未修饰和过度磷酸化的tau蛋白被用于两个实验 体外 通过聚集实验揭示依赖于过度磷酸化的快速聚集动力学。这些实验为未来筛选能够调节过度磷酸化tau蛋白形成纤维倾向的化合物奠定了基础，而此类纤维正是阿尔茨海默病进展的关键因素。
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摘要
摘要
阿尔茨海默病是一组被称为tau蛋白病（tauopathies）的神经退行性疾病中的一种，其特征是神经元内出现以神经原纤维缠结（NFTs）形式存在的过度磷酸化tau蛋白沉积。NFT的密度与认知功能障碍及其他神经退行性症状密切相关，因此推动了以tau蛋白聚集为靶点的治疗策略的研发。然而迄今为止，tau蛋白聚集检测通常使用不含病理相关磷酸化修饰的重组或合成tau蛋白。本文描述了两种以重组的过度磷酸化tau蛋白为研究对象的检测方法。这些方法可扩展用于高通量筛选能够调节过度磷酸化tau蛋白聚集体动力学或稳定性的化合物。利用过度磷酸化tau蛋白亚型，有望发现治疗阿尔茨海默病及其他tau蛋白病的新型治疗药物。
引言
阿尔茨海默病（AD）是一类被称为tau蛋白病（tauopathies）的神经退行性疾病中的一种。tau蛋白病的核心病理特征是神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中出现的神经原纤维缠结（NFTs）1-4。NFT的密度与认知功能障碍3,5以及神经元丢失6密切相关。NFT主要由高度磷酸化的tau蛋白（以下简称“p-tau”）组成，这些蛋白形成直形或成对螺旋纤维（PHF）7,8。Tau蛋白是一种微管相关蛋白，被认为有助于轴突运输，这对神经元信号传导和物质运输至关重要9,10。在正常大脑中，每个tau分子含有2至3个磷酸基团，但在tau蛋白病患者中，其磷酸化水平可增加数倍11。多种激酶可能参与tau蛋白的过度磷酸化过程，包括GSK3β（糖原合成酶激酶3β）和CDK5（周期蛋白依赖性激酶5）12,13，但引发病理性磷酸化的直接诱因仍不明确14。发生在微管结合基序内或附近的异常磷酸化会导致tau蛋白从微管上解离15，并引起tau蛋白错误定位至胞体-树突区，在该区域p-tau聚集成直形或成对螺旋纤维，最终可聚合形成NFT包涵体。tau蛋白过度磷酸化、NFT形成与神经退行性变之间的紧密关联，促使人们普遍认为p-tau缠结会引发凋亡及其他细胞毒性反应，因而被认为是tau蛋白病导致神经退行性变的根本原因16,17。基于这一假说，已开展药物筛....
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方案
1. 试剂的准备
- 配制聚集缓冲液（20 mM Tris，pH 7.4，100 mM NaCl，1 mM EDTA）。室温保存，可稳定数月。使用前补充 1 mM 二硫苏糖醇（DTT）。
注意：基于 HEPES 的缓冲液（10 mM HEPES，pH 7.5，0.1 mM EDTA，5 mM DTT）在 tau 蛋白聚集实验中也可获得类似结果。 - 配制硫黄素 T 或硫黄素 S 储存液（3 mM，溶于聚集缓冲液中），使用 0.22 μm 无菌滤器过滤。置于铝箔包裹的离心管中，–20 °C 保存，可稳定数月。
- 配制肝素储存液（300 μM，溶于聚集缓冲液中）。–20 °C 保存，可稳定数月。
- 配制二硫苏糖醇（DTT）储存液（1 M，溶于水中）。分装至 1.5 ml 离心管中，–20 °C 保存。在进行聚集实验前，将 1 M 溶液于室温解冻。从此 1,000 倍浓缩储存液中，用去离子水稀释配制 100 mM 工作液，并置于冰上待用。
- 从 –80 °C 冰箱中取出 tau 蛋白样品，在冰上解冻。用聚集缓冲液将 tau 蛋白调整至预定浓度。在 4 °C 条件下，以 20,800 × g 离心 10 分钟，去除预先形成的大型聚集体。此预离心步骤可提高后续每批蛋白样品荧光检测结果的一致性。将上清液转移至另一离心管中，置于冰上待用，准备进行聚集反应体系的组装。
2. 无染....
