Summary
Bøk bark sykdom er initiert av fôring aktiviteter av bøk skala insekt som skaper soppinngangspunkter i barken. Trær som er resistente mot skalaen insekt er også motstandsdyktige. Her presenterer vi protokollen vi har utviklet for å skjerme enkelt bøketrær for bøk skala motstand.
Abstract
Bøk bark sykdom (BBD) resulterer i høye nivåer av initial dødelighet, etterlot overlevende trær som er sterkt svekket og deformert. Sykdommen er initiert av fôring aktiviteter av invasiv bøk skala insekt, Cryptococcus fagisuga, noe som skaper inngangspunkter for infeksjon av en av de Neonectria arter av sopp. Uten skala angrep, er det liten mulighet for soppinfeksjon. Bruke skala egg til kunstig søke friske trær i tungt BBD påvirket stands viste at disse trærne var resistente mot skalaen insekt delen av sykdommen komplekse en. Her presenterer vi en protokoll som vi har utviklet, basert på den kunstige angrep teknikken ved Houston 2, som kan brukes til å screene for skala-resistente trær i området, og i mindre potte frøplanter og grafts. Identifiseringen av skala-resistente trær er en viktig del av forvaltningen av BBD gjennom treforbedringsprogrammer og skogkultur manipulasjon.
Introduction
Bøk bark sykdom (BBD) har hatt en ødeleggende innvirkning på amerikansk bøk i Nord-Amerika siden innføringen av invasiv bøk skala insekt, Cryptococcus fagisuga, i den kanadiske provinsen Nova Scotia i slutten av 1890-tallet tre. Dette insekt-sykdom kompleks initieres når bøk skala insekt setter sin fôring stylet inn i barken lage små sprekker som gir portrom for smitte av en av de Neonectria arter av sopp (Neonectria ditissima eller Neonectria faginata). Som soppvekstene vokser, kan store deler av vevet dør, til slutt fullstendig girdling treet. Skaden fra sykdommen svekker treet, noe som gjør den utsatt for snapping i sterk vind fire. Dødeligheten i den første bølgen av sykdommen har blitt rapportert å være så høy som 50% 5. Overlevende trær er ofte sterkt deformert som cankers danne redusere verdien av treet som et tre produkt.0; Slike trær har en tilbøyelighet til rot-spirende som fører til dannelse av "bøk kratt" som hindrer at andre mer ønskelige arter fra å etablere, redusere økonomisk og økologisk verdi av stativet 6.. Selv bøk bark sykdom er ikke sannsynlig til å føre til utryddelse av den amerikanske bøk, endrer det stå sammensetning og helse fører til en nedgang i mat og habitat for dyreliv 7,8.
I stands berørt av BBD i mange år, har trær som forblir fri for eventuelle symptomer på sykdommen blitt rapportert. Kunstige inokuleringsprose studier har vist at disse trærne er motstandsdyktig mot skalaen insekt to. Uten skala angrep, er det liten mulighet for Neonectria infeksjon, minimere virkningen av sopp. Dødelighet stor skala i American bøk grunn Neonectria infeksjon i fravær av forutgående akse angrep har aldriblitt rapportert, slik motstand mot bøk skala insekt resultater i motstand mot BBD.
