ניתוח רקמות שריר השלד לקביעת תכונות מבניות, תפקודיות וביוכימיות מקל מאוד על ידי הכנה מתאימה. פרוטוקול זה מתאר שיטות מתאימות להכנת רקמת שריר השלד למגוון רחב של מחקרי פנוטיפ.
מאמר שיטה
Triage רקמות ומקפיאים למודלים של מחלות שרירי שלד
במאמר זה
סיכום
תקציר
שריר שלד הוא רקמה ייחודית בגלל מבנהו ותפקודו, אשר דורש פרוטוקולים ספציפיים לאיסוף רקמות כדי להשיג תוצאות אופטימליות מהערכות תפקודיות, סלולריות, מולקולריות, ופתולוגיים. בשל התחכום של כמה ליקויים פתולוגיים לראות בהפרעות שריר מולדות ופוטנציאל לקיבעון להפריע להכרה בתכונות אלה, הערכה פתולוגית של שריר קפוא עדיפה על שרירים קבועים בעת הערכת שרירי שלד למחלת שרירים מולדת. בנוסף, הפוטנציאל לייצר חפצי הקפאה חמורים בשריר דורש אמצעי זהירות מיוחדת בעת הקפאת שרירי שלד לבדיקה היסטולוגית, שאינם נפוץ בעת הקפאת רקמות אחרות. כתב יד זה מתאר פרוטוקול להקפאה מהירה של שריר שלד באמצעות isopentane (2 מתילבוטאן) מקוררת עם חנקן נוזלי כדי לשמור על מורפולוגיה שרירי שלד אופטימלית. הליך זה הוא גם יעיל עבור freezing רקמה מיועדת לביטוי במחקרים גנטיים או חלבון. יתר על כן, יש לנו משולב פרוטוקול ההקפאה שלנו להליך רחב יותר, המתאר גם שיטות מועדפות לקביעת סדרי העדיפויות לטווח הקצר של רקמה (1) לימודים תפקודיים סיב בודד ו( 2) תרבית תאים והיצמדות למנגנון, עם דגש על המאמץ המינימאלי הדרוש כדי לאסוף רקמות ולהעביר אותה למעבדות מחקר או התייחסות מיוחדות כדי להשלים את הלימודים האלה. בסך הכל, כתב היד הזה מספק קווי המתאר של כמה רקמות טריות יכולות להיות מופצות בצורה יעילה עבור מגוון רחב של מחקרים פנוטיפי ובכך מספק נהלי עבודה סטנדרטיים (SOPs) למחקרים פתולוגיים הקשורים למחלת שריר מולדת.
מבוא
שריר השלד הוא רקמה ייחודית בגלל המבנה והתפקוד שלה, מה שיכול להוות מספר אתגרים בעת הערכת הפתולוגיה שלה. אמנם מספיק, ולעתים קרובות אפילו אופטימלי, להעריך את רוב הרקמות לאחר קיבוע פורמלין והטמעת פרפין, אך תהליך זה מוביל לייצור של חפצי התכווצות תאים הפוגעים בהערכת פנוטיפים קריטיים במחלת שרירים מולדת (כולל גודל וצורת מיופייבר). בנוסף, שריר קפוא נדרש בעת ביצוע כתמים היסטוכימיים רבים (כולל ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד מופחת (NADH), ציטוכרום אוקסידאז (COX), סוקסינט דהירוגנאז (SDH), אדנוזין טריפוספטאז (ATPase) וכתמי שמן אדום O) החיוניים לאיתור חריגות פתולוגיות ספציפיות הנדרשות לאבחון מגוון מיופתיות מולדות, מיופתיות מיטוכונדריאליות ומחלות אחסון. כתוצאה מכך, נוגדנים וכלים מולקולריים רבים המשמשים לאפיון המורפולוגיה והתפקוד של השרירים פותחו ומותאמים רק לרקמות קפואות, מה שמגביל עוד יותר את התועלת של תכשירי רקמות קבועות במחקרים על ביולוגיה של שרירי השלד. כתוצאה מכך, זה הפך לנוהג סטנדרטי להקפיא דגימות שרירי שלד עבור רוב ההתוויות הקליניות והמחקריות בתחום מחלות שרירים מולדות, למרות האתגרים הטכניים שהקפאה מתאימה עלולה להציב בפנינו.
הקפאת שרירי השלד יכולה להיות מאתגרת מבחינה טכנית בשל הסבירות הגבוהה להיווצרות גבישי קרח בתוך סיבי שריר כאשר מקפידים על פרוטוקול הקפאה לא מתאים1. ברוב המקרים, חפצי הקפאה נתקלים כאשר תכולת המים של הרקמה גבוהה מדי או כאשר תהליך ההקפאה איטי מדי. ניתן להגדיל בטעות את תכולת המים ברקמה על ידי טבילה בנוזל, כגון הובלת השריר במי מלח; או שההקפאה עלולה להיפגע אם הרקמה שקועה כולה ב-OCT. שני ההליכים הללו עלולים להוביל להקפאה קטסטרופלית של חפצים ברקמת השריר. בנוסף, מספר טעויות קטנות בתהליך ההקפאה עלולות לגרום להקפאה איטית או להפשרה מקרית של דגימות לאחר הקפאה מתאימה, ובעיות אלו עלולות לסבך באופן דומה את ההערכה הפתולוגית.
ככל שיפותחו מודלים וטיפולים חדשים למחלות שרירי שלד, יהיה שימושי יותר ויותר להשתמש בהליכי הפעלה סטנדרטיים (SOPs) כדי להעריך פנוטיפים של שרירי השלד ויעילות הטיפול. זה חשוב במיוחד להערכה פתולוגית של מחלות שרירים מולדות, שכן הזיהוי של פנוטיפים עדינים הנראים ברבות מההפרעות הללו עלול להיפגע על ידי הכנת רקמות לא נכונה. דוח זה מייצג מאמץ של קונסורציום מחלות שרירים מולדות להקים SOP להקפאת שרירי שלד לחקר מודלים של מחלות שרירים מולדות.
