Summary
Actin में रोग के कारण म्यूटेशन cytoskeletal समारोह को बदल सकते हैं. Cytoskeletal गतिशीलता कुल आंतरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग fluorescently टैग प्रोटीन की इमेजिंग के माध्यम से मात्रा निर्धारित कर रहे हैं. एक उदाहरण के रूप में, cytoskeletal प्रोटीन, Aip1p, उत्परिवर्ती actin isoform, R256H व्यक्त कोशिकाओं में स्थानीयकरण और आंदोलन को बदल दिया है.
Abstract
Actin में उत्परिवर्तन अक्सर cytoskeletal समारोह को बदल कि विशिष्ट आणविक परिवर्तन के कारण मानव रोगों की एक सीमा के कारण. इस अध्ययन में, fluorescently की इमेजिंग कुल आंतरिक प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी cytoskeletal गतिशीलता में परिवर्तन कल्पना और यों के लिए प्रयोग किया जाता है का उपयोग टैग प्रोटीन. TIRF माइक्रोस्कोपी और फ्लोरोसेंट टैग का उपयोग भी actin में परिवर्तन की वजह से cytoskeletal गतिशीलता में परिवर्तन की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है. इस तकनीक का उपयोग करना, जीवित कोशिकाओं में cytoskeletal समारोह की मात्रा का ठहराव valuably प्रोटीन समारोह की इन विट्रो अध्ययन में पूरक. एक उदाहरण के रूप में, actin के अवशेषों R256 प्रभावित करने missense म्यूटेशनों इस अमीनो एसिड विनियामक बातचीत में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, सुझाव तीन मानव actin isoforms में पहचान की गई है. cytoskeletal आंदोलनों पर actin उत्परिवर्तन R256H के प्रभाव खमीर मॉडल का उपयोग कर अध्ययन किया गया. actin depolymerization में cofilin की सहायता के लिए जाना जाता है जो प्रोटीन, Aip1 था,एन टर्मिनस पर हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के साथ टैग और TIRF माइक्रोस्कोपी का उपयोग vivo में लगाया है. जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती उपभेदों दोनों में Aip1p आंदोलन की दर मात्रा निर्धारित किया गया था. R256H उत्परिवर्ती actin व्यक्त कोशिकाओं में, Aip1p गति प्रतिबंधित और आंदोलन की दर 1.60 की तुलना में R256H कोशिकाओं में 0.88 ± 0.30 माइक्रोन / सेक (जंगली प्रकार की कोशिकाओं में मापा लगभग आधा गति है ± 0.42 जंगली प्रकार की कोशिकाओं में माइक्रोन / सेक, पी <0.005).
Introduction
Actin cytoskeleton जिसमें प्रमुख प्रोटीन होता है और कोशिका विभाजन, organelle आंदोलन, सेल गतिशीलता, संकुचन, और संकेतन सहित महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं में भाग लेता है. पिछले दशक के दौरान, actin में रोग के कारण म्यूटेशन myopathies से कोरोनरी धमनी की बीमारी 1-7 करने के लिए, विकारों की एक सीमा के लिए अग्रणी छह मानव actin isoforms में से प्रत्येक में खोज की गई है. actin म्यूटेशन रोग को जन्म दे प्रक्रिया है जिसके द्वारा elucidated किया जाना जारी है. खमीर मॉडल एकल आवश्यक actin isoform, आनुवंशिक शिक्षणीयता और actin अनुक्रम और समारोह के उच्च संरक्षण के फायदे के कारण actin समारोह पर म्यूटेशन की जैव रासायनिक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सोने के मानक बनी हुई है. अध्ययन व्यक्तिगत actin म्यूटेशन प्रमुख नकारात्मक प्रभाव 8 के साथ आणविक विशिष्ट रोग के लिए नेतृत्व करता है. उदाहरण के लिए, लिस-118 अवशेषों को प्रभावित करने वाले γ-गैर पेशी actin में बहरापन परिवर्तन के कारण द्वारा विनियमन में परिवर्तनactin बाध्यकारी प्रोटीन Arp2 / 3 9. अध्ययन अक्सर इन विट्रो में रोजगार प्रोटीन का विश्लेषण करती है: प्रोटीन बातचीत. कोशिका जीव विज्ञान पर म्यूटेशन actin और, विशेष रूप से, सेल में बाध्यकारी प्रोटीन स्थानीयकरण actin के प्रभाव की जांच सीमित कर रहे हैं.
