Summary
유체 유전자 전달에 의한 벌거 벗은 DNA의 생체 내 형질에서 최소한의 염증 반응과 동물의 조직에 유전자를 소개합니다. 유전자 산물의 충분한 양의 유전자 기능 및 조절뿐만 아니라, 단백질의 구조 및 기능 분석 될 수 있도록 생성된다.
Abstract
생체 내에서 형질 전환 유전자를 효율적으로 발현은 유전자 기능을 연구하고 질병에 대한 치료법 개발에 매우 중요합니다. 지난 몇 년 동안, 유체 유전자 전달 (HGD)이 설치류에 형질 전환 유전자를 전달하기위한, 간단하고, 빠르고, 안전하고 효과적인 방법으로 떠오르고있다. 이 기술은 관류 기관의 세포막의 투과성을 증가시키는 생리 용액의 대량의 급속한 주입에 의해 생성되는 힘에 의존하고, 따라서 세포로 DNA를 전달한다. HGD의 주요 장점 중 하나는 알몸 플라스미드 DNA (pDNA를)를 사용하여 포유류 세포로 형질 전환 유전자를 도입 할 수있는 기능입니다. 플라스미드를 사용하여 외래 유전자를 도입하는 방법은 매우 안전하고, 최소한의 고효율, 힘들고, 바이러스 사업자에 반대합니다. HGD가 처음 생쥐에 유전자를 전달하기 위해 사용 된, 그것은 이제 올리고 뉴클레오티드, 인공 염색체, RNA, 단백질 및 마우스에 작은 분자를 포함한 물질의 넓은 범위, 래트를 전달하는 데 사용와, 제한된 정도, 다른 동물. 이 프로토콜은 생쥐의 HGD에 대해 설명하고 프로 시저를 성공적으로 수행하는 중요한 방법의 세 가지 주요 측면에 초점을 맞추고 : 정맥에 바늘의 정확한 삽입, 분사의 볼륨 및 배달의 속도. 예를 분비, 영장류 특정 단백질을 인코딩하는 두 유전자의 일시적 발현이 방법의 응용 프로그램을 보여 주어, 아포 지단백 LI (APOL-I)과 합 토글 로빈 관련 단백질 (HPR).
Introduction
에 의해 처음으로 설명하기 때문에 류 등. 및 장 등., 유체 유전자 전달 (HGD)는 설치류 모델 시스템 1, 2 유전자의 기능을 연구하는데 매우 중요한 도구가되고있다. 기술은 표적 기관 1, 2의 세포에 의해 플라스미드 DNA의 흡수를 촉진하기 위하여 마우스의 꼬리 정맥에 용액의 대량 (8~12% 체중)의 급속 주입 (5-7 초)을 포함한다. 이러한 조건은 신장, 비장, 폐와 심장에 간 적은 유전자 발현의 강력한 유전자 발현을 초래할.
10 μg을 pCMV-LacZ를 플라스미드 주입 HGD 날짜 1에 가장 효율적인 비 바이러스 성, 생체 내 유전자 전달 방법을 만드는 간세포의 많은 40 %가 감염 될 수 있습니다. 바이러스 성 항공사와는 달리, pDNA를 준비하기 쉽고, 설치류 호스트 3 면역 반응을 유도하지 않고 끝이 재결합하여 건강 위험하지 않습니다ogenous 바이러스. HGD에 의해 전달 된 DNA 분자가 포장을 필요로하지 않기 때문에 또한,이 방법은 150킬로바이트 4만큼 많은 세균 인공 염색체 (BAC)의 전달에 적합하다. 유체 역학적 방법에 의해 전달 된 분자의 다른 종류의 RNA 5-10, morpholinos와 11, 단백질 12, 13 및 다른 작은 분자 (12, 14)이 (가) 있습니다. 다른 전달 방법에 HGD의 장점과 단점은 문학 15 ~ 20 우수 리뷰에서 논의되었고, 저자의 수는 21-23 절차에 대한 자세한 설명을 제공하고 있습니다.
HGD에 의해 마우스에 형질 전환 유전자를 도입하면 안전하고 1-3, 24 효과적이 방법은 비교 성공 (25)와 쥐에 사용되어왔다. 특정의 수정, 개념 증명 실험은 닭 26, RAB에서 실시 된큰 동물이 기술의 생체 내 응용 프로그램이 과제로 남아,하지만, (27)와 돼지 28 비트. 이 방법을 사용할 때, 또 다른 일반적인 제한은 가능한 포유류 발현 벡터의 많은 유전자 발현의 지속성, 높은 수준을 달성하기 성분이 부족하다는 것이다. 대상 기관에서을 pCMV 룩 플라스미드 유전자 발현을 사용하지만, 초기의 높은 발현 수준이 주입 한 후 첫 주에 급격히 인하, HGD 후 십분 빠르면 분명하다. 장기간의 형질 전환 유전자의 발현은 플라스미드 디자인 3, 24 그러나, 높은 수준의 유전자 발현의 유지가 종종 필요 반복 주사에 사용되는 프로모터와 인트론에 따라 가능하다. 이러한 이유로, HGD가 손상 단백질이나 단백질 제품에 장기간 노출의 결과 만성 질환을 연구 덜 적합 할 수 있습니다. 이러한 한계로, HGD는 PO 공부를위한 매우 강력한 도구입니다유전자 및 그것의 효과 tential 역할 (검토를 위해, 15 참조) 생체 내뿐만 아니라 치료 효과와 단백질의 조절에 질병의 동물 모델을 확립하는 돌연변이. 예를 들어, HGD 개별적으로 각각의 유전자가 녹아웃 한 마우스에 다양한 유전자 구성체를 도입하여 도메인 및 단백질의 아미노산에 기능을 할당하는 데 사용될 수있다. 또한,이 기법은 임의의 마우스 균주에서 사용될 수있다.