הפרוטוקול המוצג כאן מתאר אסטרטגיה המשמשת במעבדות הקליניות והמחקר שלנו כדי לייעל את ההערכה של פתולוגיה של שרירים קפואים, תוך התאמה למגוון מחקרים מבוססי חלבון וגנטיקה. מוצגות גם אסטרטגיות ספציפיות להכנת דגימות שרירי שלד למיקרוסקופ אלקטרונים. בנוסף, מכיוון שבדיקה פונקציונלית של סיב בודד של רקמות קפואות אפשרית2,3, מומחים בטכניקות אלה סיפקו פרטים על פרוטוקולי טיפול אופטימליים ברקמות. למרבה הצער, לא ניתן לבצע ביעילות בידוד של קווי תאים מיובלסטים על רקמות קפואות מראש, ולכן מוצגת כאן אסטרטגיה לאחסון והובלה לטווח קצר של רקמת שריר להקמת תרבית מיובלסט במעבדות חיצוניות. בסך הכל, השיטות המתוארות כאן מספקות הנחיות לעיבוד מתאים של רקמת שריר למגוון מחקרים פתולוגיים, פונקציונליים, מולקולריים ותאיים, ללא קשר ליכולות באתר של מעבדה נתונה.
פרוטוקול
תווית המכולות שתשמש לאחסון שריר עם מזהים מתאימים לבעלי החיים ובשרירים שנקטפו. טרום לקרר את השקיות / מיכלים ומכשירים כדי למנוע הקפאה / הפשרת הרקמות כאשר הוא הוסיף.
1. שיקולי לימודי עיצוב לאוסף רקמת שריר
- לחיה קטנה מודלים (עכבריים) של מחלת שרירים, אנחנו משתמשים בכל שריר למחקר, כיוון שמודלים של בעלי חיים קטנים לעתים קרובות דורשים הערכה של כל שריר על מנת לספק דגימת myofiber מספיק למחקרים פתולוגיים. לחיה גדולה מודלים (כלבים) של מחלת שרירים, שימוש בחלקי שריר כי הם לפחות 0.3 x 0.3 סנטימטר או יותר בהיבט הרוחבי שלהם (חתך).
הערה: ניתן להשתמש גם ביופסיות ליבה, אך הוא עשוי להיות לא טובים ללימודי אפיון ראשוניים עקב בעיות דגימה. - למחקרים שכלל sarcomere, מדידת ultrastructural אורך sarcomere עשויה מהווה נקודת סיום קריטית ועשויה requזעמם התמחה בטיפול. זה בדרך כלל רלוונטי רק במחלות שבו אלמנטים של אורכים בלתי הולמים מופע sarcomere, כמו בכמה גורמים למיופתיה nemaline. מעבדות שמעדיפות לתקן את השרירים במצב שאינו נדבק או מתוח שלה, ולא בביצוע מדידות אלה על שריר אינו מתוח או לא מתוח.
- אם אורך sarcomere לא יימדד, לתקן רקמת השריר בלי טרום מתיחת השריר על ידי הצבת אותו ישירות לתוך מקבע EM הרצוי (ראה ריאגנטים).
- אם אורכי sarcomere יימדדו, כמה טכניקות מראש למתוח את השרירים (ראה דיון) ניתן להשתמש:
- השתמש במכשיר הידוק להחזיק את השרירים במתח המנוחה שלו בזמן שהוא עדיין בבעלי החיים, בלו, השרירים סביב החלק החיצוני של המהדק, ולמקם אותו ישירות לתוך מקבע EM הרצוי (ראה ריאגנטים).
- למתוח ולהדק את השריר למשטח (כמו חתיכה של פקק) באורך דומה לזה שנצפה in vivo לאחר שחולץ מבעלי החיים.
2. תת לחלק את השרירים שלד המבודדים לרסיסים שמתאימים ללימודים רצויים (איור 1)
- לבדיקת רקמות שריר קפוא:
- כולל כמה שיותר שריר נתון ככל האפשר כדי למזער את ההטיה דגימה (ראה שלב 1.1), אבל דגימות צריכה להיות <1.5 סנטימטר, כדי למנוע הקפאת חפצים.
- לטפל בכל השרירים מאותו המחקר באופן דומה, כדי למנוע הבדלי artifactual בגודל סיבים, בשל הבדלים בטיפול.
- למיקרוסקופ אלקטרונים (EM):
- חותכים ~ 0.5 x 0.2 x 0.2 רצועת ס"מ של שרירים מן המדגם, עם ציר האורך של המדגם מקביל לציר האורך של השריר המקורי.
הערה: מקבע לא כראוי לחדור חתיכות עבות של רקמה, ולכן שמירה על עובי דגימה ב2 מ"מ או פחות הוא קריטי בהשגת תוצאות מתאימות. בנוסף,ככיוון של שברים קטנים כזה של שרירים הוא לעתים קרובות קשה, מומלץ לשימוש שבר של רקמה המחקה את הכיוון האמיתי של השריר (כלומר, ההיבט הארוך ביותר של הדגימה קבועה הוא הנטייה האורך של השריר / myofibers) כדי למזער את הטיפול ובלבול במהלך עיבוד EM.
- חותכים ~ 0.5 x 0.2 x 0.2 רצועת ס"מ של שרירים מן המדגם, עם ציר האורך של המדגם מקביל לציר האורך של השריר המקורי.
- לתרבית תאים:
- תשואת התא הרצויה עשויה להשפיע על כמות השרירים הנדרשת להקמת תרבית תאים. שרירים יחיד (או חלקים של שרירים) מבעלי חיים קטנים עשויים לספק מספרים סלולריים מספיקים כדי לבסס בתרביות תאים, כך שאם יש צורך, רקמות בריכה משרירים מרובים.
