Spinal Cord tran i Larve Sebrafisk

Summary

Etter spinal transection, voksen sebrafisk har funksjonell bedring etter seks uker etter skade. For å dra nytte av larve åpenhet og raskere restitusjon, presenterer vi en metode for transecting larveryggmargen. Etter tran, observerer vi sensorisk utvinning begynner på to dager etter skade, og C-bend bevegelse av tre dager etter skade.

Abstract

Pattedyr mislykkes i sensorisk og motorisk gjenvinning etter ryggmargsskade på grunn av mangel av aksonal gjenvekst under nivået for skaden, så vel som en manglende evne til å gjenoppta spinal neurogenesis. Men noen anamniotes inkludert sebrafisk Danio rerio utstillings både sensoriske og funksjonell utvinning selv etter fullstendig transection av ryggmargen. Den voksne sebrafisk er en etablert modellorganisme for å studere regenerering etter ryggmargsskade, med sensoriske og motoriske utvinning av seks uker etter skade. For å dra nytte av in vivo analyse av regenerativ prosess tilgjengelig i den gjennomsiktige larvesebrafisk samt genetiske verktøy ikke er tilgjengelig i den voksne, bruker vi larvesebrafisk for å studere regenerering etter ryggmargen transection. Her viser vi en metode for reproduserbart og beviselig transecting larveryggmargen. Etter tran, viser våre data sensoriske utvinning begynnelsen på to dager etter skade (dpi), viddh C-svingen bevegelse påvises ved tre dpi og gjenopptakelse av gratis svømming ved 5 dpi. Dermed foreslår vi larvesebrafisk som en følgesvenn verktøy til den voksne sebrafisk for studiet av bedring etter ryggmargsskade.

Introduction

Store skader i det menneskelige ryggmargen ofte resulterer i permanent lammelse og tap av følelse under nivået for skade, på grunn av den manglende evne til å vokse axoner eller gjen neurogenesis ^1,2. I motsetning til pattedyr, men anamniotes inkludert salamandere og sebrafisk (Danio rerio) viser robust utvinning selv etter fullstendig ryggmargen transection ^3,4.

Den voksne sebrafisk er en godt etablert modell for å studere gjenopprettingsprosessen etter ryggmargsskade ^5-7. Etter fullført ryggmargen transection, er reetablering av sensorisk og lokomotivfunksjonen observert i den voksne sebrafisk ved 6 uker etter skade ^åtte. For å undersøke regenerativ prosess in vivo, snudde vi til det gjennomsiktige larvesebrafisk ^ni.

Her presenterer vi en metode for å skjære over ryggmargen av en fem dager etter befruktning (DPF) larvesebrafisk Using en avfaset mikroinjeksjon pipette som en skalpell, modifisert fra Bhatt, et al. ^10. Denne metoden støtter høy gjennomstrømning, lav dødelighet, og reproduserbarhet. Med praksis, kan 300 larver / hr bli transected, og over 6 måneder med transections, hvorav over 3600 dyr, 98,75% ± 0,72% overlevde inntil 7 dager etter skade (dpi). Våre data viser rask gjenoppretting av sensorisk og bevegelse i tillegg: ved en dpi, er all bevegelse av skadet fisk drevet av brystfinnen locomotion bare. Men larvene begynner å svare på tungsten nål berøring caudal til transection av to dpi, gjenopprette C-bend bevegelse av tre dpi, og vise rov svømming ved 5 dpi ^11. Bruke antistoffarging mot acetylert tubulin, har vi bekreftet at axons er fraværende fra skadestedet på en dpi, men har krysset skade området ved 5 dpi. Vi tror denne protokollen vil gi en verdifull teknikk for studiet av aksonal gjenvekst og neurogenesis i ryggmargen etter skade.

Protocol

Sebrafisk ble hevet og avlet i henhold til standard prosedyrer; Forsøkene ble godkjent av University of Utah Institutional Animal Care og bruk komité.

En. Utarbeidelse av kirurgi Plates

1. Gjør kirurgi plater ved hjelp av 60 mm petriskåler og Sylgard 184 Silikon Elastomer Kit, etter produsentens anvisninger. Fyll retter ikke mer enn halvfull og la til å polymer. Oppbevares tildekket i romtemperatur.

2. Utarbeidelse av Mikropipetter

1. Dikte mikropipetter ved oppvarming og trekke tynn vegg borsilikat kapillarrør i en mikropipette avtrekker med de samme innstillingene for å lage mikroinjeksjon nåler.
2. Under en disseksjon mikroskop, snap off spissen av micropipette til ca 200 mikrometer i diameter med tang.
3. Skråkant brukket kant med en microgrinder innledningsvis til 35 °, etterfulgt av en andre avfasing på 25 °. Sikre tips er skarp og smooth. Lagres ferdig avfaset mikropipette i en petriskål på en liten mengde leire.