Nyere forskning på forvaltning av BBD har fokusert på identifisering, forplantning, avl og oppbevaring av amerikanske bøketrær med motstand til BØK skala insekt. Genetiske studier har vist at motstanden mot skalaen insekt er arvelig, og nøye utvelgelse og avl av resistente trær kan resultere i betydelig forbedring i en enkelt generasjon ni. Dette funnet har drevet forsøk fra statlige og nasjonale skogforvaltere i USA for å etablere regionale frø frukthager av resistente amerikansk bøk for å gi en kilde til genetisk mangfoldig BBD-resistente frø for restaurering plantings 10,11. Forskning har også indikert at skogskultur manipulering av frittgenetikk av fjerningen av følsomme trær og retensjon av resistente trær kan resultere i stand forbedring 9,12. </ P>
Forvaltning av BBD gjennom tre forbedringsaktiviteter eller gjennom å utføre skogkultur resepter krever evne til å velge for og skille mellom bøk skala bestandig og mottakelige trær. De metodene som presenteres her har blitt tilpasset fra en metode først introdusert av Dave Houston til kunstig vaksinere frøplanter med bøk skala egg en. Fremgangsmåten kan anvendes som et screening-verktøy for å identifisere kvantitativ egenskap loci (QTL) assosiert med resistens eller for å skille mellom resistente og følsomme potte frøplanter eller podet ramets i genetiske studier. Alternativt, kan det bli brukt for screening av trær på området for å identifisere resistente trær for frø fruktutviklingen, eller retensjon i felten. Mottagelige trær kan identifiseres og fjernes for å minimalisere sykdomsvirkninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En plantemateriale:. Modent felt trær, Potte frøplanter, eller Potte Grafts
- For felttesting, velg modne friske amerikanske bøketrær som viser ingen tegn til skala angrep eller sykdom for testing for mulig motstand. Synlig følsomme trær må også være kjent for å bli brukt som en kontroll (figur 1).
- For å teste potte frøplanter eller grafts, samle og spire beechnuts som beskrevet i Koch & Carey, 2004 eller pode ætling som beskrevet i Carey et al, 2013.
- Grow frøplanter eller grafts i potting jord blanding endret med 47 g mikronæringsstoffer, 477 g slow release gjødsel 15N-3.9P-9.9K, 700 g grov perlite og 75 g aluminium sulfate per 2.8 cu. ft bag. Hvis nødvendig senere i vekstsesongen, gjødsle planter ukentlig med løselig 17N-1.3P-14.1K på 200 ppm nitrogen.
- I vekstsesongen, holde plantene i en nyanse huset. Tillat planter å gå sovende utenfor i høst før du flytter demtil en kontrollert temperatur lagringsanlegg (~ 4 ° C) fra november til april.
2. Innsamling av Beech Scale Eggs
- I en BBD-infisert stativ, inspisere tungt infiserte trær (lett identifiseres ved deres "hvitkalket" utseende, figur 1A) med en hånd forstørrelsesglass for å bekrefte tilstedeværelse av egg, vanligvis rikelig fra midten av juli til midten av august.
- Bruk en pensel til å forsiktig børste den hvite voksaktig klumper av voksen skala insekter, egg og annet rusk, inn i en plast lukkbar én gallon oppsamlingspose (Figur 1B). Samle fra et minimum på tre forskjellige trær minst 12 m fra hverandre.
- Hvis nødvendig, lagre egg i den forseglede oppsamlingspose for inntil to uker ved 4 ° C. Tape en liten del (2,5 cm i firkant) for fuktede polyetylenskum til innsiden av posen for å hindre eggene fra å tørke ut.
- For å skille skala egg (0,15 x 0,25 mm) fra de voksne (0,60 mm) og debris, konstruere en sikt ved hjelp av et kort stykke av 2 'PVC-rør og en kopling for å støtte et kvadratisk stykke på 250 mikron nylon mesh (figur 2).
- Tømme blanding av voksne, voks, egg og rusk fra oppsamlingsposen på silen og bruke en liten pensel til forsiktig oppmuntre egg å passere gjennom maskene i en glasspetriskål nedenfor. Plast petriskåler bør unngås fordi de holder mer statisk elektrisitet, noe som gjør det vanskelig å bevege eggene. Egg før og etter sikting er vist i figur 3..
- Rensede egg kan lagres i petriskål ved 4 ° C i minst en uke. For å hindre at eggene tørker ut, tape en fuktig stykke skum til lokk og forsegle med Parafilm.
Tre. Egg Livskraftig Analyser
- For å vurdere levedyktigheten til egg, bruker en 10 cc sprøyte for å påføre et tynt ring av vaselin rundt omkretsen av undersiden av en 60 mm glasspetriskål (figur 4A
- Overfør ca 100 egg til midten av ringen, legg på lokket petriskål og forsegle med Parafilm. Tillat den forseglede petriskål for å forbli uforstyrret ved romtemperatur i 2 uker eller 3 uker hvis egg ble lagret ved 4 ° C før start av analysen.