3. קיבוע רקמות ועיבוד למיקרוסקופי אלקטרונים (EM)
- הנח שבר של שרירים שאינם עולים על 2 מ"מ בממד הדק ביותר שלה ישירות לתוך מקבע EM הרצוי (ראה ריאגנטים).
- הנח את השרירים בחיץ מקבע EM (ראה ריאגנטים) לאחר 2-48 שעות של fixatiהלאה. קיבעון ממושך (שבועות או חודשים) יכול לגרום לאובדן פרטי ultrastructural על מחקרי EM.
- שלח למתקן גרעין EM לעיבוד.
4. מקפיא שריר להיסטולוגית, ביוכימיים, ומולקולרי לימודים
- הסר לחות מוגזמת בדגימה ידי סופג ביסודיות את הדגימה עם מגבת נייר עד הרקמה היא מעט חסיד אל המגבת. לחות מוגזמת תהיה לייצר חפצי הקפאה משמעותיים בשריר.
הערה: רקמות יכולות להיות מיובשות נוספות על ידי מגלגל אותו באבקת תינוקות. שלב זה הוא בדרך כלל לא הכרחי לשרירים, אלא אם כן הם היו בסביבת יתר על המידה לחה. - הנח אוקטובר (או דבק דומה כגון נכאת מסטיק) בחלק התחתון של cryomold רדוד או בפקק, רק עם מספיק אוקטובר כדי לספק בסיס לשריר בכיוון (איור 2 ג). תיוג הפקק או cryomold לפני ההקפאה עשויה להיות שימושי עבור מעקב דגימה.
- Carefully למקם את השריר לתוך התבנית בכיוון הרצוי, עם רוב של השריר הבולט מאוקטובר, כך ששרירים מחולקים הוא לא במגע עם אוקטובר (איור 2 ג).
- הוספת isopentane לכוס מתכת עד שהוא מגיע לעומק של כ 3-4 סנטימטר.
- לבש כפפות בטיחות תרמית ולהסיר את המכסה של דיואר.
- הנח או להחזיק כוס המתכת במגע עם החנקן הנוזלי, כך שהרמה של חנקן נוזלי בצד החיצוני של הכוס היא מעל לרמה של isopentane בצד הפנימי של הכוס. אסטרטגיות לארגן מכולות אלו מוצגות באיור 2.
- אל תאפשר לחנקן נוזלי להיכנס לכוס המתכת, כפי שהיא מייצרת קצף מבעבע שיכול להיות מסורבל לעבוד עם (וגם קר מספיק להקפאה).
- שים לב isopentane כדי לקבוע מתי זה הגיע לטמפרטורה המתאימה. בטמפרטורה המתאימה (בצורה אופטימלית בין -140 ל-149 מעלות צלזיוס), ולכןהחלוקים לבנים מכסה isopentane הקפוא יהוו (לאחר כמה דקות, ולאחר שהערפל הראשוני נעלם מעל isopentane) בחלק התחתון של הכוס, או הפתרון יהיה בדרך כלל לעבות לעקביות של מולסה. הקפאה לפני שלב זה תניב atifacts הקפאה.
- אם isopentane לחלוטין קופא מוצק, להפשיר ולצנן אותו לטמפרטורות מקפיאות שוב לפני השימוש הבא.
- בעזרת מלקחיים טרום צוננים, להנמיך את הדגימה ופקק / תבנית לתוך isopentane לכ 10-20 שניות.
- הנח את הדגימה קפואה לתוך מכולה מקוררת מראש.
- שמור על דגימה ומכל על קרח יבש בכל העת עד להעברה למקפיא -80 מעלות צלזיוס.
5. אם חפץ הקפאה הוא הווה ברקמות כבר קפוא, ניתן לשפר את התואר של חפץ מקפיא שימוש בעקבות "ההפשרה ויקפיא" נוהל
- קח בלוקים מהמקפיא, אחד בכל פעם, ולשמור אותם על קרח יבש. העיתוי של פרוטוקול זה הוא קריטי. להפשיר בלבד ויקפיא בלוק אחד בכל פעם.
- להעביר דגימה מקרח יבש RT.
- אם המדגם היה מוטבע אוקטובר, להסיר אוקטובר מקיף לחלוטין כמו אפשרי באמצעות אזמל.
- לאפשר את המדגם כדי להפשיר ב RT עד לנקודה שבה הוא מופשר לחלוטין, אבל לא עד לנקודה שבה הוא מתייבש.
- בעדינות לדרבן את הדגימה עם מלקחיים כדי להבטיח כי הדגימה היא מופשרת לחלוטין לפני שממשיכה לשלב הבא.
- להקפיא את השרירים כמפורט בצעדים 4.1-4.10.
6. הכנת שרירים לבדיקות פונקציונליות קלוף סיב בודד
- הליך האחסון לשריר תלוי בכאשר השריר / הסיבים נמצא בשימוש לניסויים.
- לשימוש בתוך כמה שבועות, הנח את השרירים בתמיסה של 50% glycerol/50% מרגיעים פתרון (ראה ריאגנטים), ולאחסן ב -20 ° C.
- לירכי שימושאה כמה שבועות, הנח את השריר בפתרון של 75% glycerol/25% מרגיעים פתרון (ראה ריאגנטים), ולאחסן ב -80 ° C.
- לחלופין, בואו שריר יבש, סיכה לפקק, וחנות בגרגרי סיליקה ב-80 ° C. שרירים מיובשים אלה יכולים לשמש במשך שנים.
7. הכנת השריר טרי למשלוח של תרבית תאים למעבדות חיצוניות
פרוטוקולים להקמתה של תרביות תאים תוארו היטב במקומות אחרים 4-7.
- מלא צינור חרוטי סטרילי 50 מיליליטר עם תקשורת צמיחה מלאה סטרילי.