배달의 정맥 주입 볼륨과 속도에 정확한 바늘 삽입 :이 프로토콜은 성공적으로 형질 전환을 달성하기 위해 필요한 기술적 인 측면에 초점을 생쥐에 HGD에 대해 설명합니다. 이 방법의 적용은 아프리카 트리파노소마, 인간의 치명적인 질병과 가축 (29, 30)의 마우스 모델에서 입증된다. trypanosomes의 몇몇 종 가축에 질병을 일으키는 원인이 있지만, 대부분은 B의 면역 복합체를 타고난에 의한 인간의 질병을 일으킬 수CTRL 키를 누른라고 trypanosome 세포 용해 인자 (TLFs) 29, 31, 32. 이러한 기공 형성, 고밀도 지단백질 (HDL)의 두 가지 고유, 영장류 특정 단백질이 들어 있습니다. trypanosomes에 TLFs의 흡수를 용이하게 HPR, 리간드, 및 APOL-I, 용해성 구성 요소 31, 33 ~ 38을 Trypanosoma을 brucei의 rhodesiense 인해 바인딩과 인간 APOL-I (34), (39)을 중화 혈청 내성 관련 단백질 (SRA)의 표현으로 인간을 감염시킬 수 있습니다. 비비 TLF는 인해 발산 APOL-I 단백질 40 SRA에 의해 중화되지 않습니다. 포유 동물 발현 벡터 (pRG977), 쥐 원숭이 TLF 구성 요소의 형질 전환 식을 사용하여, 이전에보고 된 인간 감염 trypanosomes (40)에 대한 보호 기능을 부여한다. 여기에 제시된 대표적인 데이터는 유체 역학적 유전자 전달이 단백질의 치료 효과를 연구에 적용 할 수있는 방법을 보여줍니다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 실험은 헌터 칼리지의 기관 동물 케어 및 사용위원회, 뉴욕 시립 대학에 의해 승인되었습니다.
독소가없는 플라스미드 DNA의 1. 준비
- 갓 줄무늬 선택적 판에서 포유 동물 발현 벡터에 대한 관심의 유전자를 포함하는 박테리아의 하나의 식민지를 선택합니다.
- 박테리아의 성장과 수확에 대한 시판 독소가없는 플라스미드 정제 키트의 수첩에서 발견 된 권장 사항을 따르십시오.
- 시판 엔도톡신 프리 플라스미드 정제 키트의 프로토콜에 따라 박테리아 세포에서 내 독소가없는 플라스미드 DNA를 정제 하였다.
- 독소가없는 플라스틱 제품을 사용하고 독소가 제거 단계 후 DNA 샘플에 다시 도입되지 않도록주의하십시오 DNA를 처리합니다.
- MICR를 사용하여 260 nm에서 흡광도를 측정하여 내 독소가없는 플라스미드 DNA의 농도를 측정O-볼륨 UV의 아래 기술 분광 광도계 또는 표준 큐벳 기반 분광 광도계.
- 다음 마이크로 분광 광도계 샘플 보유 시스템의 하부 및 상부 광학 표면을 청소한다. 하단 광 시스템에 깨끗한 탈 이온수 피펫 1 μL. 레버 암을 닫고 상단 광학 시스템을 목욕을 할 몇 번을 누른 다음 열기 레버를 티슈로 닦아냅니다.
- 마이크로 분광 광도계의 소프트웨어를 열고 핵산 모듈을 선택합니다.
- 레버 암을 낮추고 프로그램 소프트웨어에서 "초기화"를 선택, 하단 광 시스템에 1 μL 깨끗한 탈 이온수를 놓습니다. 초기화는 조직과 완전 깨끗 모두 광학 표면되면 ..
- 프로그램 소프트웨어에서 "공백"을 선택, 내 독소없는 TE 버퍼 (1 ㎜ EDTA 10 mM 트리스로-C1, 산도 8.0) 1 μl를로드하여 빈 측정을 수행합니다. 빈 측정이 완료되면, 깨끗한 모두 광학 표면조직.
- 프로그램 소프트웨어에서 독소없는 DNA 샘플 및 선택 "측정"의 1 μl를로드하여 시료 측정을 수행합니다. DNA 농도를 기록한다. 화면에 나타나는 흡광도 비 280분의 260 nm의 기록에 의해 DNA의 순도를 평가합니다. HGD 순수한 DNA (1.8 280분의 260 비)의 사용이 매우 바람직하기 때문에, 1.7 이하의 280분의 260 비율로 DNA 샘플을 사용하지 마십시오. 측정이 완료되면, 티슈로 모두 광학 표면을 청소합니다.
2. 마우스의 무게
- 변형의 방식으로 적절한의 마크 쥐. 참고 : 꼬리의 표시는이 절차를 사용하지 않는 것이 좋습니다.
- 검은 색 마커 자신의 허리에 흰색 모피 (예 : 스위스 웹스터)가 마크 마우스 종. 필요에 따라 시간이 지남에 마크를 다시 적용합니다.
- 귀에서 검은 모피 (예 : C57BL / 6)이 표시 마우스 종은 사전에 몇 일 펀칭.
- 쥐 individua에 무게를베드로 부드럽게 동물 계량 팬 또는 양동이에 배치하여 디지털 실험 실용 저울에 배치. 실험 날에, 실험에 사용 된 각 마우스의 무게를 기록한다.
주사기의 3. 준비
- 사출 믹스의 제조
- 각 마우스의 주입을위한 50 μg 독소 프리 플라스미드 DNA - 5 가정에 필요한 DNA의 양을 계산한다.
- 실험적으로 플라스미드 DNA의 최적 량을 결정합니다.
- 요구되는 DNA의 양을 결정할 때, 주사기의 적절한 로딩이 어떤 여분 주입 혼합을 필요로하므로, 그룹 당 하나의 부가적인 마우스의 주입을 가정한다. 계산을하기 위해, 다음 예를 살펴 보겠습니다 : 마우스 당 50 μg 플라스미드 DNA와, 4 실험 및 4 제어 마우스, 각 무게 25g을 주입. 각 그룹에 필요한 5 × 50 = 250 μg μg의 DNA :이 경우에 필요한 DNA의 양을 결정하기 위해, 그룹 당 5 마우스를 산출한다.
- 각 마우스의 주입 체중의 10 %를 가정하여 필요한 양의 식염수 (0.9 % 염화 나트륨)을 결정한다.
- 위의 예에 따르면, 2.5 ㎖의 생리 식염수 (2.5 g 액)에서 플라스미드 DNA 50 μg 각 25g 마우스를 주입.
- 마우스의 전체 그룹에 필요한 염분의 양을 결정할 때, 주사기의 적절한로드를 허용 할 그룹 당 추가 마우스의 주입을 가정합니다. 주어진 실험을 고려하여, 각 그룹의 5 마우스에 필요한 염분의 양을 계산 : 5 × 2.5 ML = 각 그룹에 대해 12.5 ㎖의 생리 식염수 (25 ㎖의 총). 참고 : 동일한 그룹 내에서 마우스는 동일한 중량 (체중의 10 % 이상의 차이)되지 않는 경우에, 분사 별도 혼합 준비.
