에 7 일, 남성과 여성의 제브라 피쉬의 짝짓기 탱크를 설정합니다.
- 조명이 최대 수율을 보장하기 위해 어서 3 시간 후, 다음날 아침 배아를 수집합니다. knu3, 28.5 ℃에서 일종의 수정 된 배아 100분의 100 mm 플레이트 E3 25 ㎖의 : 같은 Tg는 (EGFP elevl3)와 같은 유전자 변형 기자 라인을 사용하는 경우 야생형를 사용하는 경우, 정렬 28.5 ℃에서 E3의 25 ㎖에 태아에게 100분의 25 mm 플레이트를 기름지게
- 기자 회선을 사용하는 경우, 48 HPF에서 형광 발현에 대한 배아를 화면. 확인 된 배아는 28.5 ℃에서 E3의 25 ㎖에 1백분의 25 mm 플레이트의 밀도로 성숙 할 수 있도록 허용
- 유충은 5 DPF 경우, E2 + 10 ㎎ / L 겐타 마이신 황산염 (GS) + Tricaine과 실 가드을 포함하여 수술 판을 준비합니다.
- 100mm 페트리 표시에 25 ㎖의 E2 + GS를 추가하여 복구 요리를 준비합니다아.
- 함께 세 면봉 테이핑으로 메스를 준비합니다. 이 세 가지 홈이 삼각형 도구를 형성 할 것이다.
- 홈 중 하나에 테이핑하여 면봉에 준비된 마이크로 피펫을 장착합니다.
- E2 + GS와 지우기가 1 ㎖ 주사기 전에 면봉에 설치에 27 G 바늘을 사용하여 때까지 플러시 마이크로 피펫을 다시 사용합니다.
4. 수술
- Tricaine와 시간 (25 물고기)에서 애벌레의 1 접시를 마취. 더 이상 터치 반응을 전시하지 않을 때 물고기가 충분히 마취됩니다. 그것은 메스 그들에 닿을 때 그렇지 않으면 그들은 트됩니다, 물고기가 완전히 수술 전에 마취하는 것이 중요합니다. 수술은 해부 현미경으로 수행됩니다.
- 수술 판에 유충을 전송합니다.
- 이 메스를 들고 손에의 뒷면에 가까운 측면에 위치하도록 최대 배율에서 한 번에 하나의 유충을 돌립니다.
- 그들은 실 가드에 휴식 있도록 위치, 핀셋유충의 폭에 각도.
- 집게의 팔 중 하나에 유리 메스를 보강, 확인 척색의 복부 가장자리를 넘어 절단하지 않는 것, 항문 구멍의 수준에서 애벌레의 등 측면 얼굴로 절단. 척수를 절단하기 위해 메스를 트위스트.
- 나머지 유충으로 반복합니다.
참고 : 유충이 스며들 경우, 수술에서 회복되지 않습니다. 즉시 수술 판에서 유충을 제거하고 Tricaine의 과다 복용을 통해 안락사.
- 유생의 배치에서 수술이 완료되면, 전송이 복구 플레이트에 동물을 부상. 이 마취의 청산을 지원하는 것입니다.
- 주의 : 전송 부상 애벌레를 수집 할 때, 그들은 먼저 머리 또는 꼬리를 수집하고 있는지 확인 : 유충을 절곡하여 부상 사이트를 강조하지 않습니다.
주 : 수술에 사용 된 모든 장치가 마이크로 피펫을 포함하여 재사용 할 수 있습니다.
- 주의 : 전송 부상 애벌레를 수집 할 때, 그들은 먼저 머리 또는 꼬리를 수집하고 있는지 확인 : 유충을 절곡하여 부상 사이트를 강조하지 않습니다.
5. 복구
- TRansfer 복구 플레이트에서 25/plate의 밀도로 25 ml의 E2 + GS 가득 100mm 접시에 유충을 부상. 28.5 ° C의 배양기에서 복구 할 수 있습니다.
- 병 들고 죽은 동물을 제거, 매일 번호판을 확인합니다. Coleps (담수 원생 동물)가 미디어에 표시 될 때까지 미디어를 변경하지 마십시오. 미디어를 변경하는 경우, 새 접시에 물고기를 전송하지 않는다; 대신, 가능한 한 많은 용지를 제거하고 새로운 미디어와 같은 플레이트를 홍수. Coleps 인구를 줄이기 위해 필요한 경우를 반복합니다.
