Transecção medular nos larval Zebrafish

Summary

Após transecção espinhal, adulto zebrafish tem recuperação funcional por seis semanas após a lesão. Para tirar proveito da transparência larval e recuperação mais rápida, apresentamos um método para seccionar a medula espinhal larval. Após transecção, observamos recuperação sensorial começando em 2 dias após a lesão, e movimento C-curva por 3 dias após a lesão.

Abstract

Mamíferos falhar na recuperação sensorial e motora após lesão medular, devido à falta de rebrota axonal abaixo do nível da lesão, bem como a incapacidade de reiniciar a neurogênese espinhal. No entanto, alguns anamniotes incluindo o peixe-zebra Danio rerio exposição tanto sensorial e recuperação funcional, mesmo após transecção completa da medula espinhal. O peixe-zebra adulto é um organismo modelo estabelecido para o estudo da regeneração após lesão medular, com recuperação motora e sensorial por seis semanas após a lesão. Para aproveitar in vivo análise do processo regenerativo disponível no zebrafish larval transparente, bem como ferramentas genéticas não acessível no adulto, usamos o peixe-zebra larval para estudar a regeneração após transecção medular espinhal. Aqui demonstramos um método para reprodutível e verificável seccionar a medula espinhal larval. Após transecção, nossos dados mostram recuperação sensorial início em 2 dias após a lesão (dpi), sagacidadeh o movimento C-bend detectável por 3 dpi e retomada da natação livre por 5 dpi. Assim, propõe-se o peixe-zebra larval como uma ferramenta complementar para o peixe-zebra adulto para o estudo de recuperação após a lesão medular.

Introduction

Grande trauma da medula espinal humana, muitas vezes resulta em paralisia permanente e perda de sensibilidade abaixo do nível da lesão, devido à incapacidade de crescerem axónios ou reiniciar neurogénese ^1,2. Em contraste com os mamíferos, no entanto, anamniotes incluindo salamandras e peixes-zebra (Danio rerio) mostram recuperação robusta, mesmo depois de medula espinhal completa transecção ^3,4.

O peixe-zebra adulto é um modelo bem estabelecido para estudar o processo de recuperação após lesão medular ^5-7. Na sequência completa transecção da medula espinal, restabelecimento da função sensorial e locomotiva é observado no peixe-zebra adultos de 6 semanas após a lesão ^8. A fim de examinar o processo regenerativo in vivo, nós nos voltamos para o peixe-zebra larval transparente ^9.

Aqui apresentamos um método para transecto da medula espinhal de um 5 dias após a fertilização (dpf) larval usi zebrafishng de uma pipeta de microinjecção chanfrada como um bisturi, modificado a partir de Bhatt, et ai. ¹⁰ Este método oferece suporte de alto rendimento, baixa mortalidade, e reprodutibilidade. Com a prática, 300 larvas / hr pode ser seccionado, e mais de 6 meses de transecções, incluindo mais de 3.600 animais, 98,75% ± 0,72% sobreviveram até sete dias pós-lesão (dpi). Nossos dados mostram uma recuperação rápida de locomoção e sensorial, bem como: a 1 dpi, todos os movimentos pelos peixes feridos é impulsionado por peitoral apenas locomoção fin. No entanto, as larvas começam a responder ao tungstênio agulha toque caudal à transecção por 2 dpi, restabelecer o movimento C-curva por 3 dpi, e exibir natação predatória por 5 dpi ^11. Usando coloração de anticorpos contra tubulina acetilada, que confirmaram que os axônios estão ausentes do local da lesão a um dpi, mas cruzaram o local da lesão por 5 dpi. Acreditamos que este protocolo irá proporcionar uma técnica valiosa para o estudo da rebrota axonal e neurogênese na medula espinhal após lesão.

Protocol

Peixe-zebra foram levantadas e produzido de acordo com processos padrão; experiências foram aprovadas pelo Comité de University Animal Care and Use Institucional Utah.

1. Preparação de Placas Cirurgia

1. Faça placas de cirurgia usando 60 milímetros placas de Petri e Sylgard 184 Elastômero de Silicone Kit, seguindo as instruções do fabricante. Preencha pratos não mais do que meio cheio e permitir a polimerizar. Tapados à temperatura ambiente.

2. Preparação de Micropipetas

1. Fabricar micropipetas aquecendo e puxando de parede fina tubo de borosilicato capilar em um extrator micropipeta usando as mesmas configurações para fazer agulhas microinjeção.
2. Sob um microscópio de dissecação, snap off ponta de micropipeta para cerca de 200 m de diâmetro com pinça.
3. Bisel borda quebrada com um microgrinder inicialmente a 35 °, seguida por uma segunda chanfradura a 25 °. Certifique-se de ponta é afiada e smooth. Loja terminou micropipeta chanfrado em uma placa de Petri com uma pequena quantidade de argila.