- Klekket nymfer vil bli sittende fast i vaselin og kan lett telles, og tomme egg er lett skilles fra unhatched egg ved sin farge og glans (Figur 4B). Beregn levedyktighet ved å dele antall nymfer med summen av de tomme egg pluss de gjenværende hele egg. God levedyktighet bør være i det 75% til 90% egg skravert område.
4. Scale Resistance Screening av store modne Beech Trees in the Field
- For en kvantitativ test, regne ut 500 egg ved hjelp av en dissekere mikroskop og ved hjelp av en liten slikkepott forsiktig dryss dem over midten av et predampened åpenporet 10 x 15 x 1,3 cm rektangel av polyetylen skum. Ådempe skum, våt det deretter presse ut så mye vann som mulig. For en kvalitativ test, kan 500 egg telles ut og plassert i en liten glassampulle og en "fyll" linje trukket som kan brukes til å måle flere satser av omtrent 500 egg.
- Plasser skumputen på testtreet med egg siden som vender mot barken. Hold puten på plass med tau, snor, hyssing, eller plastbelagt hardware wire. Plast-eller metallbaserte materiale bør anvendes i stedet for naturlige fibermaterialer som er lettere scavenged av dyr.
- Linje toppen og sidene av en precut 23 x 30 cm stykke dampgjennomtrengelig vanntett hus wrap med acetat basert silikon lim og legg den over skumtestputen. Trykk kantene av huset brytes til treet for å skape en vanntett forsegling. Plasser nylon hyssing eller plastbelagt hardware ledning rundt treet og huset wrap, for å holde den på plass mens limet settene (figur 5).
- Plasser minst totestputer for hver testtreet, fortrinnsvis på motsatte sider av det bole. Ved hver side, sett testputer på i det minste to følsomme trær (med åpen naturlig målestokk infestasjon) som en kontroll. Før plassere test pads på kontroll trær, fjern eventuelle naturlig forekommende skala insekter eller egg med en fast børste.
Merk: Skumplasttops med egg kan også plasseres på trær i den hensikt å oppdra skala egg, som kan være spesielt nyttig i områder der smitten nivået er lavt.
5. Scale Resistance Screening av Potte frøplanter eller Grafts
- For testing, velg potte trær med en diameter på 1 cm (caliper 5 cm over jorda linjen) som er høye nok til å ha minst to separate test pads plassert på dem. Beskjær små sidegreiner når det er nødvendig for å gjøre plass for test pads.
- Bruk en dissekere mikroskop for å regne ut 150 egg og strø dem over en precut og fuktet 2,5 x 7,6 x 1,3 cm open-cell veskerlene skum pad.
- Fest skumgummipute til frøplante med egg siden mot bark, ved hjelp av plastbelagt wire. Pakk en liten firkant av huset vikle rundt frøplante like over skum og forsegle den med acetat-basert silikon (se Figur 6A).
- Inkluder kjent mottakelige frøplante familier eller grafts som kontroller.
6. Datainnsamling
Merk: Omtrent 52-57 uker etter å plassere skumputer og egg på test trær, kan data samles inn. Det er viktig at dette ikke gjøres før etter voksne har begynt å legge egg, slik at deres evne til å reprodusere kan bestemmes. På noen resistente trær er det ikke uvanlig å se et lite antall voksne etablere men uten reproduksjon oppstår.
- Fjern forsiktig skum pad og telle antall voksen skala insekter etablert på bark ved hjelp av en hånd linse eller forstørrelsesglass (10X).
- Når skumputen er fjernet, er det ikke uncommon for noen voksne og de fleste egg klynger å bli trukket ut av treet med skummet (se figur 7). Ved hjelp av en dissekere mikroskop, telle egg klynger og voksne som har forblitt festet til skumplast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fig. 6 viser et motstandsdyktig frøplante (C) og to følsomme frøplanter (D, E) som oppviser forskjellig grad av følsomhet. Et eksempel på hvordan en mottakelig gammelt tre ut som 57 uker etter den kunstig infisering test ble satt opp er vist i figur 5B. Når skummet er skrellet bort fra treet, er det ikke uvanlig at skalaen insekter og deres egg klynger å forbli fast til skum, som vist på figur 7, noe som er grunnen til at det er viktig å samle inn data fra både treet og skumputen .