Vivo में खमीर cytoskeleton के अध्ययन पारंपरिक एक औंधा प्रतिदीप्ति खुर्दबीन 10 से तय कोशिकाओं की छवियों पर भरोसा करते हैं. इन प्रयोगों actin cytoskeleton की आकृति विज्ञान के बारे में आधारभूत डेटा की आपूर्ति की. जांच के बाद जटिल cytoskeletal नेटवर्क 11, 12 कल्पना करने के लिए तीन आयामी confocal इमेजिंग शामिल किया है. यह इमेजिंग actin पैच और तंतुओं की बहुतायत और सापेक्ष स्थान की मात्रा का ठहराव परमिट. पतली धारा इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी संरक्षित subcellular संरचनाओं 13 के सापेक्ष घने filamentous नेटवर्क की आकारिकी छवि के लिए इस्तेमाल किया गया है. भीड़ सेलुलर हैएक छोटे पार अनुभाग के साथ ज्ञान प्राप्त किया है कि इस तकनीक के साथ ठीक विस्तार से जांच की जा सकती है. इमेजिंग अध्ययन समय व्यतीत फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कोशिकाओं को जीवित करने के लिए बढ़ा दिया गया है. तस्वीर विरंजन और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति संचालित किया जा सकता है, समय चूक इमेजिंग जांच cytoskeletal प्रोटीन की गतिशीलता और पर्यावरण की स्थिति में 11, 14 के जवाब के रूप में देता है. उधर, इन विट्रो में actin filaments की गतिशीलता के दृश्य के कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी के लागू होने से उन्नत किया गया था. विस्तृत क्षेत्र माइक्रोस्कोपी की तुलना में, TIRF कमी आई पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का लाभ और व्यक्तिगत filaments 15, 16 पर नजर रखने के लिए बढ़ाया विपरीत है. इन गुणों के साथ, TIRF माइक्रोस्कोपी प्लाज्मा झिल्ली 17, 18 में सेलुलर संरचनाओं की निगरानी के लिए सेल जीव द्वारा रूपांतरित किया गया है. Cytoskeleton में परिवर्तन सहित सेलुलर घटनाओं, कर सकते हैं,कम phototoxicity, अधिक से अधिक इसके विपरीत, और न्यूनतम पृष्ठभूमि पुष्पन 19 के साथ वास्तविक समय देखे जा.
बेहतर आंदोलन, स्थानीयकरण, और सेल, TIRF माइक्रोस्कोपी और प्रोटीन टैगिंग में cytoskeletal प्रोटीन के कारोबार पर actin परिवर्तन के प्रभाव को समझने के लिए इस्तेमाल किया गया. इस के साथ साथ, Saccharomyces cerevisiae में cytoskeletal गतिशीलता पर actin में एक चिकित्सकीय प्रासंगिक उत्परिवर्तन के प्रभाव का अध्ययन करने के तरीकों से वर्णित हैं. विशेष रूप से, actin बाध्यकारी प्रोटीन, Aip1p का स्थानीयकरण और आंदोलन, कल्पना और actin में R256H उत्परिवर्तन व्यक्त कोशिकाओं में मात्रा निर्धारित किया गया था. इन तकनीकों में इन विट्रो जैव रासायनिक अध्ययन में पूरक और प्रोटीन बातचीत और कार्यों का एक बड़ा समझ के लिए अनुमति देते हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PB1996 प्लाज्मिड में क्लोनिंग
- डिजाइन और व्यवस्था डीएनए लक्ष्य अनुक्रम पार्श्व और चयनित माता पिता प्लाज्मिड में अद्वितीय प्रतिबंध स्थलों में होते हैं कि एक oligonucleotide निर्माण कंपनी से प्राइमरों. नोट: इस मामले में, प्राइमरों Aip1 अनुक्रम के 5 'अंत में 400 आधार जोड़े बढ़ाना डिजाइन किए गए थे. XhoI प्रतिबंध साइट के बारे में 20 बीपी Aip1 अनुक्रम से पहले प्राइमर में शामिल किया गया था, और XmaI लक्ष्य Aip1 अनुक्रम के बाद के बारे में 20 बीपी शामिल किया गया था. क्लोनिंग के लिए इस्तेमाल किया प्लाज्मिड प्रतिदीप्ति के लिए एक 3XGFP टैग, खमीर तनाव के चयन के लिए एक URA जीन, और बैक्टीरियल चयन के लिए एक एम्पीसिलीन प्रतिरोध जीन होता है जो PB1996 था.
- एक Ura-खमीर अगुणित तनाव से जीनोमिक डीएनए शुद्ध. नोट: क्लोनिंग की प्रक्रिया का एक चित्र के लिए आकृति 1 देखें.
- या तो एन पर प्रतिबंध साइटों के साथ Aip1p जीन बढ़ाना दो प्राइमरों और खमीर जीनोमिक डीएनए का उपयोग एक मानक पीसीआर प्रतिक्रिया भागोडी. पीसीआर उत्पाद डाइजेस्ट और निर्माता प्रति अलग प्रतिक्रियाओं में प्रतिबंध एंजाइमों के साथ PB1996 प्लाज्मिड प्रोटोकॉल की सिफारिश की. इस मामले में XmaI और XhoI 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर साथ बफर के साथ इस्तेमाल किया गया.