- 10 ㎖, 여러 사용 유리 병에, 인간의 사용이 승인 된 방부제 및 독소 무료, 멸균 식염수를 사용합니다.
- 20 ML의 주사기의 루어 잠금 팁에 부착 된 20 게이지 바늘 (x 25mm 0.9 mm)를 사용하여,식염수 병에서 액체를 철회하고 50 ML 원뿔 관에 주사기를 비 웁니다. DNA-식염수 주입 믹스의 준비 기간 동안 생리 식염수의 정확한 피펫 팅을하기 위해, 실험의 모든 생쥐의 주입에 필요한 것보다 더 많은 염분을 수집합니다. 실험에 필요한 식염수 계산 양이 25 ml의 경우에도 위의 실험을 위해, 3 내지 10 ㎖의 바이알 (약 30 ㎖의 전체)에 식염수를 철회.
- 다른 50 ㎖ 원추형 튜브에 DNA의 양을 계산 피펫. 독소의 도입을 방지하기 위해 피펫 몸 관의 측을 만지지 않도록주의하십시오. 예에 따라, 별도의 원뿔 튜브에 실험 플라스미드 DNA의 250 제어 ㎍의 250 μg을 피펫.
- 혈청 피펫을 사용하여 DNA에 식염수의 필요한 금액을 추가합니다. 고려 샘플 실험 마스터 믹스 (실험 및 제어)의 각각에 피펫 12.5 ml의 식염수.
- 모든 솔루션에 도달 할 수 있도록 허용주사 전에 실내 온도.
- 각 마우스의 주입을위한 50 μg 독소 프리 플라스미드 DNA - 5 가정에 필요한 DNA의 양을 계산한다.
- 주사기의 준비
- 각 마우스를 들어, 멸균, 20 - 게이지 바늘 (0.9 mm × 25 mm)를 사용하여 DNA-식염수 믹스 멸균 3 ㎖, 루어 로크 시린지를 채운다. 공기 방울을 피하기 위해주의하십시오. 주입 유량이 매우 잘 제어 될 수없고, 한 손에 큰 주사기를 조작하기 어려운 높은 볼륨으로 주사기를 사용하여 피. 이 재사용 할 수 있으므로 다시 원뿔 튜브에 초과 DNA-식염수 믹스를 꺼냅니다.
- 멸균, 27 게이지 바늘로 바늘을 전환합니다. 완전히 공기 방울을 도입하지 않고 액체로 바늘을 입력합니다. 마우스의 중량을 기준으로 계산 된 DNA-식염수 믹스의 볼륨을 조정한다.
- 캡핑 바늘이 비 멸균 표면을 만지지 않도록하십시오. 다른 손으로 뚜껑을 잡고하지 않고 바늘을 삽입하고 출장 바늘을 누르면, 평평한 표면에 캡을 씌워 : 필요한 경우, 바늘은 한 손 기술을 사용하여 다시 출장 할 수있다바늘에 뚜껑을 확보하기 위해 회사 개체에 대해. 주사기는 이제 꼬리 정맥 주사를위한 준비가되어 있습니다.
4. 유체 역학 DNA 전달
- 마취 마우스 가능성을 줄일 수 있습니다. 이 또한 가능성을 줄일 수로, 너무 추운 방에서 HGD을 수행하지 마십시오. 방은 20 ° C의 주변 온도가 마취를 사용하는 경우, 모든 동물의 손실을 방지하기 위해 37 ° C 포스트 절차로 설정 가열 패드에 마우스를 배치합니다. 마취를 사용하는 경우, 마우스의 입과 주둥이가 열 패드에 방해되지 않는 동안하고 완전히 복구 될 때까지 마우스를 준수하는지 확인하십시오. 이전 HGD에 마우스에서 음식이나 물을 원천 징수하지 마십시오.
- 혈관을 팽창하기 위해 쥐를 따뜻하게.
- 침구의 온도가 약 38 ~ 39 ° C. 수 있도록 5 분 동안 열 패드에서 마우스 케이지 (침구 포함 가능)를 배치 온도에 대한 열 패드에 생쥐를 유지할만큼 충분히 낮아야기간을 연장했다.
- 또한, 최소한의 규제로 등의 접근 제한 수단에 마우스를 놓습니다. 부드럽게 따뜻한 물에 적신 거즈로 잡고 1 분 동안 마우스의 꼬리를 따뜻하게. 필요한 경우, 다시 위치에 마우스를 허용합니다. 건조 티슈로 꼬리를 닦아냅니다.
- 또한, 더 이상 2보다 분 동안 가열 램프 아래에 케이지를 배치하여 따뜻한 마우스. 가열 램프를 사용하는 경우, 마우스의 과열을 방지하기 위해주의를 기울여야합니다.
- 대용량 꼬리 정맥 주입
- 실험실 테이프를 평평한 표면에 지느러미 액세스 제한 수단을 고정시킨다.
- 꼬리 잡고 천천히 제한 수단에 마우스를 놓고 플러그를 삽입합니다. 고정 꼬리를 유지하기 위해 필요에 따라 적게 억제를 사용합니다. 마우스가 자유롭게 호흡되어 있는지 확인합니다.
- 마우스가 절차 중 어느 시점에서 심한 고통에있는 경우, 즉시 제한 기에서 마우스를 제거하고 휴식 할 수 있습니다.
- 마우스의 위치를 이렇게측면 꼬리 정맥 중 하나가 표시됩니다. 꼬리의 양쪽에 블루 라인이 측면 꼬리 정맥 동안 꼬리의 중간에 실행하는 빨간색 선은, 동맥입니다 : 마우스의 뒷면에 똑바로보고 측면 꼬리 정맥을 찾습니다.
- 철저하게 알코올 면봉으로 마우스의 꼬리를 닦아냅니다.
- 꼬리가 중간과 세 번째 손가락에와 새끼 손가락 아래에서 검지 손가락에서 통과되도록 비 주입 손을 사용하여 색인과 중간 손가락 사이에 단단히 꼬리를 개최합니다. 엄지 손가락을 자유롭게 움직일 유지 할 수 있습니다. (그림 1A)
- 다른 손을 사용하여, 알콜 면봉으로 다시 주입 할 영역을 닦아. 지역은 건조하도록 허용합니다.