3. Preparação de Zebrafish Larvas

1. 7 dias antes da cirurgia, montar tanques de acasalamento dos peixes-zebra macho e fêmea.
2. Coletar embriões na manhã seguinte, 3 horas após as luzes se acendem para garantir um rendimento máximo. Se estiver usando uma linha repórter transgênico como Tg (elevl3: eGFP) ^knu3, os embriões fertilizados tipo 100/100 mm Placa em 25 ml de E3 em 28,5 ° C. Se estiver usando o tipo selvagem, espécie fertilizado embriões placa 25/100 mm de 25 ml de E3 em 28,5 ° C.
3. Se estiver usando uma linha de repórter, tela embriões para expressão fluorescente em 48 hpf. Permitir embriões identificados para amadurecer a uma densidade de placa 25/100 mm de 25 ml de E3 a 28,5 ° C.
4. Quando as larvas são de 5 dpf, preparar placa cirurgia cobrindo Sylgard com E2 + 10 mg / L de Gentamicina Sulfato (GS) + tricaina.
   1. Prepare recuperação prato, adicionando 25 ml E2 + GS para um 100 milímetros dis Petrih.
   2. Prepare bisturi gravando juntos três swabs. Isto vai formar uma ferramenta triangular com três ranhuras.
   3. Montar uma micropipeta preparado sobre os cotonetes gravando-o em uma das ranhuras.
5. Se reutilização de micropipetas, lave até claro com E2 + GS usando uma seringa de 1 ml e uma agulha de 27 G antes da montagem em swabs.

4. Cirurgia

1. Anestesiar um prato de larvas de cada vez (25 peixes) com tricaina. Os peixes são suficientemente anestesiados quando eles já não apresentam resposta ao toque. É importante que os peixes são completamente anestesiado antes da cirurgia, caso contrário, eles vão se contrair quando o bisturi toca-los. A cirurgia é realizada sob um microscópio de dissecção.
2. Transferência das larvas para placa de cirurgia.
   1. Sob ampliação máxima, gire uma larva de cada vez para que ele fique de lado com as costas mais próximo da mão segurando o bisturi.
   2. Posição pinça de modo que eles estejam sobre o Sylgard,angular ao longo da largura da larva.
   3. Apoiando o bisturi de vidro contra um dos braços da pinça, corte na face dorsal lateral da lagarta no nível do poro anal, tendo a certeza de não corte para além da borda ventral da notocorda. Torça o bisturi para cortar a medula espinhal.
   4. Repita com larvas restante.
      Nota: se uma larva sangra, ele não vai se recuperar da cirurgia. Remover imediatamente a larva da placa cirurgia e sacrificá-lo via tricaina overdose.
3. Uma vez que a cirurgia no lote de larvas está completa, a transferência de animais feridos para a placa de recuperação. Este é apoiar a compensação da anestesia.
   1. Atenção: ao coletar larvas ferido para a transferência, certifique-se que sejam coletadas cabeça ou cauda em primeiro lugar: não se estresse do local da lesão, dobrando as larvas.
      Nota: Todos os dispositivos utilizados para a cirurgia pode ser reutilizado, incluindo as micropipetas.

5. Recuperação

1. Transfer ferido larvas a partir da placa de recuperação para placas de 100 mm cheias com 25 ml de E2 + GS, a uma densidade de 25/plate. Permitir a se recuperar em uma incubadora de 28,5 ° C.
2. Verifique placas diariamente, removendo animais doentes e mortas. Não altere a mídia até Coleps (protozoários de água doce) são visíveis na mídia. Ao trocar a mídia, não transferir o peixe para uma nova placa; em vez disso, remova o máximo de mídia como possível e inundar a mesma placa com as novas mídias. Repita conforme necessário para reduzir a população Coleps.
3. Alimente diariamente com uma pequena quantidade de alimento frito em pó.
   Nota: Alimento vivo (por exemplo, paramecia ou rotíferos) não podem ser alimentados com larvas ferido até depois de terem recuperado a locomoção. Caso contrário, o alimento vivo vai colonizar o local da lesão e matar as larvas.

Representative Results

Para reduzir a severidade dos danos no tecido em torno do local da lesão, chanfradura adequada da micropipeta é crítica. Figura 1A mostra uma ponta chanfrada correctamente. Usando uma dica que é muito grande (Figura 1B) tende a resultar em fatalidades mais elevados devido ao aumento da probabilidade de entalhar a aorta dorsal, enquanto uma dica que é muito estreito (Figura 1C) tende a olhar para fora da pele ao invés de tecido de corte.