- הוסף את רקמת השריר לצינור באמצעות מלקחיים סטריליות, הצללה הרקמה בתקשורת לחלוטין.
- למלא את שארית הצינור עם תקשורת כדי למנוע התייבשות במהלך משלוח.
- להוסיף שקיות קרח לארגז הקלקר ולמקם את צינור חרוטי ליד מספר שקיות קרח.
- שים לב שיש להשתמש רק שקיות קרח (לא וקרח יבש)כדי למנוע נזק מההקפאה של הנוזלים ורקמות.
- O חבילות ספינה / N, אבל רקמות יכולות להימשך 2 ימים בתנאים אלה.
תוצאות
לספק דוגמאות של החפצים ראו עם הקפאה לא תקינה, כמה שרירי הארבע ראשי עכבר הוקפאו תוך שימוש בטכניקות שונות (איור 3) כדי לשכפל טעויות נפוצות בנתקלו. כפי שמוצג באיור 3 א, שרירי שלד כראוי קפוא תערוכות פרד הדוק של myofibers לרקמה שמסביב (בדרך כלל סיבי שריר אחר, אבל לפעמים מרחב endomysial בין myofibers מלא עם סיסטיק או תאים דלקתיים במגוון רחב של מחלות או תהליכי פציעה) ו תא cytoplasmic נראה בבירור. לניתוח פתולוגי, היכולת להציג את המרחב תאיים היא לעתים קרובות חשובה יותר מתא endomysial, כפי שהיא בדרך כלל קריטי כדי לזהות את נוכחותם של שינויים ניווניים, שינויי משובי, או ממצאי pathognomonic אחרים (גרעינים מרכזיים, תכלילים תאיים) בזה באופן ברור חלל. לפיכך, נוכחותם של גבישי קרח בתא תאיים מייצגת בבוקרהבעיה ajor בהערכה פתולוגית של שריר.
הקפאה נכונה של רקמת שריר דורשת גם טמפרטורות קרות מספיק ומהירות מספקת של הקפאה, כדי למנוע היווצרות של גבישי קרח. גם כאשר חשבונאי שני הגורמים, חפץ הקפאה ניכר עדיין יכול להתרחש בגלל לחות מוגזמת בתוך רקמת השריר. בעיה זו נתקלה לרוב ברקמת שריר ששקועה בעבר ובמלוח מספיק מיובשת או כאשר שרירים כבר במגע ישיר עם OCT ההרכבה מדיה באתר של חתך (איור 3B, 3E). אמנם קשר מסוים עם אוקטובר הוא בדרך כלל בלתי נמנע כתוצאה מתהליך ההרכבה, כל מאמץ צריך להיעשות כדי להימנע ממגע בין האזורים שיוערכו בהיסטולוגיה ואוקטובר משמשים להרכבה. לעומת זאת, דגימות קפואות באמצעות -80 ° C במקפיא (איור 3 ג) וחנקן נוזלי (איור 3D) מספקות דוגמאים של חפץ ההקפאה כי הוא מיוצר על ידי הטמפרטורה או מהירות הכי מוצלח של הקפאה. תהליך ההקפאה האיטי נתקל על ידי הצבת רקמות במקפיא -80 ° C מספק דוגמא קיצונית של הקפאת חפץ. בעת השימוש בחנקן נוזלי, הבעיה העיקרית היא שהמגע בין חנקן הנוזלי והרקמה גורם לנדן של חנקן גזים כדי ליצור בממשק רקמה נוזלי, והממשק דמוי גז הזה הוא לא קר מספיק כדי לייצר שרירים מהירים הקפאת 1. זה יכול לייצר חפץ הקפאה משמעותי בקרבת פני השטח של הדגימה, אבל האזורים הפנימיים של הדגימה יש סיכוי גבוה יותר לבזק להקפיא בקצב מתאים ועשויים להיות לא חסכו כולו מהקפאת חפץ. בעוד הטבילה הפשוטה של רקמת שריר בחנקן נוזלי אינה מתקרבת לזו שימושית כתהליך הקפאת isopentane, זה יכול להיות שימושי להקפאת דגימות שריר גדולות במצבים שבם isopentane אינה זמין (כגון דגימות נתיחה שלאחר המוות קליניות במוסדות עםמעבדות פתולוגיה קליניות שרירים החוצה). תוצאות שימוש באסטרטגיה זו הן בדרך כלל טוב יותר בעת שימוש במנות גדולות של רקמה (> 2 סנטימטר בכמה ממדים).
בעוד שההימנעות מחפץ ההקפאה מספקת תוצאות היסטולוגית אופטימליות, טכניקה יש גם פיתחה (ושתתואר בהמשך) שהופך באופן משמעותי הקפאת חפצים כדי לאפשר ההערכה של רקמה לא תקין קפוא. רקמות שהוקפאו בצורה לא נכונה (איור 3E) יכולות להיות מופשרת וrefrozen בתנאי פיקוח הדוק (איור 3F), כדי לאפשר חלוקה מחדש של מים בתוך הסיבים, ואת מידת שימור מורפולוגיים שהוא בר השגה יכולה להיות מצוינת. מניסיוננו, תהליך זה משמר את המורפולוגיה תאית של הרקמות למידה ראויה לציון, אבל זה לעתים קרובות מייצר הפרדת artifactual של סיבים בתוך המרחב endomysial. כפי שרבי נקודות קצה הפתולוגי נמצאות במרחב תאיים ואלה בחלל endomysial הם נראים במיטבו באמצעות כתמים מיוחדים (או כדי להדגיש סיסטיק או לזהות סוגי תאים אחרים), שינויי artifactual אלה הם סביר באמת לפגוע בהערכה פתולוגית של שריר.