- 주입 - 손에 넣은 주사기를 들고 엄지 손가락과 다른 네 자리 숫자의 배럴를 잡고. 플런저에 잡지 마십시오.
- 마우스의 몸을 향하여 바늘 가리키는 꼬리 주사기 평행하게 놓고위로 향하게 바늘의 경사 (경사 가장자리).
- 꼬리 정맥에 바늘을 삽입합니다. 저항없이있는 슬라이딩 바늘에서 분명 정맥이 제대로있는 경우에만 주사를 진행합니다. 바늘 삽입의 깊이가 있지만, 전체 삽입 인해 정맥의 전단의 위험이 증가하지 않는 것이 좋습니다 개인 취향의 문제라고합니다. 바늘을 이동하지 마십시오.
- 꼬리를 들고 손의 엄지 손가락을 사용하여 위치에 바늘을 잡아 꼬리에 바늘을 누르 허브의 허브에 폐쇄. 극단적 인 압력을 적용하지 않고 이러한 정맥에 액체의 흐름을 방해하므로, 바늘 축에 보유하지 않습니다. 주입 (그림 1A)를 방해하지 않도록 느슨하게이 시점에서 검지 손가락으로 꼬리를 잡아.
- 집게 손가락과 가운데 손가락 플랜지에 들고 엄지는 플런저의 끝 (Figur에되도록 주사기 손을 잡고 다시는 위치전자 1A).
- 하나, 연속 동작으로 플런저를 아래로 눌러 6 ~ 8 초에서 액체의 전체 볼륨을 주입.
- 정맥에서 바늘을 제거하고 티슈로 꼬리에 부드러운 압력을 적용하여 출혈을 중지합니다.
- 가열 패드의 상단에 배치 복구 케이지에 제한 기 및 장소 마우스에서 마우스를 제거 (침구는 37 ~ 38 ° C에서해야한다). 사출 방 감기의 경우,이 단계는 마우스의 생존을 위해 매우 중요합니다. 출혈이 완전히 정지 할 때까지 마우스의 차려라.
- 유체 역학적 DNA 전달 다음 1 시간 동안 마우스를 관찰합니다. 헥헥과 부동의 초기 기간으로 인해 HGD에 의한 일시적인 부정맥에 정상입니다 만, 마우스가 약 5 분에 회복 조짐을 표시해야합니다. 마우스의 호흡이 상당히 얕은되면, 조심스럽게 호흡을 용이하게하기 위해 마우스의 복부를 마사지. 회복의 속도가 약간 사용되는 마우스의 변형에 의해 영향을받을 수도 있습니다.
- 반환 마우스주택 케이지와 마우스가 풍부한 식량과 물의 공급이 있는지 확인합니다.
- 다른 손 위치를 사용하여 대용량의 꼬리 정맥 주입
- 제한 수단에 마우스를 놓고 전술 한 바와 같이, 4.3.5 단계 4.3.1에 따라 분사를 준비하고 있습니다.
- 구십도 각도로 구부려 네 손가락으로 평평한 표면에 비 주입 손을 놓습니다. 손가락 (엄지를 제외한 전부) 플랫폼을 만들어 서로 위에 쉬어야. 엄지와 손가락을 가리키는 (그림 1B) 사이의 마우스의 꼬리를 잡고.
- 다른 손을 사용하여, 알콜 면봉으로 다시 주입 할 영역을 닦아. 지역은 건조하도록 허용합니다.
- 주입 - 손으로 주사기를 잡고 플랜지 및 주입을위한 준비 플런저의 말을 개최합니다.
- 전술 한 바와 같이, 단계 4.3.17을 통해 단계 4.3.9에서이 프로토콜에 따라 절차를 완료합니다.
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Representative Results
마우스의 꼬리 정맥에 바늘의 정확한 위치는 (도 1에 도시 된 바와 같이)을 성공적으로 유체 역학 기반하여 형질 도입 유전자 전달을위한 필수 조건이다. 주입의 전체 볼륨은 6-8의 기간 내에 전달 될 수 있도록 종종 기술의 가장 어려운 부분은, 그러나, 움직임이없는 꼬리 정맥 내 바늘의 유지이다. 사출 과정에서 사소한 오류가 크게 감소 된 형질 전환 효율 및 단백질 발현의 원인이 될 수 있습니다. 따라서, 각각의 실험 HGD의 성공을 모니터링하는 것이 필수적이다. 또한 형질 전환 단백질이 때문에 민감한 항체의 부족으로 웨스턴 블롯에 의해 검출하기 어려운 경우, 원숭이 APOL-I의 경우에서와 같이, 주입 효율이 단백질에 대한 유전자를 운반하는 플라스미드의 공동 주입에 의해 모니터링 될 수 검출이 용이하다. 도 2에 도시 된 실험에서, 마우스는 50 주사했다세 차등 6XHIS 중 하나를 운반하는 플라스미드 ㎍의는 비비 APOL-I 유전자와 원숭이 HPR (bHPR, 태그가없는)을 수행 한 다른 플라스미드 (같은 발현 벡터 디자인)의 50 μg 태그. 이 실험의 주요 목표는 선택 순서 위치에서 6XHIS 태그의 추가가 올바른 처리 및 비비 APOL-I 단백질의 분비를 방해 여부를 평가하는 것이 었습니다. 그러나, 태그의 첨가가 정확한 폴딩하고, 그 결과, 단백질의 분비를 방해하는 경우, 단백질 발현의 상실로 인해 손상 처리 또는 실패한 HGD의 발생 여부를 확인하는 것이 어렵게된다. (인간 감염성 trypanosome 도전 대하여 마우스의 보호에 의해 결정된 바와 같이) 또한 인하여 충분히 민감 항체의 부족으로, 형질 전환 된 마우스 혈장 중 비비 APOL-I의 직접 검출도 성공적인 유전자 전달의 경우에는 곤란하다. 이 실험에서는, 이러한 문제가 해결되었다APOL-I HGD 혼합물에 원숭이 HPR 플라스미드의 당량을 첨가하여 대리 분사 제어의 역할을한다. 그림에서와 같이, 원숭이 HPR은 매우 거의 모든 형질 전환 마우스는 HGD가 성공을 나타내는 플라즈마로 표현했다. 발현 수준에 작은 방울을,도 2a에 bAPOL-I 6XHIS 그룹 1이 생쥐 중 하나에서와 같이, 일반적으로 사출 속도에서 매우 작은 감소 (1-2 초)에 기인한다. 그림 2B (bAPOL-I 6XHIS 그룹 3) 최초의 플라즈마 샘플 레인 1에서 실패 HGD을 나타내는 단백질 발현의 완전한 부족을 보여줍니다. 대부분의 경우에, 이는 전달체의 전체 볼륨의 불완전 주입에 기인한다. 이 실험은 모든 경우에 HGD의 성공하지만, 하나, bAPOL-I의 분비에 6XHIS 태그의 효과는 이제 안티 6XHIS의 면역 블롯 (그림 2C와 D)에 의해 평가 될 수를 확인하기 때문에. 보이는그림 2D, 그들의 플라즈마 6xHIS - 태그 단백질의 검출 수준을했다 생쥐의 유일한 그룹은 3 군이었다.이 그룹 내에서 단백질 발현 패턴이 그룹의 쥐 중 하나의 분사가 실패했음을 확인했다. 그룹 1 및 2에서 검출 6xHIS 단백질의 완전한 부재 (도 2c)은 HGD의 성공을 모니터링하는 사출 믹스 트레이서 단백질 등의 중요성을 강조한다. bHPR (도 2A와 B)의 혈장 수준을 고려하지 않고,도 2c 및 D로부터의 데이터는 쉽게 그룹 1 및 2에 HGD의 실패로 해석 될 수있다.