Para praticar esta técnica, é vantajosa a utilização de uma linha de repórter, tais como Tg (elevl3: eGFP) ^knu3 para visualizar a medula espinhal A Figura 2A mostra uma medula espinal completamente seccionada de uma Tg (elevl3: eGFP) vivo. Peixe-zebra a 1 ppp, . enquanto a Figura 2B mostra o mesmo peixe vivo em 3dpi Figuras 2C e 2D mostram ampliações do local da lesão a 3 dpi em Tg fixo (dbx1a: eGFP) peixe tendo complete (Figura 2C) ou incompleta (Figura 2D) transecção espinal medula. Observe a região contígua de rotulagem de neurônios ao longo da borda ventral da medula espinhal (seta amarela).

Figura 1. Comparação das arestas de bisturi. Um mostra uma ponta de micropipeta correctamente chanfrada adequado para cirurgia. Este tamanho é facilmente limpas para reutilização. B mostra uma ponta de micropipeta chanfrado demasiado grande para a cirurgia em uma larva 5 dpf. C é um exemplo de uma dica que é muito estreito. Este tamanho é muito difícil de limpar para reutilização, e tende a promover uma acção de corte de transecção em vez de corte D:. Caricatura do conjunto ferramenta a lesão. Três cotonetes 6 "são aninhados em um pyramidal forma e coladas. O bisturi repousa em uma das ranhuras formadas pelas três cotonetes, e é colado no lugar.

.. Microscopia confocal fluorescente Figura 2 Verificando transsecção completa foi utilizada para a imagem ao vivo Tg (elavl3: eGFP) peixes, in vivo em 1 dpi (A) e 3dpi (B). Para confirmar transecção completa, essas pilhas de imagens foram processadas em ImageJ (rsbweb.nih.gov) para gerar projeções intensidade máxima (MaxZ), como mostrado na A - B C - D projeções mostram MaxZ dos HUC / D rotulado Tg (dbx1a.: eGFP) peixes em 3 dpi com transecção medular completa (C) ou transecção incompleta (D).Setas amarelas identificar local da lesão, D = dorsal, R = rostral. Barra de escala = 100 pm.

Discussion

Quando inicialmente aprender esta técnica, recomendamos tentar não mais de 50-100 transecções em uma única sessão. Depois de dominar essa técnica, somos capazes de transecto até 300 embriões por hora; no entanto, este nível de rendimento requer alguns meses de prática semanal. Recomenda-se também a prática com uma linha de repórter e verificando transsecção completa até a incidência de incompleto transecção da medula espinal é reduzida para menos de 1%.

Transecção da medula espinhal no peixe-zebra adulto é uma técnica bem estabelecida e robusta para estudar rebrota axonal e neurogênese após a lesão. Ao movimentar esta análise para o organismo de larvas, que são capazes de analisar a recuperação in vivo. Além disso, também são capazes de utilizar ferramentas genéticas não disponíveis no peixe-zebra adulto para examinar os papéis de vários genes no processo de regeneração, por exemplo, Tcf7l1a ^12.

Originalmente developed para estudar a neurogénese seguinte transecção espinal medula, esta técnica também pode ser usada para analisar a recuperação da função sensorial: animais lesionados mostram uma resposta ao toque caudal em relação ao local da lesão por 2 dpi, e axónios ter atravessado o local da lesão por 5 dpi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm Petri dish	VWR	82050-544
100 mm Petri dish	VWR	89038-968
PDMS, Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Fisher Scientific	NC9644388
borosilicate capillary tubing: OD 1.00 mm, ID 0.78 mm	Warner Instruments Inc.	64-0778
Forceps	Fine Scientific Tools Inc.	11252-30
Disssection microscope	Nikon	SMZ6454
Microgrinder	Narishige	EG-44
Gentamycin Sulfate	Amresco Inc.	0304-5G	dissolve in water 10 mg/ml, store at -20 °C
Tricaine	Acros Organics	118000100
Cotton tipped applicator, wood, 6-inch	Fisher Scientific	23-400-101
1 ml syringe	BD	309625
27 G needle	BD	305109
Fry food	Argent Labs	F-ARGE-PTL-CN	store at -20 °C
Micropipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-97	Box Filament FB330B
20x E2 (1 L); store at RT
17.5 g NaCl	Fisher Scientific	S671-500
0.75 g KCl	Fisher Scientific	P217-500
2.90 g CaCl2·2H2O	Sigma	C7902-500G
4.90 g MgSO4·7H2O	Merck	MX0070-1
0.41 g KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
0.12 g Na2HPO4	Sigma	S0876-500G
500x NaCO3 (10 ml); make fresh, discard extra
0.35 g NaCO3	Sigma	S5761
1x E2 (1 L); store at RT
50 ml 20x E2
2 ml fresh 500x NaCO3