- पचा डीएनए टुकड़े अलग करने के लिए एक 0.8% agarose वैद्युतकणसंचलन जेल चला. एक अच्छी तरह से, एक कम डीएनए जन सीढ़ी लोड और, अलग कुओं में, प्रत्येक पाचन से पूरे प्रतिक्रिया लोड. डाई सामने जेल का अंत निकट है जब तक, के बारे में 1 घंटे के लिए 100 वोल्ट पर जेल चला. एक पराबैंगनी प्रकाश के तहत जेल कल्पना और प्रोटीन खंड से मेल खाती है कि खंड और कटौती प्लाज्मिड बाहर शुद्ध.
- पच Aip1 खंड और PB1996 प्लाज्मिड ligate. संस्कृति प्लेटों पर और प्लेट (2 37 डिग्री सेल्सियस पर घंटे के लिए समाज मीडिया में हो जाना, 2 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ, गर्मी झटका पर 30 मिनट के लिए 100 μl कोशिकाओं के साथ 10 μl डीएनए) निर्माता प्रोटोकॉल का उपयोग DH5α कोशिकाओं में उत्पाद रूपांतरण कि इस मामले लेग + में, चयन के लिए एंटीबायोटिक शामिलएम्प प्लेटें. चुने और तरल संस्कृति में एक कॉलोनी बढ़ता है. नए डिजाइन प्लाज्मिड शुद्ध.
2. उत्परिवर्ती खमीर तनाव पीढ़ी
- Actin एलील एक उत्परिवर्ती खमीर तनाव का निर्माण करने के लिए हटा दिया गया है जिसमें एक अगुणित खमीर तनाव का प्रयोग करें. नोट: यह तनाव गुणसूत्र actin के जीन का अभाव है और जंगली प्रकार खमीर encodes कि एक प्लाज्मिड जो इस मामले में, माता पिता के तनाव डॉ. पीटर Rubenstein (आयोवा विश्वविद्यालय) से एक उदार उपहार था और निर्माण कुक एट अल 20 द्वारा वर्णित किया गया था. actin और uracil.
- Mutagenesis के 21 के लिए आधार प्लाज्मिड के रूप में एक टीआरपी + चयन के साथ पीआरएस प्लाज्मिड एन्कोडिंग जंगली प्रकार खमीर actin का प्रयोग करें.
- Actin में missense उत्परिवर्तन इंजीनियर को पीआरएस प्लाज्मिड पर साइट निर्देशित mutagenesis प्रदर्शन करना.
- Actin में R256H उत्परिवर्तन के लिए, प्राइमर 5 उनकी 256 Arg 256 में बदलने के लिए 'ggtaacgaaagattccatgccccagaagc 3' बनाने. एक मानक mutagenesis भागो2.2 कदम से प्लाज्मिड के साथ पीसीआर प्रतिक्रिया.
- DH5α कोशिकाओं में पीसीआर से उत्परिवर्ती actin प्लाज्मिड रूपांतरण. प्लाज्मिड डीएनए को अलग और उत्परिवर्तन सत्यापित करने के लिए actin जीन अनुक्रम.
- 2.1 कदम से अगुणित खमीर तनाव में उत्परिवर्ती खमीर actin एन्कोडिंग प्लाज्मिड रूपांतरण.
- संस्कृति टीआरपी प्लेटों पर बदल कोशिकाओं उत्परिवर्ती खमीर actin प्लाज्मिड युक्त टीआरपी + युक्त खमीर के लिए चयन करने के लिए.
- कोशिकाओं 5 Fluoroorotic एसिड (5 FOA) होते हैं कि प्लेटों पर टीआरपी प्लेटों से उप संवर्धन कोशिकाओं द्वारा जंगली प्रकार actin और uracil (2.1 में वर्णित) encodes कि मूल प्लाज्मिड की कमी के लिए चयन करें. 5 FOA yeas में कार्यात्मक URA3 जीन व्यक्त उपभेदों, विषाक्त फार्म, 5 flurouracil में बदल जाती है. stepwise चयन के बाद बढ़ने कोशिकाओं है कि केवल उत्परिवर्ती actin प्लाज्मिड शामिल होंगे.
- नई खमीर तनाव से प्लाज्मिड डीएनए शुद्ध. उत्परिवर्ती actin के जीन मौजूद है यह सुनिश्चित करने के लिए प्लाज्मिड अनुक्रम. इस S उपयोगआगे के अध्ययन में ट्रेन. इस प्रक्रिया चित्रा 2 में diagrammed है.
