Summary
Aqui um romance região do protocolo de análise de juros com base na classificação elipses melhor ajuste atribuídos a regiões de sinal positivo dentro de sequências de imagens de lapso de tempo bidimensional é demonstrada. Este algoritmo pode permitir que os investigadores a analisar exaustivamente sinais fisiológicos Ca + 2 com entrada mínima do usuário e preconceito.
Abstract
Ca 2 + intracelular sinais são vulgarmente estudada com corantes de Ca 2 + indicadoras fluorescentes e as técnicas de microscopia. No entanto, a análise quantitativa de Ca 2 + dados de imagem é demorado e sujeito a viés. Algoritmos de análise de sinal automatizado baseado na região de interesse (ROI) de detecção têm sido implementadas para medições de varredura de linha unidimensional, mas não há nenhum algoritmo atual que integra a identificação otimizado e análise de ROI em sequências de imagens bidimensionais. Aqui um algoritmo para rápida aquisição e análise de ROI em sequências de imagens é descrito. Ele utiliza elipses caber aos sinais filtrados de ruído, a fim de determinar a colocação ROI ideal, e calcula Ca 2 + parâmetros do sinal de amplitude, duração e distribuição espacial. Este algoritmo foi implementado como um plug-in gratuito para software ImageJ (NIH). Juntamente com os scripts de análise escritos para o open source software de processamento estatístico R,Esta abordagem proporciona um gasoduto de alta capacidade para a realização de análise estatística rápida da produção experimental. Os autores sugerem que o uso deste protocolo de análise levará a uma caracterização mais completa e imparcial do fisiológica Ca 2 + de sinalização.
Introduction
Ca 2 + é um segundo mensageiro ubíquo molécula sinalizadora e citosólicas de Ca2 + níveis são altamente regulamentados. Ca 2 + intracelular sinais são complexas e incluem transientes isoladas, oscilações, e as ondas de propagação 1-4. Controle espacial e temporal da Ca 2 + é pensado para ser a base especificidade sinal fisiológico e, portanto, a análise de Ca 2 + padrões de sinal é de considerável interesse para os investigadores em vários campos 5.
Corantes de Ca 2 +, como indicador de Fluo-4 e de Fura-2 são normalmente utilizados para medir intracelulares de Ca 2 + sinais com microscopia de fluorescência 5-12. Normalmente, os temporais Ca 2 + sinais são avaliados como alterações dependentes do tempo em média de fluorescência dentro de uma área definida pelo usuário, ou região de interesse (ROI) 5,6,13 - 16. Atualmente, a análise de ROI manual é tanto demorado e trabalho emintensiva, porque requer que os usuários identifiquem muitos ROIs e realizar cálculos repetitivos 17 - 19. Essas técnicas também podem ser sujeitos a considerável erro do usuário, incluindo a introdução de modos de sinal artificiais e exclusão de baixa amplitude ou sinais difusos 18,20.
Algoritmos automatizados de detecção de ROI previamente implementada utilizando uma variedade de métodos estatísticos para determinar a colocação óptima de ROI, mas eles têm sido geralmente limitados à análise de varrimento de linha ou pseudo linha de imagens digitalizadas, que limita a análise a um único dimensão espacial no tempo 17, 19-22. Além disso, muitos algoritmos existentes não são suficientes para abranger a diversidade de Ca 2 + eventos de liberação, que vão desde, transientes localizadas periódicas às ondas que se propagam 23,24. Avaliação abrangente dos fisiológicos de Ca 2 + sinais muitas vezes é ainda mais complicada pela presença de Artif imagem significativaagir que confunde sinal de discriminação de ruído em muitos sistemas experimentais.
Anteriormente, um algoritmo de detecção de solução automatizada ROI para Ca 2 + sinal de detecção transitória, implementado como um plugin para o software ImageJ NIH (National Institutes of Health, Bethesda, MD), foi desenvolvido e validado 25,26. Este algoritmo, chamado LC_Pro, foi projetado para identificar e analisar ROIs abrangendo Ca 2 + transientes de sinal em sequências de imagens de lapso de tempo bidimensionais. Aqui um protocolo experimental e demonstração prática representante de uma aplicação do algoritmo no endotélio das artérias coronárias de suínos é fornecido, com pós-processamento adicional, usando o open source software de processamento estatístico R para gerar a saída gráfica utilizável.