איור 1. Triage של רקמה למחקרים מבניים, פונקציונליים, וסלולריים של שריר שלד. בהתאם לסוגי המחקרים הרצויים, רקמת שריר שלד שנאסף יכולה להיות מעובד במגוון של דרכים להשגת תוצאות אופטימליות. הפרוטוקולים שתוארו במאמר זה מתארים שיטות לtriaging או עיבוד דגימות שריר שלד ללימודים מחוץ לאתר כדי לייעל את תוצאות השגה ממתקני גרעין מומחה.
איור 2. דוגמאות למנגנונים המשמשים להקפאת שרירים. כפי שתוארו בפרוטוקול, הקפאת שרירים אופטימלית דורשת טבילה של רקמת שריר בisopentane שהיא בטמפרטורת הקיפאון שלה. אמצעי בטוח ויעיל של קבלת isopentane קר כקרח כרוך בשימוש במכל מתכת לisopentane שהוא מקורר בדיואר סביב המכילים חנקן נוזלי. כפי שהוא לעתים קרובות נוח לשניהם יש הידיים חופשיות, אפשר להשתמש בסד כגון טבעת לעמוד () להחזיק את מיכל isopentane בחנקן הנוזלי תוך מניעת התערובת של שני נוזלים. לחלופין, המכל יכול גם להיות מוחזק בחנקן הנוזלי באופן ידני (B). בכל מקרה, הרקמה לא צריכה להיות ממוקמת לisopentane עד isopentane הוא הקפאה בעליל בחלק התחתון של המכל (בדרך כלל החלוקים לבנים אטומים כ), ולאחר מכן צריך להיות שקוע ל10-20 שניות כדי לאפשר להקפאה מוחלטת. Isopentane בטמפרטורת הקפאה מייצר "ערפל" מינימאלי, (כלומר, הטמפרטורה אינה מספקת, אם ערפל ניכר הוא בהווה). לאחר הרקמה קפוא, למקם אותו ישירות לתוך מכולות מקוררות מראש (ולאחר מכן ישירות לקריר או במקפיא) כדי למנוע הפשרה בשוגג לאחר ההקפאה. שריר קפוא (C) רכוב כמתבקש צריך להיות רוב של רקמת השריר הבולטת מבסיס של OCT הקפוא.
איור 3. דוגמאות להקפאת חפץ, ושל הפשרה / refreezing היעיל. נציג תמונות של שרירים כראוי isopentane קפוא (א), (ב) שריר קפוא כראוי בisopentane, אבל בזמן במגע עם מדיום ההרכבה אוקטובר, הוקפא שריר (C) במקפיא -80 ° C, ו (ד ) קפואים בחנקן נוזלי, אשר כולם להציג בדרגות שונות של הקפאת חפץ. כפי שניתן לראות ב( ב '), התוכן הנוזלי הגבוה של אוקטובר מייצר חפץ הקפאה משמעותי בשריר שנמצא בקשר עם זה, יש להשתמש בכמות המינימלית, כך שרק של אוקטובר הנדרשת להרכבה, והשרירים להערכה היסטולוגית צריכים להיות "מעמד מתוך "מפני השטח שלו. האיטיות של תהליך ההקפאה באמצעות (C) -80 ° C במקפיא או (ד) חנקן נוזלי (ביחס למהירות של ההקפאה בisopentane הקרה כקרח) יכולה להוביל לייצור של חפץ הקפאה משמעותי. E פנלים ושרירים מופע F מאותה הדגימה שהייתה (ה) תחילה suboptimally קפוא (עקב מגע מוגזם עם אוקטובר) ולאחר מכן (F) מופשרת וrefrozen תוך שימוש בטכניקה שתוארה במסמך זה. בעוד שניתן לראות כמה הפרדת artifactual בין סיבים במדגם מקפיא i השיפורn המורפולוגיה תאית של סיבי השריר היא ברורה ממבט ראשון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
דיון
שריר שלד הוא רקמה מבנית ופונקציונלי ייחודי, והליכי הכנה מיוחדים נחוצים כדי לאפשר ההערכה האופטימלית של פרמטרים מבניים ותפקודיים. בעוד מגוון רחב של רקמות קפואים בדרך כלל למחקרים פתולוגיים בהקשרים קליניים ומחקר, פרוטוקולי הקפאה לרקמות שריר שאינו כוללים בדרך כלל טבילה הכוללת של הרקמה ב אוקטובר לפני ההקפאה. כפי שניתן לראות באיור 3, פרוטוקול כזה אינו מתאים להערכה פתולוגית של שרירי שלד, ובכל זאת הוא דומה מספיק לפרוטוקול המתואר כאן כי מדובר בטעות בדרך נתקלה. המטרה של מאמר זה היא לספק לפרוטוקול פשוט לטיפול נאות של שרירים כדי למנוע בעיות כמו זה. ייעוץ גם כבר מלוקט על הטיפול נאות של שרירים לפיסיולוגיים מחוץ לאתר ומחקרים הסלולר במאמץ להקל על הרכישה של נתונים באיכות גבוהה על ידי מעבדות ליבה מחוץ במקרי wheמחדש את הלימודים באתר אינם עדיפים או אפשריים.