3. खमीर कोशिकाओं में प्लास्मिड बदलने
- खमीर गुणसूत्र में एकीकरण की अनुमति के लिए एक प्रतिबंध एंजाइम के साथ Aip1p-GFP प्लाज्मिड डाइजेस्ट. नोट: प्रतिबंध साइट फ्लोरोसेंट टैग, ब्याज की जीन, और चयन मार्कर होता है कि अनुक्रम ब्लॉक के बाहर का होना चाहिए. इस मामले में, 37 डिग्री सेल्सियस पर 8 μl डीएनए और 1 घंटे के लिए साथ 10x बफर के 1 μl साथ HPAI प्रतिबंध एंजाइम की 1 μl का उपयोग
- संस्कृति एस 30 डिग्री सेल्सियस पर एक पहिया पर YPD मीडिया में 5 मिलीलीटर (1% खमीर निकालने, 2% peptone, और 2% डेक्सट्रोज) में रात भर uracil (Ura तनाव) synthesize करने में असमर्थ हैं कि (2.5 कदम से) cerevisiae कोशिकाओं 1000 x जी पर नीचे 5 मिनट के लिए कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर स्पिन.
- प्लेट मिश्रण बनाओ. DDH 2 ओ के 43 मिलीलीटर के लिए 1 एम Tris पीएच 7.5 से 5 मिलीग्राम और 250 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के 2 मिलीलीटर जोड़कर 10XTE बनाओ 00.204 20 1XTE की मिलीलीटर, पॉलीथीन ग्लाइकॉल की तो 8 जी (खूंटी) (मेगावाट ~ 3300) और फिल्टर बाँझ लिथियम एसीटेट के जी.
- 3.2 कदम में नीचे काता कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला छानना और शेष तरल में कोशिकाओं resuspend. निलंबित कोशिकाओं को, 10 मिलीग्राम / एमएल सामन वृषण वाहक डीएनए के 2 μl जोड़ें. 3.1 कदम और भंवर से पचा प्लाज्मिड डीएनए के 10 μl जोड़ें. प्लेट और भंवर के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें. 1 एम डीटीटी और भंवर के 20 μl जोड़ें.
- 25 डिग्री सेल्सियस पर 6-8 घंटे के लिए मिश्रण सेते हीट 10 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में कोशिकाओं को झटका. वे एक Ura थाली पर बाहर बसे हैं जहां microcentrifuge ट्यूब के नीचे से कोशिकाओं की प्लेट 100 μl. 2-3 दिनों के लिए या कालोनियों फार्म तक 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- बाहर एक Ura थाली पर व्यक्तिगत कालोनियों और लकीर का चयन करें. नोट: इन कोशिकाओं के विकास के लिए अनुमति देता है, गुणसूत्र में एकीकृत Aip1-GFP और Ura जीन के साथ प्लाज्मिड होते हैं. इन कोशिकाओं को फिर microsco में इस्तेमाल किया जाएगाpy.
4. कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग Aip1p प्रोटीन आंदोलन Visualizing
- 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात एक पहिया पर YPD में शामिल Aip1p-GFP के साथ खमीर कोशिकाओं की एक संस्कृति के लिए आगे बढ़ें के Ura मीडिया 9 मिलीलीटर में रातोंरात संस्कृति की उपसंस्कृति 1 मिलीलीटर. वे लॉग विकास के चरण में हैं यह सुनिश्चित करने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रकार के बरतन पर एक अतिरिक्त 3-4 घंटे के लिए कोशिकाओं को विकसित.
- एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर कोशिकाओं के 3 μl जोड़ें और एक coverslip जोड़ें. कोशिकाओं 5 मिनट के लिए स्लाइड पर व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें. चरण थाली के ब्रैकेट में स्लाइड रखें.
- उद्देश्य एक तेल विसर्जन 100X TIRF और एक डिजिटल सीसीडी कैमरे का उपयोग कर एक कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोप (488 एनएम) के साथ Aip1p-GFP प्रोटीन का निरीक्षण करें. Slidebook 5.0 सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, (अधिग्रहीत छवियों के व्यक्तिगत तख्ते 2A चित्रा में प्रस्तुत कर रहे हैं) 5 फ्रेम / सेकंड की दर पर 20 सेकंड के लिए छवियों को प्राप्त करते हैं.
- सी पर ध्यान केंद्रित करने के लिएएल्स, खुला Slidebook 5.0 सॉफ्टवेयर और फोकस नियंत्रण का उपयोग करने के लिए उपकरण पट्टी में फोकस विंडो बटन पर क्लिक करें. स्कोप टैब का चयन करें और 100X-TIRF उद्देश्य का चयन करें. पर दीपक मुड़ें और 15% करने के लिए दीपक पट्टी स्लाइड. 2 एक्स 2 के लिए बिन सेटिंग बदलें. उज्ज्वल क्षेत्र को फिल्टर बदलें.
- माइक्रोस्कोप पर, कंप्यूटर स्क्रीन पर देखा के रूप में ध्यान में कोशिकाओं को लाने के लिए ठीक ध्यान डायल का उपयोग करें.