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Protocol
1. Dissection Vessel and Imaging
- Tecido Colheita de suínos juvenis domésticos, conforme descrito no Martens et al 27. Coloque ventrículos direito suínos colhidas em um polidimetilsiloxano (PDMS) prato dissecção inferior contendo tampão HEPES solução salina fisiológica (PSS).
- Com o auxílio de um microscópio estereoscópico, dissecar e remover um segmento da artéria coronária descendente anterior da artéria coronária (~ 8 milímetros de comprimento, 0,5 mm de diâmetro) de tecido circundante, utilizando um fórceps e tesouras mola através da remoção do segmento de vaso a partir das camadas de tecido cardíaco circundantes. NOTA: Tome cuidado para não perfurar a parede do vaso.
- Coloque um bloco PDMS (1 x 0,5 x 0,5 cm) para o prato de dissecação, e usar uma agulha para fixá-lo para o fundo. Cortar um diâmetro de fio de tungstênio, aproximadamente, 40 mM em doze segmentos de comprimento ~ 0,3 centímetros, formando micropins, e colocá-las no prato. Usando fórceps, fixar uma extremidade do segmento do vaso para o bloco com uma micropin.
- Insira com cuidado tesoura pequena mola no lúmen do vaso e cortar longitudinalmente de um lado do navio para abri-lo completamente. Oriente o segmento navio abriu com o endotélio para cima.
- Use as micropins restantes para proteger as fronteiras do segmento de vaso aberto para bloquear tais que a embarcação forma um retângulo plano. NOTA: topos Micropin devem ser dobrados a 90 º e inserido até nivelada com a superfície do bloco. Cuidados devem ser tomados para esticar a preparação navio sem hostes; largura final deve ser ~ 1,5 x a largura não esticada partida.
- Prepara-se uma pequena quantidade (~ 1 ml) da solução de Fluo-4 AM carregamento por mistura de Fluo-4 AM (10 fiM) dissolvido em DMSO com plurico (0,03%) em um tampão HEPES PSS (contendo em mM: NaCl 134, KCl 6 , 1 MgCl, 10 HEPES, 10 glucose), e inserir o bloco inteiro na solução de carga para, aproximadamente, 40 minutos à temperatura ambiente no escuro.
- Após carga, lava-se a blocos de tampão HEPESPSS para 5-10 min.
- Monte o bloco para 50-100 ^ M espaçadores de espessura em uma câmara inferior lamela contendo tampão HEPES PSS. NOTA: pinos de metal podem ser utilizados como separadores e assegurar o segmento navio está voltada para baixo e não tocar os espaçadores.
- Coloque a câmara no palco de um microscópio invertido equipado para imagem confocal, e concentrar-se sobre a camada de células endoteliais.
- Sequências de imagens de lapso de tempo de captura de fluorescência relativa basal para ~ 3 min com ampliação de 20x e uma taxa de quadros de ~ 8 frames por segundo utilizando imagem confocal software seqüência de aquisição.
- Após cerca de 3 minutos de gravação de fluorescência basal, substituir solução tamponada HEPES PSS com o mesmo volume (~ 1 ml) da substância P (100 pM) dissolvido em tampão HEPES PSS, e uma ficha de autopropulsão 3 min.
2. Análise automatizada
- Renderização seqüência (s) imagem da atividade fluorescente de cálcio a partir de software de aquisição confocal como de 8 bits, grayscale '. tif' arquivos de formato sem informação de escala.
- Abrir ImageJ, clique em 'open' no menu arquivo e selecione a imagem seqüência apropriada na janela do Explorer para exibir a seqüência (s) imagem em ImageJ.
- Determinar um diâmetro ROI apropriado usando a ferramenta ROI rectangular para estimar os limites superiores e inferiores da distribuição espacial da actividade dentro da sequência (s) da imagem. NOTA: O diâmetro médio retangular é uma escolha adequada para diâmetro ROI.
- Crie uma nova pasta no disco rígido do computador, e adicione a seqüência (s) imagem para o diretório da pasta.
- No ImageJ, clique em janela 'plugins' e clique em 'LC_Pro' para iniciar a análise.
- Digite o valor do diâmetro ROI e selecione o valor limiar de filtro (ou 0,05 ou 0,01).
- Clique na caixa de seleção "tratamento de drogas" e insira os valores de ponto de tempo imediatamente antes e depois que a droga foi adicionado (em segundos).