비비 TLF1 구성 요소 bAPOL-I 및 bHPR의 성공적인 HGD 인간 감염성 Trypanosoma brucei brucei-SRA 기생충 (TBB-SRA, T. B의 실험실과 동일합니다. rhodesiense) (40)에 생쥐에게 저항을 제공합니다. 이 저항은 bAPOL-I <의 유전자 발현에 기인/ EM>, 혼자 bHPR의 주입은 인간의 전염성 기생충에 대한 보호를 제공하지 않기 때문에. 의 6XHIS 태그가 변형 bAPOL는-I는 여전히 용해성 단백질을 작동 할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, HGD에 의해 bAPOL-I 및 bHPR을 모두받은 마우스는 5000 TBB-SRA 이틀 유전자 전달 후 기생충에 도전했다. 그림 3에서 보는 바와 같이 그룹 1과 3에있는 대부분의 마우스는 한 태그가없는 bAPOL-I 양성 대조군으로 살아남은 반면, 6XHIS 그룹 2에있는 마우스는 초기 감염에 굴복. (원숭이 APOL-이 마우스 변형에 부분적인 보호를 부여.) 2 군 내에서 유전자 발현이 보편적으로 높은 이었기 때문에,이 마우스에있는 보호의 부족이 올바르게 인해 그에서 6XHIS 태그에 bAPOL-I 세포 용해 기능의 손실로 해석 될 수있다 위치. 케어는 그림 참조 (이 마우스가 성공적으로 형질 전환 유전자를 주입하지 않은으로 3 군 내에서 마우스의 조기 (일 7) 죽음, 잘못 해석되지 않습니다, 그러나,주의해야우레의 2B, 레인 1). 그림 2와 3에서 결합 된 데이터에 비추어, 우리는 (6xHIS 그룹 2)의 위치 2에이 단백질에 태그를하면서 bAPOL-I는 용해성을 방해, 부작용없이 (6xHIS 그룹 3) 3 위치에 태그 할 수 있다는 결론 기능. 6xHIS 그룹 1에서, 데이터는 보호 암시 동안 마우스의 수는 의미있는 데이터를 획득하기에 충분했다. 전력 분석은 각 실험에 필요한 생쥐의 수를 결정하기 위해 수행되어야한다. 1 군에서 마우스 혈장에서 검출 가능한 단백질의 명백한 부족은 그림 3에서 볼 수있는 보호 패턴에 모순되는 것처럼 보일 수 있지만,이 그룹의 부정 방지 6xHIS 서양 얼룩 오히려 때문에 단백질 처리에 탐지의 부족의 결과가 될 수 있습니다 유전자 발현의 부족보다. 1 군 6xHIS 태그는 예측 된 신호 펩티드의 절단 부위 부근에 후 첨가 하였다. APOL-I는 아미노산 배열 원숭이 추가 predicte을 포함D 단백질 분해 절단 부위 신호 펩티드 (40)의 절단 부위로부터 약 20 아미노산. 따라서,이 마우스의 bAPOL-I 분비와 기능이 아직 그것의 탐지에 필요한 6xHIS 태그를 잃은 것이 분명하다. 따라서 HIS 태그 배치의 중요성을 설명.
APOL-I는 기생충 리소좀 막 36, 37의 기공 형성에 의해 아프리카 trypanosomes를 죽인다. 신장 손상의 메커니즘은 아직 41, 42 불분명하지만 최근 아프리카 조상을 가진 사람들에있는 인간 APOL-I의 자연 변형, 강하게, 아프리카 계 미국인의 신장 질환과 관련되어있다. HGD은 간에서 가장 높은 유전자 발현을 초래하기 때문에, 우리는 인간의 APOL-I 또는 인공 서열의 변형이 장기에 손상이 발생하는 경우 조사했습니다. 이를 위하여, 생쥐는 50 지정된 WT 인간 APOL-I ㎍의 또는 단일 아미노산 합성 돌연변이 주사했다의 K4.To가 간 손상을 평가, 우리는 아스 파르 테이트 트랜스 아미나 제 (AST) 2 일 후 분사에 수집 된 마우스의 혈장 농도를 측정 하였다. 그것의 세포 용해 기능과 일치, WT 인간 APOL-I는 식염수 주입 쥐에 비해 혈청 AST 수치의 상승 (그림 4A)를 발생합니다. 대조적으로, 단지 하나의 아미노산에서 차이 돌연변이 K4, 주입은 거의 AST 방출을 야기. K4 단백질 수준이 동등하거나 WT 인간 APOL-I (그림 4B)보다 높은으로 간 손상의 차이는, 단백질 발현 수준에 기인 할 가능성이 있습니다. HGD 마우스에서 간 검사는 5 일 후 분사 인간 WT APOL-I는 정상 간 조직 소견을 보여 식염수 주입 쥐에 비해 온건 한 대식 세포 침윤 (그림 5B)로 제한 조직 괴사를 일으키는 보여줍니다 수집 (그림 5A, 보라색 지역) . 플라즈마 AST 농도를 측정함으로써 얻어진 데이터를 확인, K4는 동일 플라스미드 backg에 주입WT 같은 라운드는 정상 간 조직학 (그림 5C)를 보여줍니다.