- फोकस विंडो के भीतर नियंत्रण का प्रयोग, दीपक बंद कर देते रहने के लिए फिल्टर बदलने के लिए, और TIRFM बटन पर क्लिक करें.
- माइक्रोस्कोप के दाईं ओर बंदरगाह से जुड़ी TIRFM प्रकाशक पर, लेजर उत्सर्जन बारी.
- फोकस विंडो के भीतर स्ट्रीम टैब का चयन करें, अगली रिकॉर्डिंग शुरू करें और फिर उज्ज्वल क्षेत्र बटन क्लिक करने के लिए बॉक्स को चेक करें.
- TIRFM प्रकाशक पर, लेजर की घटना कोण समायोजित करने के लिए सुक्ष्ममापी बारी. इस Aip1-GFP foci से प्रतिदीप्ति उत्सर्जन का अनुकूलन और से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम करने के लिए प्रयोग किया जाता हैकोशिकाओं और स्लाइड.
- वांछित छवि प्रदर्शित होता है, प्रेस प्रारंभ. 20 सेकंड, प्रेस रोक के बाद. छवियों को बचाने. मुख्य मेनू पट्टी पर फ़ाइल टैब के तहत, इस रूप में सहेजें स्लाइड का चयन करें और फ़ाइल स्थान और नाम दर्ज करें.
- छवियों का विश्लेषण करने के लिए ImageJ सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें. फ्लोरोसेंट Aip1p foci के आंदोलन और दर ट्रैक करने के लिए मैक्रो प्लगइन "मैनुअल ट्रैकर" का प्रयोग करें. 0.2 सेकंड का समय अंतराल पैरामीटर बदलें.
- कार्ट ट्रैक चयन का उपयोग करना, चयन और 4-8 संयोजी फ्रेम के माध्यम से एक व्यक्ति फ्लोरोसेंट प्रोटीन ट्रैक. अंत ट्रैक आदेश का उपयोग करें और प्रत्येक फ्रेम के बीच प्रोटीन आंदोलन का वेग एक परिणाम विंडो में प्रदर्शित करेगा.
- एक माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल स्प्रेडशीट का उपयोग करते हुए प्रत्येक फ्रेम के बीच का मतलब दर निर्धारित करते हैं. ब्याज की प्रत्येक कोशिका तनाव के लिए Aip1p आंदोलन का औसत वेग की गणना करने के लिए मूल्यों का प्रयोग करें. नोट: Aip1p आंदोलन और औसत गैर रेखीय वेग की दर का एक तितर बितर साजिश figu में दिखाया गया है2B रहे हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
छवि के लिए एक विधि सेल में cytoskeletal प्रोटीन की गतिशीलता में प्रस्तुत किया है. actin बाध्यकारी प्रोटीन, Aip1p, GFP के साथ टैग किया गया था. टैग किए गए उत्पाद एनकोडिंग प्लाज्मिड के लिए डिजाइन चित्र 1 में दिखाया गया है. प्लाज्मिड तो खमीर कोशिकाओं में तब्दील किया गया था. Fluorescently की अभिव्यक्ति Aip1p सेल में प्रोटीन व्यवहार के दृश्य की अनुमति दी टैग किया. Aip1p आमतौर पर endocytosis 22 की साइटों पर actin पैच के लिए localizes. चित्रा 2A में दिखाया गया है Aip1p आंदोलन यों, 50 से अधिक फ्लोरोसेंट Aip1p foci, 10 से अधिक कक्षों में ट्रैक किए गए थे. औसत वेग प्रत्येक फ्लोरोसेंट Aip1p क्षेत्र (चित्रा 2B देखें) के लिए गणना की गई. जंगली प्रकार की कोशिकाओं में, Aip1p आंदोलनों एक सेल भर की सीमा होती है, और बाद में गायब हो जाते हैं. जंगली प्रकार की कोशिकाओं में Aip1p के आंदोलन की औसत गति / सेक 1.60 ± 0.42 माइक्रोन है. Actin CY के असामान्य आकृति विज्ञान के लिए जाना जाता R256H उत्परिवर्ती actin, व्यक्त कोशिकाओं23 toskeleton, एक बदल Aip1p phenotype है. उत्परिवर्ती तनाव में, Aip1p आंदोलन प्रतिबंधित और धीमी है. Aip1p आंदोलन की औसत गति 0.88 ± 0.30 माइक्रोन / सेक (पी <0.005) है. Aip1p प्रवास foci एक दूसरे के चारों ओर चक्कर बजाय सेल को पार करने के साथ, तत्काल क्षेत्र तक ही सीमित है. इसके अलावा, Aip1p Aip1 प्रोटीन की धीमी कारोबार सुझाव अब दिख रहा है.