Figur 8 illustrerer gjennomsnittlig antall voksne insekter etablerte per 100 egg på kunstig infisert trær i to forskjellige stands, en i Allegheny National Forest (ANF) i Pennsylvania og den andre i Ludington State Park (LSP), Michigan. Begge føtter ble befengt med BBD og i hvert stativ, en klynge av sunn treets ble identifisert (LSP Motstandsdyktig og ANF Resistant) og fast bestemt på å være klonal basert på DNA-analyse (data ikke vist). En klonal klynge av BBD-mottakelige trær ble også identifisert på LSP (LSP følsom), men i ANF fem forskjellige mottakelige trær ble brukt (ANF følsom). Innenfor og mellom klonal klynger, størrelse varierte med DBH spenner 02.01 til 12.08 inches. Figur 8 viser at selv om det er en del variasjon i antall voksne etablerte på mottakelige trær, er klare forskjeller oppdages mellom mottakelige og resistente trær. Det var mindre variasjon i antall voksne i både resistente klynger i forhold til de følsomme trær. I ANF Resistant klyngen, alle 12 kloner som ble testet, hadde ingen voksne, mens det i den LSP Resistant cluster enkelte kloner hadde et lite antall voksne. Imidlertid var det ingen overlapping i standardavvik fra gjennomsnittet av de resistente og følsomme trær på begge steder.
Den variasjon i antall voksne på klonalt beslektede trær i LSP (LSP Mottakelige) er større enn observert i ANF følsomme trær (ANF Mottakelige) til tross for det faktum at disse trær er ikke klonal og er genetisk forskjellige. Levedyktighet tester (data ikke vist) indikerer denne varianten er ikke på grunn av store forskjeller i levedyktigheten av eggene. Variasjonen skyldes sannsynligvis både genetiske og miljømessige forskjeller og illustrerer viktigheten av å ha følsomme kontroller for referanse på hver testside.
Figur 1. Innsamling av skala egg fra skala-infisert amerikansk bøk tre. A. Tungt skala befengt amerikansk bøk tre. B. En pensel brukes til å børste voksen skala insekter og deres egg i en lukkbar oppbevaringspose under.
Figur 2. Konstruksjon av silen for å separere skala egg fra voksne og andre forurensninger. A 4 x 4 tommer pre snitt kvadratet av 250 mikron nylonmesh er plassert mellom en 4 tommers stykke 2 "diameter PVC-rør og en kopling for å danne silen .
Fig. 3. Skala egg før (A) og etter (B) sikting. A. Blanding av voksen skala insekter, egg og rusk sett under dissekere mikroskop etter samling fra treet. B. Rensede egg oppnådd etter å ha passert gjennom sikten.
Figur 4. Egg levedyktighet test. En. Ring of petroleum i petriskål å felle nymfer etter klekking. B. Form jeg nymfe på høyre side av en un-klekket egg. C. Klekket eggene er lysere i fargen og gjennomsiktig i forhold til ugjennomsiktig gulaktige egg før klekking.
Figur 5. Kunstig infisering av modne American bøk i felten. A. Hus wrap festet med acetat-basert silikon for å hindre fuktighet bygge opp på skumpute med egg under. B. Hus wrap har blitt fjernet og skumpute skrelles tilbake 52 uker etter plassering for å avsløre scale kolonisering under på dette utsatt treet.
Figur 6. Kunstig angrep av potte amerikanske bøk frøplanter. A. Skum med egg festet til stammen. B. Hus wrap dekker skum. C. Skum fjernet etter 56 uker på en motstandsdyktig frøplante, D. et mottakelig frøplante, E. og en svært utsatt frøplante. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figur.