כפי שצוין בפרוטוקול זה, אלמנטים שהם חיוניים בעיבוד הנכון של שרירים ללימודים פתולוגיים כוללים מזעור תכולת המים של הרקמה, ומקטינה את הטמפרטורה שבה השרירים הוא קפוא, ולהגדיל את המהירות שבה הקפאה מושגת. לחות מוגזמת בתוך הרקמה או האיטיות מוגזמת של תהליך ההקפאה (המיוצר על ידי טמפרטורות מספיקות או על ידי חוסר קשר ישיר בין סוכן ההקפאה והרקמות, כפי שהוא נתקל עם חנקן נוזלי) תוביל להקפאת חפצים שיכולים לפגוע בניתוח פתולוגי. כאוקטובר מספק מקור נוסף ללחות רקמות, מעבדות רבות משתמשות בדבקים אחרים כמו נכאת מסטיק כמצע הטבעה. גם במקרים בי ההקפאה מבוצעת כראוי, יש להקפיד להימנע מדגימות לאחר מכן הפשירו בטעות באמצעות מגע עם מכולות או מכשירי RT.לפיכך, תהליך הקפאה מוצלח דורש מידה מסוימת של תכנון, הכוללת מראש מצמרר של כל המכשירים ומכולות לשימוש. כאשר חפצי הקפאה הם נתקלו, יש שיטה שתוארה כאן לשחזור של הרקמה שהיא מספיק עבור רוב הערכות פתולוגי. עם זאת, מחזור ההקפאה / הפשרה זו אינו מציע היסטולוגיה המושלמת ויש לו הפוטנציאל לפגוע במחקרים מולקולריים או אנזימטי אחרים של הרקמות (בנוסף לזמן הנדרש כדי להקפיא מחדש הרקמות), ולכן משתמש בשיטות הקפאה ראשוניות מתאימות היא במידה רבה עדיפה . במקרים בהם חפץ הקפאה הוא נתקל ברקמה טרום קפוא, לעומת זאת, הטכניקה המתוארת במסמך זה יכול להיות מאוד שימושי.
קיבעון ועיבוד של רקמה לEM יכול להציע אתגרים טכניים ספציפיים שדורשים תכנון מוקדם לאוסף רקמות. השגיאה הנפוצה ביותר בעת איסוף דגימות לEM כרוכה בשימוש שבברי רקמות כי הם עבים מדי לglutaraldehydדואר לחדור. כglutaraldehyde חודר כ 0.1 סנטימטר בלבד לתוך רקמת שריר משטח, טיפול שניתן יש לנקוט כדי להבטיח שממד אחד של דגימות EM הוא לא עבה יותר 0.2 סנטימטר. בנוסף, כEM הוא אמצעי מצוין ישירות הערכת מנגנון ההתכווצות, כמה חוקרים פיתחו אסטרטגיות מראש מתח או טרום מתיחת השרירים לפני הקיבוע כדי לאפשר המדידה של אלמנטי התכווצות במתח רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. אין פרוטוקול סטנדרטי לטרום מתיחה, אך שתי אסטרטגיות מתוארות בקצרה בפרוטוקול זה. יצוין כי ניסיונות מראש tensioning השריר יכול להפיק תוצאות בלתי צפויות, אלא אם כן הם נעשים בצורה מאוד מסוימת, וזה עשוי להיות עדיף לתקן את השרירים במצב הרפוי כדי למנוע שינויי artifactual באורך sarcomere דרך לא סטנדרטי 8,9 הליך טרום מתיחה. לשרירים שבמדידות ספציפיות כגון אינן נחוצות (כוללים רוב בiopsies נעשה למטרות קליניות), מאמצים מראש מתח השרירים הם בדרך כלל לא נעשו, וההשפעה העיקרית על מורפולוגיה שרירים היא מרווח לא אחיד של sarcomeres בשריר.
נייר זה מייצג הראשון בסדרה לספק SOPs לביצוע בדיקות בתחום מחלת השריר המולדים, והיא מייצגת את המאמצים של מעל 20 מומחים בתחום מחלת השריר המולדים כי באופן שיגרתי לבצע סלולארי, מולקולרי, פונקציונלי, פיסיולוגי, ו מחקר פתולוגי. מגוון רחב של נהלי עבודה שפורסמו יהיה זמין בשנה הקרובה, והפרוטוקולים הנחוצים ופורמטי פרסום מתאימים לכל נדונו בשריר מולדת מחלות Consortium סדנה שנערך בחודש אפריל של 2013 בוושינגטון מטרת מאמץ SOP זה היא לספק מפת דרכים לבדיקת הצורך והניתוח של דגימות בתחום מחלת השריר המולדים ל1) סטנדרטיזציה של שיטות העבודה ונקודתי קצה בשימוש בתחום שלנו כמו מ 'uch ככל האפשר, ו2) לספק הדרכה על שיטות סטנדרטיות לחוקרים חדשים בתחום שלנו. אנו מאמינים כי משאבים אלה יאפשר את כניסתם של חוקרים חדשים בשדה תחת נלמד שלנו ובכך לשפר את היקף המחקר שניתן לבצע. בנוסף, סטנדרטיזציה של שיטות עבודה תהיה מאוד מועילה כדי להשוות נתונים בין מחקרים ולזהות נקודות קצה בעת תכנון וביצוע ניסויים פרה קליניים.