- 가루 튀김 식품의 소량의 일일 사료.
참고 : 라이브 음식 (예를 들면, paramecia 또는 로티퍼)는 그들이 운동을 회복 할 때까지 부상 유충에 공급 될 수 없다. 그렇지 않으면, 라이브 음식은 부상 사이트를 식민지화하고 유충을 죽일 것입니다.
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Representative Results
부상 사이트를 주변 조직 손상의 심각도를 감소시키기 위해, 마이크로 피펫의 적절한 베벨 중요합니다. 그림 1A는 제대로 경 팁을 보여줍니다. 너무 좁 팁 (그림 1C)이 아니라 조직을 절단보다 피부 떨어져 눈 경향이있는 동안 너무 넓 팁 (그림 1B)를 사용하면, 때문에 등쪽 대동맥을 새김의 증가 가능성에 높은 사망자가 발생하는 경향이있다.
1 dpi 해상도에서 제브라 피쉬. 그림 2A 라이브의 Tg (EGFP elevl3)의 완전히 가로로 척수를 보여 척수를 시각화하는 knu3 :이 기술을 연습 할 수있는, 이러한 Tg는 (EGFP elevl3)로 리포터 줄을 사용하는 것이 유리하다 . 물고기의 공동을 갖는 그림 2B는 3DPI에서 같은 활어를 표시하면서 2C 및 2D는 (EGFP dbx1a) 고정의 Tg 3 dpi로의 부상 사이트의 높은 배율을 보여준다mplete (그림 2C) 또는 불완전 (그림 2D) 척수 절개. 척수 (노란색 화살표)의 복부 가장자리를 따라 신경 세포의 라벨의 인접 영역을 확인합니다.
메스 가장자리의 그림 1. 비교. 수술에 적합한 올바르게 경 마이크로 피펫 팁을 보여줍니다. 이 크기는 쉽게 재사용을 위해 세척한다. B는 5 DPF 유충에 수술을 위해 너무 넓은 경 사진 마이크로 피펫 팁을 보여줍니다. C는 너무 좁 팁의 예입니다. 이 크기는 재사용을 위해 청소하기가 매우 어렵고, 대신 절단 절개의 절단 작용을 촉진하는 경향이 D :. lesioning 도구 어셈블리의 만화. 세 6 "면봉는 평에 중첩 된모양과 함께 녹화를 ramidal. 메스 세 면봉에 의해 형성된 홈의 하나에 달려있다, 장소에 녹화됩니다.
.. 물고기 생체 내에서 1 dpi로 (A)와 3DPI (B)에서 그림 2 완전 절개를 확인 형광 공 초점 현미경은 이미지 라이브의 Tg (EGFP elavl3)에 사용되었다. B C - - 완전 절개를 확인하기 위해, 이러한 이미지 스택은 다음과 같이 (rsbweb.nih.gov) 최대 강도 예측 (MaxZ)를 생성하기 위해 ImageJ에 처리 된 HUC / D의 D 쇼 MaxZ 예측이의 Tg (dbx1a을 표시. : 전체 척추 절개 (C) 또는 완전 절개 (D) 3 dpi 해상도에서 EGFP) 물고기.노란색 화살표가 부상 사이트를 식별, D = 지느러미, R = 주동이. = 100 μm의 스케일 바.
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Discussion
처음에이 기술을 학습 할 때, 우리는 하나의 세션에서 더 이상 50 ~ 100 이상 transections을 시도하는 것이 좋습니다. 이 기술을 마스터 한 후, 우리는 시간 당 300 배아까지 절개 할 수있다; 그러나, 처리량이 수준의 주간 연습의 몇 개월을 필요로합니다. 우리는 또한 기자 라인을 연습하고 불완전 척수 절개의 빈도가 1 % 이하로 감소 될 때까지 완전 절개를 확인하는 것이 좋습니다.
성인 제브라 피쉬의 척수 절개는 부상 후 축삭 재성장과 신경을 공부 잘 설립하고 강력한 기술이다. 애벌레 유기체로이 분석을 이동하여, 우리는 생체 내에서 복구를 검사 할 수 있습니다. 또한, 우리는 또한, 예를 들어, 재생 과정에서 Tcf7l1a 12 다양한 유전자의 역할을 검토하는 성인 제브라 피쉬에서 사용할 수없는 유전 적 도구를 활용할 수 있습니다.