- Clique em 'ok', edigite o diretório sequência de imagens para a janela do explorador de arquivos.
3. Saída gráfica
- Baixe a versão 3.0.2 a partir de R http://www.r-project.org/ .
- Abra a versão de R. 32 bits
- Clique em "Arquivo" e depois "script aberto 'e selecione o script de R' traceplot.R 'para gerar relatórios experimentais gráficas.
- Instale a calibrar e gplots pacotes, selecionando 'pacotes', 'instalar pacotes ", e selecionando os pacotes justificativo.
- Clique em 'arquivo', depois 'altere o diretório' comando e usar a janela do explorer para selecionar o diretório que corresponde à saída de análise LC_Pro.
- Clique na janela de script e, em seguida, o "executar todos" comando para executar o script.
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Representative Results
Um algoritmo de costume, LC_Pro, foi desenvolvido e implementado, a fim de realizar a análise automatizada de Ca 2 + dinâmicas em sequências de imagem confocal. Como representado na Figura 1, o algoritmo utiliza módulos de processamento sequenciais que A) detectar e locais de pista de dinâmica de Ca 2 + mudar acima estatística (p <0,01) o ruído, B) definir as regiões de interesse (ROI) automaticamente em centros de sítio activo, e C) calcular intensidades médias de fluorescência em ROIs para determinar parâmetros de eventos específicos. Uma visão gráfica do algoritmo é mostrado por meio de computação gerado impulsos gaussianos de intensidade e localização conhecida (Figura 2). Pulsos de sinal (Figuras 2A e B) foram convertidos para binário usando o z-score para uma distribuição normal padrão, e elipses de melhor ajuste foram atribuídos a pixel de loci acima do limiar de sinal (Figura 2C). Um algoritmo de ordenação elipse foi usada para determinaçãocolocação ne ótimo ROI (Figura 2D). ROI intensidade média versus tempo foi então medida e parâmetros do sinal de amplitude, duração e distribuição espacial foram computados (Figura 2E). Esta abordagem de análise foi aplicada para avaliar Ca 2 + celular dinâmica no endotélio vascular intacto. Especificamente, a imagiologia confocal foi realizada em artérias coronárias suínos abertos como descritos na Figura 3, e o algoritmo foi utilizado para quantificar desligada distintas Ca 2 + parâmetros. Para estas experiências, as gravações contínuas foram realizadas antes e depois da adição do estímulo endotelial, a substância P (SP, 100 pM), e análise LC_Pro foi realizado posteriormente. Para escalar o sinal dentro de cada ROI, linhas de base foram derivados como regressões lineares de intensidade ROI ao longo do tempo experimental (Figura 4). A média dos valores de intensidade de sinal, foram calculados para cada ROI (Figura 4A), e valores acima da média foram truncagem ciado à média e uma regressão linear foi realizada para aproximar o sinal da linha de base (Figura 4B). Finalmente, os valores de intensidade brutos foram divididos pelo valor da linha de regressão para converter valores de dobrar sobre as alterações de linha de base (Figura 4C). Figura 5 mostra uma experiência representativa, incluindo imagens de Ca 2 + de fluorescência dependente do endotélio (Figura 5A), acumular máscaras binários de sinal total de Ca2 + detectado dentro do campo de amostragem (Figura 5B) e gravações de fluorescência média de cada ROI (Figura 5C), antes e depois do tratamento de SP. A análise de parâmetros subsequente foi realizada utilizando o software R. Histogramas resultantes mostram o efeito amplificador de SP em amplitude do evento, duração e distribuição espacial (Figura 6).