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结果
利用重组的 tau 蛋白和磷酸化 tau 蛋白（p-tau）（图 1），我们建立了两种不同的实验方案，通过硫黄素 T（ThT）和硫黄素 S（ThS）在结合淀粉样蛋白聚集体（包括 tau 和 p-tau）时产生强烈荧光的特性，来比较 tau 与 p-tau 的聚集动力学（图 2）。无论在聚集反应中是否加入荧光染料，我们均观察到过度磷酸化显著促进 tau 蛋白的聚集（图 3–5）。这种促进作用与肝素无关（数据未显示）。在典型反应中，tau 和 p-tau 在反应开始后的前 30 分钟内迅速形成寡聚体，随后聚集速率显著减慢（图 3 和图 5），且在整个实验过程中，p-tau 始终表现出更高的荧光强度单位。在聚集反应中加入 ThT 会导致聚集速率明显减缓（图 4）。两种蛋白在反应启动约 160 小时后均接近平台期。而 ThS 则不会引起聚集过程的显著减慢（图 5）。
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讨论
本方案展示了可检测磷酸化依赖性tau蛋白快速聚集动力学的不同实验条件和仪器。在终点实验中，于每个时间点从主反应体系中取出部分反应液，加入荧光染料ThT，随后检测淀粉样蛋白结合诱导的荧光信号26。第二种方法为含染料模式，即在ThT或ThS存在的条件下进行tau蛋白聚集反应，使该类反应适用于对tau蛋白聚集体生长的实时自动监测。上述每种方法均有其优缺点。
终末模式反应仅使用诱导tau蛋白聚集所需的组分进行。将反应液与硫黄素T（ThT）稀释并混合会显著减缓荧光增强的速率，实质上在进行荧光定量时停止了反应。因此，该方法也适用于手动操作。然而，由于加入ThT后反应实际上已终止，绘制聚集曲线可能需要大量tau蛋白。该方法的另一个潜在局限是频繁接触反应混合物可能引入微生物或蛋白水解污染，或导致蛋白质氧化。相比之下，含染料模式允许在ThT或硫黄素S（ThS）存在下生成淀粉样蛋白，聚集进程可被连续监测而无需干扰反应体系。这一特性在建立自动化检测平台时尤为有利。然而，不同染料可能产生特异性响应。事实上，ThT显著延缓tau和磷酸化tau（p-tau）的聚集，而ThS则影响甚微（比.......
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披露
我们无任何披露事项。
致谢
本工作由美国国家衰老研究所（AG039768）资助 MHK。我们感谢 Thomas Sharkey 博士和 Honggao Yan 博士慷慨提供仪器，同时感谢 Sean Weise 和 Yan Wu 提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| NaCl | Macron Fine Chemicals | MAL-7581-06 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Invitrogen | 15576-028 | |
| 硫黄素 T | Sigma | T3516 | 避光保存 |
| 硫黄素 S | Sigma | T1892 | 避光保存 |
| 肝素 | Sigma | H3393 | |
| DL-二硫苏糖醇（DTT） | Sigma | D9779 | 4 °C 保存 |
| 96 孔板 | Corning | 3917 | |
| ISA SPEX FluoroMax-2 | Horiba | ||
| SpectraMax M2 多功能微孔板读板仪 | Molecular Devices | ||
| 小鼠抗 Tau 单克隆抗体 | R&D Systems | MAB3494 | –80 °C 保存 |
参考文献
- Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q. Neurodegenerative tauopathies. Annu Rev Neurosci. 24, 1121-1159 (2001).
- Ballatore, C., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q. Tau-mediated neurodegeneration in Alzheimer's disease and related disorders. Nat Rev Neurosci. 8 (9), 663-672 ....
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