HGD에 대한 손의 위치를 그림 1. 그림. A.) 최대 주입 속도를 달성하기 위해 그리고 주입 후 바늘의 움직임을 피하기 위해 위치 1. 추천 손 위치가 개시되었다. 화살표는 정맥에 바늘을 삽입 한 후 엄지 손가락의 제안 움직임을 나타냅니다. 엄지 부드럽게 마우스의 꼬리에 대해 허브를 잡고 바늘을 고정화한다. 주사기를 들고 손 주사 전에 플런저를 눌러 할 수 있도록 위치를 변경할 수 있어야합니다. 꼬리 정맥 주입 가까이 꼬리의 기지로 인해 반복 주사를 실시해야하는 경우 B.) 위치 2.이 위치는 좋습니다. 바늘이 정맥에 삽입되면,이 손 위치가 더 모피를 필요로하지 않는다거기 조정.
그림 2 오주 세, 여성, 스위스 웹스터 (SW) 두 개의 분리 된 플라스미드의 혼합 주사 생쥐에서 수집 된 플라즈마의 웨스턴 블롯 분석 :. 50 μg 비비 HPR 및 차등 6XHIS 50 μg는 비비 APOL-I 유전자를 태그. 생쥐 식염수 차량으로 음성 대조군으로 주사 하였다. HGD의 성공 여부를 확인하기 위해,이 실험은 원숭이 APOL-I는 검출하기 어려운 상태로, 원숭이 HPR 단백질의 순환 혈중 농도를 나타낸다. 마우스 혈장 2 일 포스트 HGD와 단백질 발현 수준이 변성, 비 환원 조건에서 10 % 트리스 - 글리신 폴리 아크릴 아마이드 젤에 웨스턴 블롯 (플라즈마 1:20 희석)로 분석 하였다 수집 하였다. HPR은 레코 인간 토글 로빈 (HP)에 대해 토끼 폴리 클로 날 항체를 사용하여 검출 하였다비비 HPR은 gnizes. 태그 bAPOL-I는 6xHIS 태그에 토끼 폴리 클로 날 항체를 사용하여 검출되었다. 6XHIS 단백질이 포함 된 컨트롤의 분자량은 40, 50 kDa의 수 있습니다. A.) 패널 분비 단백질 그룹의 모든 쥐가 성공적으로 주입 하였다 (HPR)의 웨스턴 블롯 분석의 예를 보여줍니다. 주입이 매우 성공적으로 두 번째 HIS 태그가 그룹 (bAPOL-I 6XHIS 그룹 2),에 균일하게 높은 단백질 발현을 확인합니다. 첫 번째 그룹 (bAPOL-I 6XHIS 그룹 1)에서 마우스 중 하나에서 단백질 발현으로 인해 주입의 감소 속도에 대한 것, 눈에 띄는하지만 어느 정도 줄일 수있다. B.) 패널 bAPOL-I 6XHIS 3 군 주사 () 중 하나가 실패한 단백질 발현 수준의 예를 나타낸다. C.) 패널은 또한 단백질 (bAPOL-I)의 검출이 불확실 할 때 HGD의 성공을 모니터링하는 트레이서 단백질 (bHPR을) 등의 중요성을 보여준다. bAPOL-I의 HGD의 확인의 성공에도 불구하고
비비 APOL-I 6XHIS 변종과 비비 HPR을 표현 생쥐의 그림 3. 생존. 스위스 웹스터 마우스는 동일한 주입 믹스 HGD에 의해 두 개의 분리 된 플라스미드 각각 50 μg을받은 5 주 된, 여성. 이 실험에 사용 된 마우스는 그림 2에서 분석 플라즈마에 해당합니다. 2 일 후 주사에, 마우스는 5000 인간의 감염 TBB-SRA 기생충 및 기생충 혈증이 관찰되었다에 감염되었다. 기생충은 10 9 기생충 / ㎖에 도달 할 때 마우스를 안락사시켰다. 로그, P <0.05 - * (표시된 경우 생존율은 생리 식염수 컨트롤에서 유의 한 차이가 있었다순위 검정). 기생충의 도전에 따라 마우스의 생존은 HGD의 성공 이후의 실험에서 얻은 데이터에 영향을 미치는 방법의 예입니다. 비비 APOL-I이 성공적으로 주입 될 때, 유전자의 제품은 제품에 의해 다루어 인간 감염 trypanosomes를 죽인다 마우스의 혈액으로 분비된다. 생존 곡선은 마우스 APOL-I는 크게 TBB-SRA에 대한 보호 된 원숭이의 6xHIS 태그 버전 3 주입을 보여줍니다. 이 그룹의 유일한 조기 사망은 성공적으로 (그림 2 참조) 유전자를 운반하는 플라스미드를 주사하지 않은 마우스에 해당합니다. 기생충 문제에 따라 생존이받은 유전자의 차이가 있지만, 유전자 전달의 실패에 기인 아니므로이 마우스는 생존 분석에서 제외되어야한다.
도 5. 조직 병리학 다른 레벨에서 APOL-I는 시퀀싱 결과에서 단일 아미노산 치환. 그림은 식염수 차량 (A)의 유체 역학적 주사, 50 μg 인간 WT APOL-I (B), 또는 APOL-I, K4 (C)의 합성 돌연변이 변종의 50 μg을받은 SW 마우스의 간을 보여줍니다. 간은 5 일 후 분사에 제거하고 헤 마톡 실린 및 에오신 염색을 위해 처리되었다. 대표적인 예는 WT 생쥐의 손상된 부위의 추가 예를 보여 그림 4에서 AST 수준. 패널 (DF)을 분석 같은 마우스의 표시됩니다. 패널 (B)의 괴사의 초점은 (DF)는 검은 색 사각형으로 표시하고 확대되어있다. 이러한 패널에있는 흰색 화살표는 대식 세포 침윤의 영역을 가리 킵니다. 비교를 위해, 식염수 차량 주입 쥐의 간을 대표하는 지역에서 정상 조직은 밝은 파란색 사각형으로 표시되고도 확대된다. 패널 (E) 및 (F)이 두 개의 서로 다른 WT 생쥐 동안 패널 (B) 및 (D)는, 동일한 WT 쥐로부터 대표적인 이미지들이다.