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Figura 1. Signal fluxogramas de processos de algoritmos (este valor foi obtido com a permissão de Francis et ai.) 24. O algoritmo foi organizado em três seções: processamento de imagens, processamento de eventos, e região de interesse (ROI) de processamento. Sequências de imagens são de entrada na cadeia de fluxo, e as estatísticas de eventos são gerados como resultado final. O processamento de imagem (A) sub-rotina do algoritmo converte a seqüência de imagens de entrada em uma lista de best-fit elipses por limiar, usando o z-score para uma distribuição normal padrão e análise de partículas ImageJ. Processamento de eventos (B) é uma sub-rotina de triagem usado para determinar a posição ideal ROI organizando locais elipse em eventos "sites" de tempo. Depois de uma medição de intensidade são tomadas em cada ROI, os parâmetros estatísticos para cada evento e local são calculados pela sub-rotina de processamento de ROI (C </ Forte>) para gerar o produto final. BKGD de fundo; AVG, média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Demonstração de aquisição ROI automatizada e detecção de sinal utilizando um pulso de Gauss gerado por computador (este valor foi adaptado com permissão de Francis et ai.) 24. Uma única gerado por computador sinal de impulso (A), foi incorporado em aleatória ruído de fundo. A sequência de imagens em escala de cinza foi filtrado para remover fundo valores de pixels estáticos (B) e convertido para binário usando valores de intensidade de pixel limite de P <0,05 calculado pelo escore padrão (C). ImageJ análise de partículas algorithms foram então aplicadas para a sequência de imagens para atribuir elipses melhor ajuste ao pixel de loci dentro de cada quadro. Um novo algoritmo foi utilizado para elipses grupo em discretas "eventos" temporais e determinar a posição óptima para cada ROI baseada na média centro da elipse (D). Um ROI de raio definido pelo usuário é então colocado em cada posição (círculo pontilhado). Os valores médios de intensidade dentro de uma ROI são calculados para cada quadro e escalado usando uma aproximação da linha de base linear. Amplitude de pico é identificado como máximos locais acima P <0,05, conforme definido pelo escore padrão para um traçado ROI correspondente (E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Porci protocolo de dissecção da artéria coronária ne. Ramos Aproximadamente 0,5 mm de diâmetro x 8 mm de comprimento da artéria descendente anterior coronariana (1 imagem, círculo pontilhada) foram dissecadas do miocárdio circundante. Segmentos do navio foram aparadas de tecido circundante adventícia e corte longitudinal com uma tesoura pequena (segunda imagem). Em seguida, os vasos abertos estavam presos plana para um bloco de PDMS utilizando fios de tungstênio finas (3 imagem). Segmentos de vasos montados foram carregadas com Fluo-4 Ca2 + corante indicador, lavado, e depois colocadas numa câmara de imagem de fundo de lamela. As imagens foram coletadas com ampliação de 20x (488 ex., 510 em.) Em 8,0 frames por segundo, utilizando um microscópio confocal invertido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 4. ROI intensidade média aproximação da linha de base. Após a intensidade média em função da medição do tempo (linhas contínuas) para cada ROI, os valores de intensidade de matérias são dimensionadas para F/F0 utilizando o seguinte método de aproximação da linha de base. A intensidade de sinal média (linha tracejada) durante o período de controle é calculado a partir de controle definida pelo usuário e valores do intervalo de tratamento (A). A curva de intensidade do sinal dependente do tempo é então truncado acima da intensidade de controlo significativo da intensidade média de controlo de filtrar actividade de aproximação da linha de base, e uma regressão linear é executada na curva resultante (linhas pontilhadas) (B). Finalmente, os valores de intensidade matérias são escalados para a linha de base linear computadorizada (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Resultados representativos das análises de LC_Pro basal e estimulada de Ca 2 + dinâmica. Imagens lapso de tempo de uma sequência de imagens de entrada de um intervalo de amostragem basal (A, painel esquerdo), seguido de um intervalo de amostragem estimulada pela substância P (A, painel direito ) são apresentadas em escala de cinza. Sequências de imagens de lapso de tempo de melhores elipses aptos para basal e estimulada intervalos (B) foram rendidos por LC_pro. Finalmente, as curvas de intensidade escalados dependentes do tempo a partir de cada região posicionado automaticamente de interesse (ROI) são mostradas (C).
Figura 6. Histogramasdistribuições de parâmetros de uma experiência representativa (Figura 4). Os histogramas de parâmetros de amplitude de pico (F/F0), duração de ½ max (seg), e spread máximo espacial (mm 2), tanto para o controle (coluna da esquerda) e substância (coluna da direita) os eventos de um experimento representativo estimulou-P foram processados usando R processar graficamente a saída do LC_pro. Notavelmente, a Substância P estimulação aumentou o número de eventos, e causou um deslocamento para a direita significativa da amplitude e duração média pelo teste de Mann-Whitney (p <0,01).