प्लाज्मिड निर्माण के चित्रा 1. आरेख. ए) पीसीआर के माध्यम से परिलक्षित Aip1 टुकड़ा प्रतिबंध एंजाइमों (पीला बोल्ट). बी) प्लाज्मिड, PB1996, प्रतिबंध से पच जाता है से पचा जा रहा दिखाया गया है Abp140 जीन को हटाने के लिए एंजाइमों. सी) पच Aip1 और PB1996 टुकड़े टी ligated कर रहे हैंओ) प्लाज्मिड PB1996 Aip1. डी फार्म PB1996 Aip1 प्लाज्मिड linearized और डीएनए गुणसूत्र में एकीकृत है जहां खमीर कोशिकाओं में तब्दील हो जाता है.
उत्परिवर्ती खमीर actin तनाव निर्माण के चित्रा 2. आरेख. उत्परिवर्ती actin isoform एन्कोडिंग प्लाज्मिड तो एक सेल लाइन में तब्दील हो और मीडिया कमी tryptophan पर विकसित करने की क्षमता के आधार पर चयन किया गया है. हरे रंग की लाइनों गुणसूत्र डीएनए से संकेत मिलता है. काले सर्किल एक प्लाज्मिड है. भूरे रंग चक्र एक खमीर सेल का प्रतिनिधित्व करता है. बक्से प्रत्येक एक विशेष जीन का संकेत: पीला actin है, नारंगी ब्राउन uracil है, leucine है, और गुलाबी tryptophan है. बॉक्स से अधिक एक्स जीन गुणसूत्र डीएनए से हटा दिया गया है इंगित करता है. चरणों में 2.3 और 2.4, actin जीन मैं पर ब्लैक स्टारR256H उत्परिवर्तन ndicates.
चित्रा 3. लाइव खमीर कोशिकाओं GFP टैग Aip1p व्यक्त जंगली प्रकार और R256H कोशिकाओं की. ए) छवियाँ में Aip1p-GFP आंदोलन दिखाए जाते हैं. कोशिकाओं जल्दी लॉग चरण विकास में हैं और छवियों 15 सेकंड के लिए हर 0.2 सेकंड का अधिग्रहण किया गया. तीर उत्परिवर्ती actin उपभेदों के लिए जंगली प्रकार और लाल रंग के लिए नीले रंग समय के साथ एक व्यक्ति फ्लोरोसेंट ध्यान देने का स्थान, निरूपित. पिछले फ्रेम एक हरे रंग की लाइन के रूप में Aip1 foci के मार्ग दिखाता है. पता चला स्केल बार Aip1p आंदोलन की दर ImageJ का उपयोग मापा गया था 5 माइक्रोन. बी) है. तितर बितर साजिश ग्राफ व्यक्तिगत फ्लोरोसेंट foci के लिए दर प्रदर्शित करता है. क्षैतिज पट्टी जंगली प्रकार (नीला) और उत्परिवर्ती (लाल) उपभेदों actin के लिए औसत वेग को इंगित करता है.Aip1p 0.88 की तुलना में जंगली प्रकार की कोशिकाओं में 1.60 ± 0.42 माइक्रोन / सेकंड से चलता ± 0.30 R256H उत्परिवर्ती actin (पी <0.005) व्यक्त की कोशिकाओं के लिए माइक्रोन / सेक.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
रोगजनक म्यूटेशनों पर जांच में cytoskeleton और उपयोगिता की गतिशीलता कल्पना करने के लिए एक प्रभावी रणनीति यहाँ वर्णित किया गया है. उन्नत इमेजिंग रूपात्मकता कोशिका झिल्ली के पास प्रोटीन के intracellular आंदोलन को समझने के लिए नए अवसर पैदा की है. कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRF) जीवित कोशिकाओं में कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक संवेदनशील तकनीक है. TIRF coverslip और जलीय माध्यम के अपवर्तक अनुक्रमित में अंतर के कारण एक क्षणभंगुर क्षेत्र पैदा करता है कि एक angled उत्तेजना लेजर का उपयोग करता है. क्षणभंगुर क्षेत्र की ऊर्जा fluorophores उत्तेजित लेकिन coverslip और पानी के बीच इंटरफेस की दूरी के साथ तेजी से कम हो जाती है. इस शोर अनुपात और coverslip / मध्यम अंतरफलक ऊपर 50-250 एनएम से शक्तिशाली संकल्प करने के लिए एक उच्च संकेत में यह परिणाम है. इन गुणों TIRF माइक्रोस्कोपी कम से जीवित कोशिकाओं में एक अणु के स्तर पर cytoskeletal प्रोटीन कल्पना करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनानेphototoxicity और अन्य तकनीकों से 24 बढ़ाया विपरीत रिश्तेदार - 26.