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Discussion
올바르게 수행 할 경우, HGD는 유전자 전달의 매우 안전하고 효과적인 방법입니다. 성공적인 HGD에 중요한 단계는 1)보다 8 초에 마우스 3)의 꼬리 정맥에) 생리 식염수 차량 2의 큰 볼륨에서 DNA의 정확한 양을 제공.
주입 과정 자체가 대단한 약간의 손재주가 필요하지만,이 여섯 번째 절차의 성공은 종종 실험주의 준비에있다. 최대한의 유전자 발현을 달성하기 위해 필요한의 pDNA의 양이 사용될 플라스미드 따라서 발현되는 유전자에 따라 크게 달라질 수 있으며, 주입되는 DNA의 최적 량은 각 응용에 대한 실험적으로 결정되어야한다. 마우스의 경우, 일반적으로 권장되는 DNA의 범위는 유전자 발현이 고원에 도달 할 수있는 이상으로 5 ~ 50 μg이다. 우리 손에, APOL-I 또는 HPR 유전자 하나를 들고 50 μg pRG977의 주입은 circulatin 높은 수준에 이르게처음 두 일 G 단백질 수준은 HGD을 게시 할 수 있습니다. 두 단백질의 혈중 수치가 10 일째 (38, 게시되지 않은 데이터) 정도 검출 수준 이하로 떨어질 단백질 수준까지 며칠 동안 크게 감소. DNA의 최적 량은 마우스 (1), (2)의 체중을 8-12 %로 생리 용액 당량에 전달되어야한다. 우리를 포함한 대부분의 연구자, 주입 차량으로 생리 식염수를 사용하는 반면, 링거액은 비교 성공 2 HGD에 사용되고 있습니다. 이 무균 환경에서 HGD를 수행하지 않아도되지만,이 과정을 통하여 주사액의 내 독소 오염을 방지하기 위해 필수적임을 유의. 이를 위해 주사를 사용 식염수 뛰어난 고순도이어야하고 주입하는 DNA는 내 독소를 제거 시판 키트를 사용하여 제조한다. 또 다른 중요한 준비 단계는 마우스의 무게주의입니다. 이후주사의 볼륨이 성공적으로 HGD의 중요한 측면 중 하나입니다, 그것은 마우스를 투여 - 아래 또는 과다 복용 식염수로도 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 동물의 수 사망에있는 동안 후자 차선 형질의 이전 오류가 발생합니다. 또한 동물의 안전을 보장하기 위해, 우리는 제거하기 어려운 작은 공기 방울을 도입 피하기 위해 작은 게이지 바늘과 주사기를로드하는 것이 좋습니다. 프로토콜에 설명 된 것처럼 게이지 바늘 - HGD는 27로 수행되어야한다.
꼬리 정맥을 명확하게 볼 수 있습니다 경우 올바른 주사를 크게 촉진된다. 비상 조명과 제한 수단을 사용할 수없는 경우 마우스의 부드러운 가열하여 혈관을 넓히는 것은 혈관의 시각화에 도움이 있습니다. 몇 분 동안 열 패드에서 마우스 케이지를 배치하거나 우리의 손에서 잘 따뜻한, 젖은 천으로 작업에 꼬리를 들고. 열 램프를 사용하는 경우, 하나는 쥐를 과열하지 않도록 각별한주의를 운동해야합니다. 우리는 찾아 우리에게 그열 램프를 보내고하면 마우스 불필요한 스트레스와 불편의 원인이되므로 피해야한다. 70 % 에탄올로 꼬리를 닦는 추가 꼬리 정맥과 피부 사이의 대비를 증가시켜 시각화하는 데 도움이됩니다. 이 단계는 주입 중에 박테리아 오염을 방지하는 것도 중요하다. 마우스가 주입을 위해 준비되면, 꼬리 정맥이 프로토콜에서 설명한 손의 위치 중 하나를 사용하여 주입 될 수있다. 이 위치보다 쉽고 직관적 나타나는 동안, 그것이 주사기를 이동하지 않고 액체의 전체 부피를 주입하기 더 어려울 수 있음을주의한다. 대조적으로, 첫번째 방법을 사용하여 좋은 바늘 위치를 확립하는 바늘 허브 단단히 꼬리 대해 유지되면, 주입이 거의 실패하지하지만 더 복잡하다. 성공적으로 형질이 손 위치를 사용 가능하지만 첫 번째 방법은, 최대 속도 권장합니다.
생쥐의 HGD 주입의 권장 속도는 있지만, 6 ~ 8 초입니다많은 저자는 빠른 주사가 더 나은 결과 1, 12을 생성하는 것이 좋습니다. 현저하게 감소 된 유전자 발현의 느린 주입 결과. 그러나, 유전자 발현의 완전한 부족에 대한 가장 일반적인 이유는 분사의 전체 볼륨을 제공하기 위해 실패합니다. 주입이 시작된 후 바늘이 이동 될 때 발생합니다. 올바른 위치에 바늘이 저항없이 정맥으로 들어간다. 바늘이 제대로 정맥에 삽입되어 있는지 확인하려면, 하나는 전체 주입하기 전에 정맥에 아주 소량 (100 μL) 액체를 주입 할 수 있습니다. 플런저를 아래로 누르면 극단적 저항 만족하는 경우, 상기 니들은 잘못된 위치에 및 액체의 꼬리 조직들이있다. 바늘이 실패 HGD의 정맥 중간 주입, 보정을 벗어나면 마우스가 몇 시간 동안 휴식을 허용 한 후 시도 할 수있다. 부족한 나머지는 마우스에 고통을 일으키는 원인이되고 유체 역학 등 pressur의 손실이 발생할 수 있습니다 재 주사 후전자 마우스의 꼬리의 첫 번째 상처를 열어. 반복 주사가 필요한 경우, 마우스는 전체 부피의 식염수 (및 DNA의 양) 같은 맥락에서 또는 반대측의 정맥 꼬리의베이스에 가까운 하나와 함께 주입 될 수있다. HGD 다음, 마우스는 적어도 한 시간 동안 열 패드에 배치 케이지에서 관찰되어야한다. HGD은 심장 기능, 간 확장, 간 세포, 정현파 및 fenestrae 12, 14, 43의 막 기공 중단 급성 요철 결과 혈관 내 압력의 급격한 증가를 야기. 몇 초에 혈액 볼륨의 두 배로에도 불구하고, 마우스는 매우 잘 HGD을 허용. 2 분 곧 주사 후 급격히 감소 혈관 내 압력의 정상 심박수 반환, 3 분 12, 43에서 기초 수준에 접근한다. 중단 간세포 미만 2 분 및 확장 간 크기의 반환에 봉인약 24 시간 43 정현파 기능의 회복에 따라 30 분에서 보통 크기. 많은 연구자가 성공적으로 마취를 사용하는 동안, 우리 손에, 이소 플루오 란 마취로 인해 HGD에 마우스의 호흡 곤란을 악화시킨다. 우리는 마취 된 쥐 복구하고 때때로 생존을위한 인공 호흡을 필요로하는 데 시간이 더 걸릴 것을 찾을 수 있습니다. 마취를 사용하여 마우스의 큰 그룹을 주입하면 잘 회복 동물의 복지를 감독하기 위해 최선을 다하고 방에 추가 인원이 필요할 수 있습니다. 마취없이 반복해도 주사는, 마우스의 생존은 100 %이며, 복구 시간이 5 분 미만이다.