원래 D부상당한 동물은 2 dpi로하여 부상 사이트에 꼬리를 터치에 대한 응답을 보여 축삭 5 dpi로하여 부상 사이트를 교차했습니다 척수를 절단 한 다음 신경을 연구하기 위해 eveloped,이 기술은 또한 감각 기능의 회복을 검사하는 데 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는 동물 사육에 대한 유타 대학의 제브라 피쉬의 시설에 빚이있다. RID는 NIH R56NS053897에서 지원하고, LKB는 HHMI 메드 - 속 - 대학원 사업에 의해 지원 predoctoral 연수생이었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm Petri dish | VWR | 82050-544 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 89038-968 | |
| PDMS, Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| borosilicate capillary tubing: OD 1.00 mm, ID 0.78 mm | Warner Instruments Inc. | 64-0778 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools Inc. | 11252-30 | |
| Disssection microscope | Nikon | SMZ6454 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Gentamycin Sulfate | Amresco Inc. | 0304-5G | dissolve in water 10 mg/ml, store at -20 °C |
| Tricaine | Acros Organics | 118000100 | |
| Cotton tipped applicator, wood, 6-inch | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| 1 ml syringe | BD | 309625 | |
| 27 G needle | BD | 305109 | |
| Fry food | Argent Labs | F-ARGE-PTL-CN | store at -20 °C |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Box Filament FB330B |
| 20x E2 (1 L); store at RT | |||
| 17.5 g NaCl | Fisher Scientific | S671-500 | |
| 0.75 g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| 2.90 g CaCl2·2H2O | Sigma | C7902-500G | |
| 4.90 g MgSO4·7H2O | Merck | MX0070-1 | |
| 0.41 g KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| 0.12 g Na2HPO4 | Sigma | S0876-500G | |
| 500x NaCO3 (10 ml); make fresh, discard extra | |||
| 0.35 g NaCO3 | Sigma | S5761 | |
| 1x E2 (1 L); store at RT | |||
| 50 ml 20x E2 | |||
| 2 ml fresh 500x NaCO3 | |||
References
- Houweling, D. A., Bär, P. R., Gispen, W. H., Joosten, E. A. Spinal cord injury: bridging the lesion and the role of neurotrophic factors in repair. Progress in brain research. 117, 455-471 (1998).
- Mikami, Y., et al. Implantation of dendritic cells in injured adult spinal cord results in activation of endogenous neural stem/progenitor cells leading to de novo neurogenesis and functional recovery. Journal of neuroscience research. 76 (4), 453-465 (2004).
- Chernoff, E. A. G., Sato, K., Corn, A., Karcavich, R. E. Spinal cord regeneration: intrinsic properties and emerging mechanisms. Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 361-368 (2002).
- Kuscha, V., Barreiro-Iglesias, A., Becker, C. G., Becker, T. Plasticity of tyrosine hydroxylase and serotonergic systems in the regenerating spinal cord of adult zebrafish. The Journal of comparative neurology. 520 (5), 933-951 (2012).
- Becker, C. G., Lieberoth, B. C., Morellini, F., Feldner, J., Becker, T., Schachner, M. L1.1 is involved in spinal cord regeneration in adult zebrafish. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (36), 7837-7842 (2004).
- Hui, S. P., Dutta, A., Ghosh, S. Cellular response after crush injury in adult zebrafish spinal cord. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 239 (11), 2962-2979 (2010).
- Goldshmit, Y., Sztal, T. E., Jusuf, P. R., Hall, T. E., Nguyen-Chi, M., Currie, P. D. Fgf-dependent glial cell bridges facilitate spinal cord regeneration in zebrafish. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7477-7492 (2012).
- Reimer, M. M., et al. Motor neuron regeneration in adult zebrafish. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).
- Hale, M. E., Ritter, D. A., Fetcho, J. R. A confocal study of spinal interneurons in living larval zebrafish. The Journal of comparative neurology. 437 (1), 1-16 (2001).
- Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
- McClenahan, P., Troup, M., Scott, E. K. Fin-tail coordination during escape and predatory behavior in larval zebrafish. PloS one. 7 (2), (2012).
- Kim, C. H., et al. Repressor activity of Headless/Tcf3 is essential for vertebrate head formation. Nature. 407 (6806), 913-916 (2000).