למרות ההתמקדות העיקרית של מאמר זה קשור להקפאה המתאימה וההכנה של רקמה למגוון רחב של מחקרים, הקבוצה המשותפת שלנו דנה גם בנקודתי הקצה השימושיים לניתוח הפתולוגי של דגימות שריר. נכון לעכשיו, אין הסכמה רשמית על הגישה שיש לנקוט כאשר ביצוע ניתוח פתולוגי, ומגוון רחב של מחקרים שונים שבוצע להתייחס ממצאים חדשים לפרסומים קודמים לכל מחלה, בהתאמה. לכן, חשב שזה יהיה שימושי כדימציע כמה הנחיות כלליות לתכנון של נקודות קצה פתולוגיים באפיון הפתולוגיה שריר. לפני כימות פתולוגיה במחקר, מחשבה רבה צריכה להיות הכניסה לתוך 1) השיטה של מדידת גודל סיבים, 2) את האפשרות של מומים סיבים מסוג ספציפי או השפעות טיפול, 3) את האפשרות של מומים או תופעות שמוגבלות לשרירים בודדים, ו4) אסטרטגיה לכימות ממצאים פתולוגיים אופייניים למחלה הנחקרת. גודל סיבים הוא נקודת סיום הכרחית עבור רוב המחקרים, ולמרבה הצער יש וריאציה רבה באיך זה הוא לכמת. מחקרים רבים מדווחים על תוצאות אלו בשיטות כימות אוטומטיות המסופקות על ידי תוכנת הדמיה קניינית, אך רבים מתוכניות אלה לקחת קיצורי דרך (כמו הנחה שהסיבים הם עיגולים או אליפסות) שיכול להפוך המדידות האוטומטיות הללו לא מדויקות. יש צורך להבין כיצד התוכניות האוטומטיות האלה עושות ב המדידות שלהםefore שיש אמון במדידות, ואנו ממליצים לחוקרים כוללים את פרטים אישיים בשיטות נייר. בנוסף, המדידה הספציפית המשמשת לציון גודל סיבים היא מאוד משתנה, וכמה מדידות עדיפות לאחרים 10,11. מדידה נפוצות של גודל סיבים היא אזור סיבי החתך (CSA), בעיקר משום שחוקרים בביצוע מחקרים פיסיולוגיים לתקנן את התוצאות שלהם למדידות CSA שהושגו תוך שימוש במכשירים שלהם. למרבה הצער, בזמן מדידות CSA יכולות לשקף במדויק גודל סיבים בסעיפים רוחביים מושלמים, הם בהרחבה תלויות בכיוון סיבים (עד כדי כך שסיבי אורך או באלכסון המחולק יהיו מדידות CSA גבוהות באופן מלאכותי) ומדידות ולכן לא אידיאליים לגודל סיבים. מדידה עדיפה בגודל סיבים שהיא פחות תלוי בשטח החתך של סיבים היא בקוטר של Feret המינימום (קוטר MinFeret), המהווה את המדידה של הקוטר מינור בתא השריר 12. מדידה זו היא תלויה אך ורק מעט בכיוון סיבים, והוא בדרך כלל זהב הסטנדרטי למדידת סיבים הקליני, וחוקרים מוזמנים להתקדם לקראת השימוש בטכניקה זו. מדידות אלה לעתים קרובות יכולים להתבצע באמצעות אותה התוכנה שיוצרת מדידות CSA 13, והם גם פשוטים למדידה באופן ידני. עם כל כבוד להערכת הנתונים הפתולוגיים בהתאם לסוג סיבים, שרירים ספציפיים, ובהקשר של ממצאים פתולוגיים הקשורים למחלה הספציפית, אלה נושאים פחות שנויים במחלוקת שצריך רק לקחת בחשבון בעת תכנון מחקר. סוג הסיבים ניתן להעריך באמצעות מכתים immunohistochemical או ATPase, אבל כדאי לקחת בחשבון שיש לי שרירים ספציפיים ומינים של בעלי חיים מסוימים תערובות של סוגים אלה סיבים (דבר שיחייבו את ציפיות שונות ובדיקת אסטרטגיות). מעורבות שרירים ספציפית פתולוגי או יעילות טיפוליכול להתרחש, ומשקל שרירים בסך הכל בהשוואה לקבוצת ביקורת יכול לשמש כדי לזהות את מידת ההטרוגניות של מחלה לפני שמחליט על השרירים כדי להעריך באופן פתולוגי. לבסוף, כידוע, מחלות שריר רבות הקשורים לליקויים ספציפיים פתולוגי (כגון מוטות nemaline במיופתיה nemaline) 14,15, ואז זה שימושי גם כדי לשקול אם ליקויים אלה נמצאים בסיב שריר מסוג או ספציפי להפצה בעת ביצוע הניתוח 16,17. בסך הכל, בזמן שאנחנו לא מציעים סט נוקשה של סטנדרטים להערכת שריר, אנו מאמינים כי נושאים אלה צריכים להיחשב לפני ביצוע מחקרים פתולוגיים בכל מחלה שרירי שלד.
גילויים
יש המחברים אין לחשוף.
תודות
פרסום זה ממומן באמצעות Cure CMD, מענק של Association Contre Les Myopathies (פרויקט 16297), והמכונים הלאומיים לבריאות (מספרי מענק K08 AR059750 ו-L40 AR057721). ברצוננו גם להודות לד"ר ג'ולי טצלאף על עזרתה בתיקון כתב היד הזה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| להקפאת | |||
| דיואר חנקן נוזלי עם מכשיר משיכת נוזלים | מותאם אישית מערכות ביוגניות | מעבדה -5 | סדרה כל דיואר חנקן נוזלי אחר יכול להחליף. |
| מיכל מוליך קר | פישר | 02-583A | |
| מיכל מבודד רחב המסוגל להכיל חנקן נוזלי | Nalgene | 4150-2000 | |
| Oakton Temp 10 מדחום צמד תרמי | תומס סיינטיפיק | 1228Y01 | אופציונלי, אך יכול להיות שימושי מאוד בזיהוי הנקודה שבה איזופנטן קופא. |
| פונקציונלית של סיבים בודדים | |||
| צלחת פטרי | פישר סיינטיפיק | 08-757-11 | |
| ציפוי סילגארד | דבקי אלסוורת' | 3-6636 | |
| סטריאומיקרוסקופ דיסקציה | מכשיר הרווארד | 693101 | כל מיקרוסקופ דיסקציה אחר יכול להחליף. |
| לתרבית | |||
| מכסה מנוע זרימה למינרי סטרילי | Thermo Scientific | 51022485 | כל מכסה מנוע אחר לתרבית תאים יכול להחליף. |
| להקפאת | |||
| שקיות/מיכלים ניילון | Nasco | B01009WA | |
| כפפות בטיחות תרמיות | Denville | G4162 | |
| מגן פנים | Fisher Scientific | S47640 | |
| מלקחיים ארוכים | Fisher Scientific | 12-460-807 | |
| סיכות סמן | 125328 | ||
| לתרבית | |||
| צינורות חרוטיים סטריליים 50 מ"ל | Denville | C1060-P | |
| PES, 500 מ"ל, 0.22 ומיקרו; m | דנוויל | F5227 | |
| מלקחיים סטריליים | פישר סיינטיפיק | 644320 | |