여기에 설명 된 프로토콜은 마우스간에 분자의 넓은 범위를 제공하기 위해 사용될 수있다. 예로서 분비 단백질 APOL-I을 사용하여, 우리는 HGD이 마우스 모델을 수립하고 보호 단백질의 기능을 연구하는데 사용될 수있는 방법을 보여 주었다. 각종 유전자 산물의 기능 succe 비교할 때가능하면 HGD의 SS는 평가되어야한다. 분비 된 단백질의 경우, 웨스턴 블롯하여 마우스 혈장을 분석하여 발현 수준을 모니터하기 쉽다 (도 2 및도 4b). 그것은 치료 단백질의 천연 또는 합성 변형 시금 때 형질 전환 효율로, HGD의 성공을 보장하기 위해 특히 중요 할 수있다 심각한 질병의 결과에 영향 (도 2 및도 3). 예를 들면이 방법은 기공 형성 단백질 (그림 4, 5)이다 APOLI로 인한 간 손상을 분석하기 위해 확장 할 수있는 방법을 보여주기 위해 제공됩니다. 순서는 현저하게 다른 손상 프로파일에서 동일한 플라스미드 배경 결과에 APOL-I의 변종입니다. 이것은 조직 손상이 단백질 기능 및 발현 벡터 또는 주사 자체의 외상되지과 연관된다는 것을 시사한다. 이는 우리의 손에서 AST 수준은 하루에 한 후 분사 (데이터 미도시)에 보편적으로 높고, 주목해야한다. 생쥐의 2 일에, 그러나, AST 수준식염수 정상으로 돌아 유전자 변형 사이의 차이와 투사 (그림 4) 쉽게 식별 할 수 있습니다. 3 일 후 주입으로 모든 치료에 측정 된 AST는 기초 수준 (데이터가 표시되지 않음)로 돌아갑니다. 간에서 괴사 조직과 염증이 더 이상 AST의 일시적인 증가보다 분명하기 때문에, 때문에 지속적인 유전자 발현에 간 손상은 5 일 후 분사에 수집 된 간의 염색으로, 질적으로이기는하지만, 더 안정적으로 평가 될 수있다. 예 AST의 증가 릴리스의 원인이 APOL-I 변종 쇼를 제공 헤 마톡 실린 및 에오신 염색에 의해 평가 후 분사도 지탱 간 손상 이일.
유체 유전자 전달은 생체 내에서 유전자 발현의 신속한 분석을 허용한다. 이는 진핵 세포 발현 벡터에 연구중인 유전자의 간단한 구조 및 위에서 설명한 것처럼 분사를 수행 할 수있는 능력을 요구한다. transge의 생성이러한 HIV-1 또는 재조합 아데노 - 관련 바이러스 벡터 유래 재조합 렌티 바이러스 벡터로 유전자 전달의 다른 형태를 사용하여 NIC 마우스는 훨씬 더 전문적인 지식을 필요로합니다. 바이러스 유전자의 발현은 종종 인해 호스트가 바이러스 감염을 감지하고 15-19 응답에 염증 반응의 원인 그러나, 비록 그들의 이점은 유전자 발현을 유지된다. 1백50킬로바이트의 세기관지 성공적 HGD 4에서 사용 된 반면, 또한, 바이러스 벡터는 한정된 장비 능력에 따라서, 유전자의 크기에 제한이있다. 이 기술을 습득 한 후, 사용자는 임의의 생체 내에서 핵산 (또는 gDNA를하는 cDNA 또는 RNA)를 형질 감염 및 단백질의 생산 및 생물학적 결과를 볼 수있다. 단백질은 세포 내이 될 수 있습니다, 막 결합 또는 세포; 그것은 태그 또는 수정 된 핵산에 따라서 아미노산 수준 할 수 있습니다. 가장 중요한 것은,이 매우 신속하고 간단한 기술이다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 처음에 우리에게 기술의 다양한 측면에서 자신의 지속적인 안내 HGD 기술과 러셀 박사 톰슨 (의학의 알버트 아인슈타인 대학)을 가르치는 시아 리우 (Regeneron 제약) 감사합니다. 이 작품은 헌터 칼리지에 의해 투자되었다, CUNY는 기금을 시작하고 NSF 빵 상 IOS-1249166. 우리는 마우스의 간에서 조직학에 대한 NYULMC 조직 병리학 코어 NYUCI 센터 지원 그랜트, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol Prep Wipe | Webcol | 6818 | |
| AST kit, Amplite Colorimetric | AAT Bioquest | 13801 | |
| Conical Tube, 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| KimWipes | KIMTECH | 34120 | |
| Mouse Tail Illuminator | Braintree Scientific | MTI RST | Or equivalent |
| Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm) | BD | 305175 | |
| Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm) | BD | 305109 | |
| pRG977 (mammalian expression vector) | Regeneron Pharmaceuticals | Material Transfer Agreement required | |
| Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira | Fisher | NC9054335 | |
| Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD |
References
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