Figur 8. Sammenligning av gjennomsnittlig antall voksne insekter etablert på kunstig infisert trær i to separate stands. Resistent trær i Allegheny National Forest, Pennsylvania (ANF) og i Ludington State Park, MI (LSP) er i forhold til følsomme kontroll trær. Antallet trær testet i hver gruppe er oppført i parentes nedenfor, og voksne teller per 100 egg anvendt ble midlet over alle trær innenfor gruppen. Baren representerer ett standardavvik fra mean.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiske trinnene som er nødvendig for å lykkes med denne analysen er å utføre en test levedyktighet på eggene, og bruk av følsomme kontroller ved hvert sted testet, og med pottemateriale. Det er også viktig å bruke mer enn en test pad per tre eller frøplante. Vi har funnet at både i felten og i flere kontrollerte tester på potteplanter, kan en hyppig feilkilde være beleggsvikt. For eksempel, i felten, selv med forbehold for å dekke testputen med huset brytes for å hindre at overskytende fuktighet, vann som strømmer ned langs stammen kan favorisere en side av et tre, og resultere i tap av en testpute.
For å oppnå nøyaktige resultater, er det viktig å plassere ballen både treet flate under pute, og skumputen i seg selv. I tillegg til voksne og egg klynger, den eneste mobile fase i skala livssyklus kalles formen jeg nymfer, kan også observeres. Disse mobile nymfer sluttsette inn sine fôring stylet inn i barken på treet, blir en form II nymfe. Begge typer nymfer er svært like i størrelse og utseende til de små, ovalt formet egg, mens de større voksne har en mer sfærisk form. Skjemaet jeg nymfe skiller seg fra egg fordi den har røde øyne og er i bevegelse, men denne bevegelsen gjør får en nøyaktig telling svært vanskelig. Skjemaet II nymfe kan lett forveksles med et egg, spesielt når du spiller inn data i feltet med en hånd linse eller forstørrelsesglass og ikke et mikroskop. For disse grunner, anbefaler vi å telle bare de voksne og antall egg klynger, som vi har funnet gir oss reproduserbare data på muligheten for en test tre for å støtte selvdrevet skala angrep. Tidligere arbeid har vist at den voksne teller er sterkt korrelert med egg klynge nummer ni. I mange tilfeller kan det være tilstrekkelig å bare telle voksne; Vi har imidlertid observert noen tilfeller hvor voksne er i standå etablere på visse genotyper av trær, men ikke produsere egg. Uten evne til å reprodusere, ville skalaen infestation ikke være bærekraftig på disse trærne.
Et uventet fall i denne analysen når utført i felten er attraktivitet test pads til bjørn. Fremtidige endringer i protokollen bør fokusere på å bruke materialer som kan være mindre attraktiv for bjørn eller plassere test pads i ulike høyder. En begrensning til denne metoden for testing er at det ikke bør brukes i områder som ikke allerede har minst en lys bøk skala angrep, for å unngå risiko for spredning av bøk bark sykdom.
Nytten av denne teknikken er at den kan brukes til å vurdere moder ytelse som en del av en avl. For slike avkom tester strenge kriterier for skala-resistens er vanligvis fulgt, slik at bare en voksen og null f.eksg klynger som kriterier for motstand. Ved hjelp av disse retningene for å velge foreldre, bør andelen av resistente avkom være omtrent 50%, noe som er en betydelig forbedring sammenlignet med åpen øves frø 15.. Imidlertid, for land styringsformål kan det være ønskelig å anvende mindre strenge kriterier for fastsetting av trær da trær som støtter et lavt nivå av skalaen insekter kan forbli relativt friske.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke for støtte fra US Forest Service Forest Health Protection Evaluering Monitoring and Special Technology Development Programmer som har støttet utvikling, endring og anvendelse av protokollen beskrevet her for å identifisere trær som er resistente og mottakelige for bøk skala insekt. Vi er også takknemlige for den Holden Arboretum, Kirtland, Ohio, for deres fortsatte samarbeidet og støtten fra våre amerikanske bøk motstand screening program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nylon Mesh Sheet, 250 micron |  Small Parts |
CMN-0250-D | Mesh opening size: 250 microns square, % of open area: 34, thread diameter: 180 micron, width: 24”, Length: 12”, Package quantity: 1 |
| Tyvek Home Wrap | DuPont |
D1349991 | 9 ft x 150 ft roll, can ask for it to be cut in half. |
| Polyethylene foam, ½” thick | Columbus Foam Products |
2 ft x 50 ft roll | |
| MetroMix 510 | Sun Gro Horticulture |
2.8 cu. ft. bark, peat moss, vermiculite, bark ash, starter nutrient charge (with Gypsum), slow release nitrogen and dolomitic limestone. | |
| Osmocote Plus 15-9-12 | Everris |
E903206 | Standard 3-4 month release |
| Sight Savers 10X | Bausch & Lomb |
813434 | 10X magnification illuminated coddington |
| Nikon Mini Field Stereoscope | Nikon |
7314 | 20X magnification |
| Silicone II clear | GE |
159538 | 2.9 oz clear window & door caulk |
References
- Houston, D. R. A technique to artificially infest beech bark with the scale, Cryptococcus fagisuga (Lindinger). U.S. Forest Service. , Northeastern Forest Experiment Station. Broomhall, PA. (1982).