| חבילות קרח | פישר סיינטיפיק | NC9909223 | |
| קופסת קלקר מבודדת | Polar Tech | 207F | |
| סרט אריזה | סיכות | 795570 | |
| הקפאת | |||
| חנקן | נוזליאיירגז | NI NF160LT350 | אחסן חנקן נוזלי במיכלים המיועדים לנוזלים בטמפרטורה נמוכה |
| איזופנטן (2-מתילבוטאן) | סיגמא | M32631-4L | אחסן איזופנטן בארון חומרים דליקים. |
| מקבע EM (בחר אחד) | המאגרים ללא מקבע צריכים להיות זמינים גם כן, מכיוון שיש להעביר רקמות קבועות EM מקיבוע למאגר לאחר מספר שעות או ימים אם הן לא מעובדות באופן מיידי עבור EM. | ||
| 2.5% גלוטראלדהיד במאגר קקודילאט 0.1M | מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים | 16537-15 | |
| הקיבוע של קרנובסקי (3% גלוטראלדהיד + 2% פרפורמלדהיד במאגר פוספט 0.1M)מדעי | מיקרוסקופיה אלקטרונית | 15732-10 | |
| למחקרים פונקציונליים (אם רוצים) | |||
| תמיסה מרגיעה, המכילה (ב-mmol/L) | |||
| 40 BES | סיגמא | B9879 | |
| 10 EGTA | Sigma | E4378 | |
| 6.56 MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| 5.88 אינץ' ATP | A3377 | ||
| 1.0 DTT | RPI | D11000 | |
| 46.35 K-propionate | הכינו תמיסה על ידי ערבוב חומצה פרופריונית (Sigma P1386) ו-KOH (Fisher P250) 1:1 | ||
| 15 קריאטין פוספט, pH 7.0 | Sigma | P7936 | |
| 0.4 לופפטין | Calbiochem | 10895 | |
| 0.1 PMSF | Sigma | P7676 | |
| תמיסת עור, מכיל | |||
| פתרון מרגיע (ראה לעיל) | |||
| 0.5% טריטון X-100 | סיגמא | T8787 | |
| מציין גרגירי | |||
| חתיכות שטוחות של פקק (1 x 1 אינץ') | מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים | 63305 | |
| גליצרול | סיגמא | G2025 | |
| לתרבית תאים (אם רוצים) | |||
| מדיום גידול שלם, המכיל (עבור 500 מ"ל) | עיקור על ידי סינון התמיסה דרך 500 מ"ל 0.22 µ יחידת סינון PES מ ' יש לאחסן בטמפרטורה של 4&00 מעלות; C ולהשתמש תוך חודש אחד. | ||
| 395 מ"ל של Dulbecco עם גלוקוז גבוה s Modified Eagle' s בינוני (DMEM) | Sigma | D5671 | |
| 100 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS) | Sigma | F6178 | |
| 5 מ"ל של 100X פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין (PSG) | Sigma | G1146 | |
| עיין בגיליון נתוני בטיחות החומרים (MSDS) עבור כל הריאגנטים האחרים למפרטי |
מקורות
- Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. 15, Elsevier. 407-442 (2007).
- Lawlor, M. W., et al. Enzyme replacement therapy rescues weakness and improves muscle pathology in mice with X-linked myotubular myopathy. Hum Mol Genet. 22, 1525-1538 (2013).
- Talmadge, R. J., Roy, R. R. Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms. J Appl Physiol. 75, 2337-2340 (1993).
- Blau, H. M., et al. Differentiation properties of pure populations of human dystrophic muscle cells. Exp Cell Res. 144, 495-503 (1983).
- Lawlor, M. W., et al. Myotubularin-deficient myoblasts display increased apoptosis, delayed proliferation, and poor cell engraftment. Am J Pathol. 181, 961-968 (2012).
- Pavlath, G. K., Gussoni, E. Human myoblasts and muscle-derived SP cells. Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).
- Webster, C., Blau, H. M. Accelerated age-related decline in replicative life-span of Duchenne muscular dystrophy myoblasts: implications for cell and gene therapy. Somat Cell Mol Genet. 16, 557-565 (1990).
- Ottenheijm, C. A., et al. Thin filament length dysregulation contributes to muscle weakness in nemaline myopathy patients with nebulin deficiency. Hum Mol Genet. 18, 2359-2369 (2009).
- Witt, C. C., et al. Nebulin regulates thin filament length, contractility, and Z-disk structure in vivo. EMBO J. 25, 3843-3855 (2006).
- Garton, F., et al. Validation of an automated computational method for skeletal muscle fibre morphometry analysis. Neuromuscul Disord. 20, 540-547 (2010).
- Kim, Y. J., et al. Fully automated segmentation and morphometrical analysis of muscle fiber images. Cytometry A. 71, 8-15 (2007).
- Lawlor, M. W., et al. Inhibition of activin receptor type IIb increases strength and lifespan in myotubularin-deficient mice. Am J Pathol. 178, 784-793 (2011).
- Mula, J., et al. Automated image analysis of skeletal muscle fiber cross-sectional area. J Appl Physiol. 114, 148-155 (2013).
- Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. , Elsevier. 407-442 (2007).
- Nance, J. R., et al. Congenital myopathies: an update. Curr Neurol Neurosci Rep. 12, 165-174 (2012).
- Clarke, N. F., et al. Mutations in TPM3 are a common cause of congenital fiber type disproportion. Ann Neurol. 63, 329-337 (2008).
- Lawlor, M. W., et al. Mutations of tropomyosin 3 (TPM3) are common and associated with type 1 myofiber hypotrophy in congenital fiber type disproportion. Hum Mutat. 31, 176-183 (2010).
הדפסות חוזרות והרשאות