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Discussion
Decodificando complexos Ca 2 + sinais a nível celular e multicelular exigirá abordagens experimentais e analíticos rigorosos. Aqui, é descrito um método em que a sequência de tempo de imagem confocal resolvidos de Ca 2 + dependente de fluorescência são submetidas a uma análise automatizado que identifica e quantifica a Ca 2 + sinais estatisticamente relevantes dentro de campos celulares intactos no caso concreto apresentado, um segmento da artéria foi isolado de coração de porco, preso aberto para expor o endotélio, carregado com o Ca 2 + indicador Fluo-4 AM, submetido a imagem confocal, e avaliados com o algoritmo personalizado LC_Pro. Este algoritmo foi projetado para 1) detectar e locais de pista de dinâmica Ca 2 + mudar acima estatística (p <0,01) de ruído, 2) definir as regiões de interesse (ROI) automaticamente em centros de sites ativos, e 3) analisar intensidades médias de fluorescência em ROIs para determinar os parâmetros de eventos específicos. A abordagemsupera principais limitações da pesquisa de sinalização biológica, reduzindo o erro do usuário e preconceito, reduzindo o tempo de análise off-line, e fornecer um índice completo de sinais através de um campo de discernir perfis representativos ou padrões. Saída de LC_Pro é ainda processado através de scripts R, fornecendo relatórios de parâmetros completos para experiências individuais, incluindo saída gráfica de alta qualidade.
Vários passos são importantes para o desempenho adequado da técnica descrita. O procedimento de dissecção de tecidos (passo 1.1.1) deve ser realizado com cuidado, a fim de evitar a desnudação ou dano da camada de células endoteliais. Além disso, seqüências de imagem deve estar no formato adequado (passo 2.1) para a região automatizada de algoritmo interesse para funcionar corretamente. Por exemplo, se houver informação de escala associado ao arquivo, as regiões de interesse serão incorretamente colocado de acordo com os locais de pixels, em vez de os locais de unidade em escala. Além disso, a escolha de um re adequadagião de diâmetro interesse é fundamental para realizar corretamente a análise automatizada da atividade fluorescente dentro de uma seqüência de imagens. Um valor muito pequeno diâmetro pode resultar em medições redundantes, enquanto muito grande diâmetro resultará na exclusão de sinais sutis.
Armadilhas potencial desta técnica referem-se principalmente a sensibilidade da análise automatizada para xy mudanças em sequências de imagens gravadas e para sinalizar a saturação e / ou branqueamento, que pode resultar em resultados falso-positivos ou falso-negativos. Desvios dimensionais ou mudanças podem ser endereçados diretamente através do uso de software de registro de pilha e designação precisa dos intervalos em que as perturbações são introduzidas. Os níveis de cinza e parâmetros de diâmetro ROI também pode ser otimizado para uma determinada preparação, antes da coleta de dados, a fim de padronizar os conjuntos de dados brutos.
Porque ele serve como uma abordagem padrão para qualquer sinal de fluorescência dinâmica, a análise descrita hantes é apropriado para um conjunto diversificado de aplicações. Na vasculatura, este método está a ser utilizado para definir fisiológica característica e modalidades de sinal fisiopatológicas em vários leitos vasculares sob condições basais e estimuladas 25,26. Também está sendo aplicada no monitoramento automatizado de Ca 2 + ondas. Em última análise, tal análise automatizada global será um pilar fundamental para decifrar espacial e temporalmente complexo bio-sinais e no estabelecimento de novos modelos de celular e multi-celulares.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte pelo Instituto Nacional de Bolsas de Saúde HL-085887, HL-092992, S10RR027535 e MOP-93676.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection dish | Fisher Sci | #08-772-70 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Sci | #NC9644388 | elastomer kit, must be molded into dishes |
| HEPES-buffered PSS | Sigma | #H3375-250G | HEPES acid |
| Stereomicroscope | Nikon Inst. | #MNA42000 | |
| Forceps | Fine Science Tools | #11223-20 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Tungsten wire | Scientific Inst Svcs | #406 | |
| Fluo-4 AM | Life Tech. | #F-14201 | |
| Pluronic F-127 | Life Tech. | #P3000MP | |
| Metal pins | Fine Science Tools | #26002-10 | |
| Cover-glass bottom chamber | Custom designed | ||
| Spinning disc confocal microscope | Perkin Elmer | RS-3 | |
| ImageJ software | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | ||
| LC_Pro plugin for imageJ | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html | ||
| R software | download at: http://www.r-project.org/ | ||
| R traceplot script | download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing |
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