- Houston, D. R. American beech resistance to Cryptococcus fagisuga. Proceeding, IUFRO beech bark disease working party conference. , U.S. Department of Agriculture, Forest Service, Northeastern Forest Experiment Station. Washington, D.C. 38-42 (1983).
- Ehrlich, J. The beech bark disease: a nectria disease of Fagus, following Cryptococcus fagi. 10, 593-692 (1934).
- Papaik, M. J., Canham, C. D., Latty, E. F., Woods, K. D. Effects of an introduced pathogen on resistance to natural disturbance: beech bark disease and withdrow. 35, 1832-1843 (2005).
- Miller-Weeks, M. Current status of beech bark disease in New England and New York. Proceeding, IUFRO beech bark disease working party conference. , U.S. Department of Agriculture, Forest Service, Northeastern Forest Experiment Station. Washington, D.C. 21-23 (1983).
- Houston, D. R. Beech bark disease: The aftermath forests are structured for a new outbreak. J. For. 73, 660-663 (1975).
- Twery, M. J., Patterson, W. A. Variations in beech bark disease and its effects on species composition and structure of northern hardwood stands in central New. 14, 565-574 (1984).
- Jakubus, W. J., McLaughlin, C. R., Jensen, P. G., McNulty, S. A., et al. Alternate year beechnut production and its influence on bear and marten populations. Beech Bark Disease: Proceedings of the Beech Bark Disease Symposium. Evans, C. A., et al. , U.S. Forest Service, Northern Research Station. Newtown Square, PA. 79-87 (2005).
- Koch, J. L., Carey, D. W., Mason, M. E., Nelson, C. D. Assessment of beech scale resistance in full- and half-sib families. Can. J. For. Res. 40, 265-272 (2010).
- Koch, J. L. Beech bark disease: The oldest “new” threat to American beech in the United States. Outlooks Pest Manag. 21, 64-68 (2010).
- Koch, J. L., Mason, M. E., Carey, D. W., et al. Screening for resistance to beech bark disease: improvements and results from seedlings and grafted field selections. Proceedings of the 4th International Workshop on Genetics of Host-Parasite Interactions in Forestry. Palmieri, K., et al. , U.S. Forest Service, Pacific Southwest Research Station. Albany, CA. (2012).
- Leak, W. B. Fifty year impacts of the beech bark disease in the Bartlett Experimental Forest, New Hampshire. Northern J. Appl. For. 23, 141-143 (2006).
- Koch, J. L., Carey, D. W., et al. Controlled cross-pollinations with American beech trees that are resistant to beech bark disease. Proceedings of the 14th Central Hardwood Forest Conference. Yaussy, D. A., et al. , U.S. Forest Service, Northeastern Research Station. 358-364 (2004).
- Carey, D. W., Mason, M. E., Bloese, P., Koch, J. L. Hot callusing for propagation of American beech by grafting. HortSci. 48, 620-624 (2013).
- Koch, J. L., Carey, W. W., et al. The genetics of resistance of American beech to beech bark disease: knowledge through 2004. Beech Bark Disease: Proceedings of the Beech Bark Disease Symposium. Evans, C. A., et al. , U.S. Forest Service, Northern Research Station. Newtown Square, PA. 98-105 (2005).