Tre. Utarbeidelse av sebrafisk Larver

1. 7 dager før operasjonen, satt opp parrings stridsvogner av mannlige og kvinnelige sebrafisk.
2. Samle embryoer følgende morgenen, tre timer etter at lysene kommer på å sikre maksimal avkastning. Hvis du bruker en transgen reporter linje som Tg (elevl3: eGFP) ^knu3, sortere befruktede embryoer 100/100 mm plate i 25 ml av E3 på 28,5 ° C. Hvis du bruker villtype, sortere befruktede embryoer 25/100 mm plate i 25 ml av E3 på 28,5 ° C.
3. Hvis du bruker en reporter linje, skjermen embryoer for fluorescerende uttrykk ved 48 HPF. Tillat identifiserte embryoer for å modne i en tetthet på 25/100 mm plate i 25 ml E3 ved 28.5 ° C.
4. Når larvene er fem dpf, forberede kirurgi plate ved å dekke Sylgard med E2 + 10 mg / L Gentamycin Sulfate (GS) + Tricaine.
   1. Forbered utvinning tallerken ved å legge til 25 ml E2 + GS til en 100 mm petri dish.
   2. Forbered skalpell ved taping sammen tre vattpinner. Dette vil danne en trekantet verktøy med tre spor.
   3. Monter en forberedt micropipette på vattpinner ved taping det inn ett av sporene.
5. Hvis gjenbruk mikropipetter, flush inntil klar med E2 + GS ved hjelp av en 1 ml sprøyte og en 27 G kanyle før montering på vattpinner.

4. Kirurgi

1. Anesthetize en plate av larver i en tid (25 fisk) med Tricaine. Fisk er tilstrekkelig bedøvet når de ikke lenger vise touch respons. Det er viktig at fisken er helt bedøvet før operasjonen, ellers vil de nappe når skalpell berører dem. Kirurgi er utført under et mikroskop disseksjon.
2. Overfør larver til kirurgi plate.
   1. Under maksimal forstørrelse, rotere én larve om gangen, slik at den ligger på siden med ryggen nærmest hånden som holder skalpell.
   2. Posisjon tang slik at de hviler på Sylgard,vinklet over bredden av larven.
   3. Bracing glasset skalpell mot en av armene av tang, skåret i ryggsideflaten av larven på nivået av den anal pore, å være sikker på ikke å skjære utover den ventrale kant av ryggstreng. Vri skalpell til å kutte ryggmargen.
   4. Gjenta med resten av larver.
      Merk: Hvis en larve blør, vil det ikke komme seg etter operasjonen. Umiddelbart fjerne larven fra operasjonen plate og avlive den via Tricaine overdose.
3. Etter kirurgi på batch av larvene er fullført, overføring skadde dyr til utvinning plate. Dette er for å støtte rydding av anestesi.
   1. Forsiktig: ved innsamling skadet larver for overføring, sørg for at de er samlet hode eller hale første: ikke stress skade området ved å bøye larvene.
      Merk: Alle enheter som brukes for kirurgi kan gjenbrukes, inkludert mikropipetter.

5. Recovery

1. Transfer skadet larver fra oppsamlingsplaten til 100 mm plater som er fylt med 25 ml E2 + GS ved en tetthet på 25/plate. La det komme i en 28.5 ° C inkubator.
2. Sjekk plater daglig, fjerne syke og døde dyr. Ikke endre media før Coleps (ferskvann protozoer) er synlige i media. Ved endring av media, ikke overføre fisken til en ny plate; stedet, fjerne så mye media som mulig og oversvømme den samme platen med nye medier. Gjenta om nødvendig for å redusere Coleps befolkningen.
3. Strøm daglig med en liten mengde pulverisert fry mat.
   Merk: Levende mat (f.eks Paramecia eller rotatorier) kan ikke gis til skadde larver før etter de har kommet bevegelse. Ellers vil den levende mat kolonisere skaden området og drepe larvene.

Representative Results

For å redusere alvorlighetsgraden av vevsskade rundt skadestedet, er kritisk skikkelig beveling av mikropipette. Figur 1a viser en riktig skrå spiss. Ved hjelp av en spiss som er for bred (figur 1B) har en tendens til å resultere i høyere dødsfall på grunn av den økte sannsynligheten for nicking dorsal aorta, mens en spiss som er for smal (figur 1C) har en tendens til å kaste et blikk av huden i stedet for å skjære vev.