cytoskeleton सेलुलर जरूरतों के अनुकूल बनाना मिलकर काम कर रहे कई प्रोटीन शामिल है. cofilin द्वारा विनियमन पर actin में म्यूटेशन के कारण संवहनी रोग के प्रभाव को हाल ही में हमारे समूह में 27 से अध्ययन किया गया. हमारे प्रारंभिक निष्कर्षों के आधार पर, Aip1p, cofilin निर्भर actin विच्छेद की सुविधा है कि प्रोटीन बाध्यकारी एक actin, जांच की गई. प्रारंभिक अध्ययन में, actin उत्परिवर्तन R256H विशेष रूप से तनाव की शर्तों के तहत, Aip1p के अभाव में खराब हो जाना व्यक्त कोशिकाओं. इस उत्परिवर्ती actin cytoskeleton के Aip1p विनियमन बदल दिया है कि पता चलता है. फ्लोरोसेंट टैगिंग और TIRF माइक्रोस्कोपी का उपयोग R256H तनाव में आंदोलन और Aip1p का स्थानीयकरण के हमारे विश्लेषण असामान्य गतिशीलता की पुष्टि होती है. भविष्य में, हम कई प्रोटीन का आंदोलन कल्पना करने के लिए विभिन्न fluorophores के साथ इस तरह cofilin के रूप में अतिरिक्त प्रोटीन,, टैग करने की योजनाप्रोटीन बातचीत: एक साथ बेहतर प्रोटीन को समझने के लिए.
एक fluorescently टैग प्रोटीन पैदा करने के लिए कुछ सीमाएं और तकनीक से संभव नहीं है, जहां कुछ उदाहरण हैं. एक फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन की गतिविधि को बाधित या बाध्यकारी भागीदारों के साथ बातचीत बदल सकते हैं. यह एक और actin प्रोटीन बंधन, cofilin टैग करने के प्रयास में सामना कर दिया गया है. टैग किए गए निर्माण की अभिव्यक्ति बाधित cofilin समारोह की वजह से अगुणित खमीर में असफल रहा है. Cofilin खमीर में एक आवश्यक प्रोटीन है. इस प्रकार, सहवर्ती फिर से परिचय बिना cofilin का विलोपन घातक है; एक प्लाज्मिड पर बाद में परिचय को छोड़कर. इस सीमा से बचने के लिए एक ही रास्ता है द्विगुणित खमीर का उपयोग करने के लिए है. Cofilin जीन की एक प्रति एक टैग किया संस्करण exogenously एक प्लाज्मिड पर पेश किया गया था, बाहर खटखटाया, और जीनोमिक cofilin कमी है लेकिन fluorescently प्रोटीन टैग करने की क्षमता थी प्लाज्मिड 22 होते हैं कि बेटी की कोशिकाओं के लिए तो चयन किया गया थापहले इसकी प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पर थोड़ा प्रभाव है दिखाया गया है कि प्रोटीन में आंतरिक अवशेषों को टैग जोड़कर प्राप्त की. प्रोटीन बातचीत: एन या सी टर्मिनस क्षेत्रों में उचित प्रोटीन को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है, जब तक टैग जोड़ने के लिए बेहतर साइटों रहे हैं. यह एक कार्यात्मक प्रोटीन उपज नहीं है, तो वैकल्पिक टर्मिनस या आंतरिक अवशेषों का प्रयास किया जा सकता है.
वर्णित तकनीकों को लागू करने में कुछ महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. एक समारोह का संरक्षण है कि प्रोटीन टैग करने के लिए उपयुक्त स्थान का निर्धारण किया जाता है. मजबूत नियंत्रण प्रोटीन समारोह संरक्षित है कि मान्य करने के लिए शामिल किया जाना चाहिए. दूसरा, स्लाइड कोशिकाओं इमेजिंग के दौरान सुखाना नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए निगरानी की जानी चाहिए. वैक्स अगर जरूरत निर्जलीकरण को रोकने के लिए कवर पर्ची के किनारों के आसपास इस्तेमाल किया जा सकता है. सफलता सुनिश्चित करने के लिए ये कदम प्लाज्मा झिल्ली के पास छवि संरचनाओं के लिए इस दृष्टिकोण विनयशील और लाभप्रद सरल बनाने हैं. योग्यता के रूप में करने की क्षमताजीवित कोशिकाओं में ntify प्रोटीन स्थानीयकरण और आंदोलन सेलुलर कार्यों की समझ बढ़ा सकते हैं. Cytoskeletal प्रोटीन को प्रभावित करने म्यूटेशन की पहचान कर रहे हैं, fluorescently की अभिव्यक्ति टैग प्रोटीन और TIRF माइक्रोस्कोपी pathophysiology अंतर्निहित मानव रोग की जांच के लिए उपयोगी हो सकता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों मूल PB1996 क्लोन के लिए उपयोगी चर्चा और तकनीकी सलाह के लिए पीटर Rubenstein और डेविड Pellman धन्यवाद. यह काम एक मार्च ऑफ डाइम्स से अनुदान और बच्चों के लिए सवारी से धन के द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
- Lehtonen, H. J., et al. Segregation of a missense variant in enteric smooth muscle actin gamma-2 with autosomal dominant familial visceral myopathy. Gastroenterology. 143, e1483 1482-1491 (2012).
- Matsson, H., et al. Alpha-cardiac actin mutations produce atrial septal defects. Hum Mol Genet. 17, 256-265 (2008).
- Zhu, M., et al. Mutations in the gamma-actin gene (ACTG1) are associated with dominant progressive deafness (DFNA20/26). Am J Hum Genet. 73, 1082-1091 (2003).
- Nowak, K. J., et al. Mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene in patients with actin myopathy and nemaline myopathy. Nat Genet. 23, 208-212 (1999).
- Olson, T. M., Michels, V. V., Thibodeau, S. N., Tai, Y. S., Keating, M. T. Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure. Science. 280, 750-752 (1998).
- Riviere, J. B., et al. De novo mutations in the actin genes ACTB and ACTG1 cause Baraitser-Winter syndrome. Nat Genet. 44, S441-442 440-444 (2012).
- Guo, D. C., et al. Mutations in smooth muscle alpha-actin (ACTA2) lead to thoracic aortic aneurysms and dissections. Nat Genet. 39, 1488-1493 (2007).
- Sparrow, J. C., et al. Muscle disease caused by mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene (ACTA1). Neuromuscul Disord. 13, 519-531 (2003).
- Kruth, K. A., Rubenstein, P. A. Two deafness-causing (DFNA20/26) actin mutations affect Arp2/3-dependent actin regulation. J Biol Chem. 287, 27217-27226 (2012).
- Amberg, D. C. Three-dimensional imaging of the yeast actin cytoskeleton through the budding cell cycle. Mol Biol Cell. 9, 3259-3262 (1998).
- Pelham, R. J., Chang, F. Role of actin polymerization and actin cables in actin-patch movement in Schizosaccharomyces pombe. Nat Cell Biol. 3, 235-244 (2001).
- Vavylonis, D., Wu, J. Q., Hao, S., O'Shaughnessy, B., Pollard, T. D. Assembly mechanism of the contractile ring for cytokinesis by fission yeast. Science. 319, 97-100 (2008).
- Bertin, A., et al. Three-dimensional ultrastructure of the septin filament network in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 23, 423-432 (2012).
- Senning, E. N., Marcus, A. H. Actin polymerization driven mitochondrial transport in mating S. cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 107, 721-725 (2010).
- Breitsprecher, D., Kiesewetter, A. K., Linkner, J., Faix, J. Analysis of actin assembly by in vitro TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 571, 401-415 (2009).
- Popp, D., Narita, A., Iwasa, M., Maeda, Y., Robinson, R. C. Molecular mechanism of bundle formation by the bacterial actin ParM. Biochem Biophys Res Commun. 391, 1598-1603 (2010).
- Trache, A., Lim, S. M. Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy. J Vis Exp. (44), (2010).
- Spira, F., Dominguez-Escobar, J., Muller, N., Wedlich-Soldner, R. Visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy. J Vis Exp. (63), e3982 (2012).
- Manneville, J. B. Use of TIRF microscopy to visualize actin and microtubules in migrating cells. Methods Enzymol. 406, 520-532 (2006).
- Cook, R. K., Sheff, D. R., Rubenstein, P. A. Unusual metabolism of the yeast actin amino terminus. J Biol Chem. 266, 16825-16833 (1991).
- Feng, L., et al. Fluorescence probing of yeast actin subdomain 3/4 hydrophobic loop 262-274. Actin-actin and actin-myosin interactions in actin filaments. J Biol Chem. 272, 16829-16837 (1997).
- Lin, M. C., Galletta, B. J., Sept, D., Cooper, J. A. Overlapping and distinct functions for cofilin, coronin and Aip1 in actin dynamics in vivo. J Cell Sci. 123, 1329-1342 (2010).
- Malloy, L. E., et al. Thoracic Aortic Aneurysm (TAAD)-causing Mutation in Actin Affects Formin Regulation of Polymerization. J Biol Chem. 287, 28398-28408 (2012).
- Smyth, J. W., Shaw, R. M. Visualizing ion channel dynamics at the plasma membrane. Heart Rhythm. 5, S7-S11 (2008).
- Bhattacharya, R., et al. Recruitment of vimentin to the cell surface by beta3 integrin and plectin mediates adhesion strength. J Cell Sci. 122, 1390-1400 (2009).
- Hetheridge, C., et al. The formin FMNL3 is a cytoskeletal regulator of angiogenesis. J Cell Sci. 125, 1420-1428 (2012).
- Bergeron, S. E., et al. Allele-specific effects of thoracic aortic aneurysm and dissection alpha-smooth muscle actin mutations on actin function. J Biol Chem. 286, 11356-11369 (2011).