For å praktisere denne teknikken, er det en fordel å bruke en reporter linje som Tg (elevl3: eGFP) ^knu3 å visualisere ryggmargen Figur 2A viser en helt transected ryggmarg av en live Tg (elevl3: eGFP). Sebrafisk på en dpi, . mens figur 2B viser den samme levende fisk på 3dpi Tall 2C og 2D viser høyere forstørrelser av skade området på tre dpi i fast Tg (dbx1a: eGFP) fisk som har complete (figur 2C) eller ufullstendig (figur 2D) ryggmargen transection. Legg merke til den sammenhengende område av nervecellen merking langs ventral kanten av ryggmargen (gul pil).

Figur 1. Sammenligning av skalpell kanter. A viser en riktig skrå micropipette tips egnet for kirurgi. Denne størrelsen er lett rengjøres for gjenbruk. B viser en skrå micropipette tips for bred for kirurgi på en fem dpf larve. C er et eksempel på en spiss som er for smal. Denne størrelsen er svært vanskelig å rengjøre for gjenbruk, og har en tendens til å fremme en saging handling av tran stedet for skjæring D:. Tegneserie av lesioning verktøyet forsamlingen. Tre 6 "vattpinner er nestet i en pyramidal form og teipet sammen. Den skalpell hviler i et av sporene som dannes av de tre kompresser, og er tapet på plass.

.. Figur 2 Kontrollere komplett tran Fluorescent konfokalmikroskopi ble brukt til bildet levende Tg (elavl3: eGFP) fisk in vivo ved en dpi (A) og 3dpi (B). For å bekrefte fullstendig tran, ble disse bildestakker deretter behandlet i ImageJ (rsbweb.nih.gov) for å generere maksimal intensitet Anslag (MaxZ) som vist på A - B C - D-show MaxZ projeksjoner av høgskolen / D merket Tg (dbx1a.: eGFP) fisk på tre dpi med fullstendig spinal transection (C) eller ufullstendig tran (D).Gule piler identifisere skadestedet, D = rygg, R = rostral. Scale bar = 100 mikrometer.

Discussion

Når først lære denne teknikken, anbefaler vi forsøker ikke mer enn 50-100 transections i en enkelt økt. Etter å mestre denne teknikken, er vi i stand til tversgående opptil 300 embryoer per time; Men dette nivået av gjennomstrømning krever noen måneder med ukentlige praksis. Det anbefales også å trene med en rapportør linje og bekrefte fullstendig tran inntil forekomsten av ufullstendig ryggmargstranseksjonen er redusert til mindre enn 1%.

Ryggmargstran i den voksne sebrafisk er et veletablert og robust teknikk for å studere axonal gjenvekst og nevrogenesen etter skade. Ved å flytte denne analysen inn i larve organisme, er vi i stand til å undersøke bedring in vivo. I tillegg er vi også i stand til å utnytte genetiske verktøy som ikke finnes i den voksne sebrafisk for å undersøke rollene til ulike gener i regenerativ prosess, f.eks Tcf7l1a ^12.

Opprinnelig developed å studere neurogenesis etter ryggmargstransection, kan denne teknikken også brukes til å undersøke gjenvinning av sensorisk funksjon: skadde dyr viser en respons på berøring caudal til skadestedet etter 2 dpi, og axons ha krysset skade området ved 5 dpi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm Petri dish	VWR	82050-544
100 mm Petri dish	VWR	89038-968
PDMS, Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Fisher Scientific	NC9644388
borosilicate capillary tubing: OD 1.00 mm, ID 0.78 mm	Warner Instruments Inc.	64-0778
Forceps	Fine Scientific Tools Inc.	11252-30
Disssection microscope	Nikon	SMZ6454
Microgrinder	Narishige	EG-44
Gentamycin Sulfate	Amresco Inc.	0304-5G	dissolve in water 10 mg/ml, store at -20 °C
Tricaine	Acros Organics	118000100
Cotton tipped applicator, wood, 6-inch	Fisher Scientific	23-400-101
1 ml syringe	BD	309625
27 G needle	BD	305109
Fry food	Argent Labs	F-ARGE-PTL-CN	store at -20 °C
Micropipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-97	Box Filament FB330B
20x E2 (1 L); store at RT
17.5 g NaCl	Fisher Scientific	S671-500
0.75 g KCl	Fisher Scientific	P217-500
2.90 g CaCl2·2H2O	Sigma	C7902-500G
4.90 g MgSO4·7H2O	Merck	MX0070-1
0.41 g KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
0.12 g Na2HPO4	Sigma	S0876-500G
500x NaCO3 (10 ml); make fresh, discard extra
0.35 g NaCO3	Sigma	S5761
1x E2 (1 L); store at RT
50 ml 20x E2
2 ml fresh 500x NaCO3