细胞质DNA感应通路的激活 体外 和 体内

摘要

本实验方案的目的是采用最佳方法激活细胞内的胞质DNA感应通路 体内通过改进平末端连接过程中长片段双链DNA的生成来实现。随后使用脂质转染试剂对细胞或小鼠进行转染。

摘要

为了有效激活先天免疫反应，DNA必须具备足够的长度和纯度。本文介绍一种廉价且简便的方法，可制备出具有激活胞质DNA感应通路所需特性的双链DNA（dsDNA）。通过连接不含CpG基序的短链合成寡核苷酸，可形成足够长度的dsDNA串联体（concatemer），从而激活细胞质DNA感应通路。该方案利用聚乙二醇（PEG）环境下的平末端连接技术，促进寡核苷酸高效连接。经苯酚/氯仿抽提纯化后，所得dsDNA串联体可用于模拟先天免疫反应 关键词：双链DNA，寡核苷酸，串联化，胞质DNA感应通路，先天免疫反应，平末端连接，聚乙二醇，苯酚/氯仿抽提 体外 通过标准转染方案。该DNA也可用于刺激先天免疫 体内 例如通过皮内注射至小鼠耳廓。通过标准化串联重复过程及后续刺激方案，可稳定且可重复地激活先天免疫系统。

引言

DNA 是所有生物体和细胞的重要组成部分，真核生物将其保存在特定的区室内。先天免疫系统的一个功能是识别这些区室化结构的破坏，或识别因物理性外部屏障受损而进入机体的外来物质。via 人体内存在多种蛋白质，可帮助降解可能逸出正常区室化位置的少量 DNA；其中 DNAse I、II 和 III 分别在血浆、内体和细胞质中降解 DNA。然而，研究显示缺乏 DNAse II 的小鼠会因干扰素过度产生而导致严重贫血而死亡¹，这表明先天免疫系统会对细胞核外 DNA 产生反应。即使在完全缺乏 Toll 样受体信号传导能力的小鼠中，该反应依然存在。目前大量研究表明，干扰素基因刺激因子（STING）² 和 TANK 结合激酶 1（TBK1）³ 参与了细胞质中 DNA 的识别，且该信号通路可激活干扰素调节因子（IRF）-3⁴。随后由 IRF3 介导的细胞因子、趋化因子和干扰素基因的转录，是先天免疫系统对病原体相关分子模式或危险相关分子模式（PAMP 或 DAMP）产生反应的典型特征⁵。

研究细胞内核酸感应通路的需求促使人们必须建立稳健且可重复的方法，以将DNA或RNA导入细胞进行刺激，同时避免激活其他先天免疫反应。其中一种激活STING/TBK1/IRF3通路的方法是利用阳离子脂质转染试剂将核酸递送至细胞质，使其可被DNA-PK、IFI16和cGAS等DNA感受器识别

方案

1. 连接成串联体

1. 将引物Fw和Rv（引物序列见材料表）用分子生物学级H₂O重悬至浓度为10 µg/µl。然后取5 µl Fw引物和5 µl Rv引物，加入1.5 ml微量离心管中混合。
2. 将引物混合物加热至适当的退火温度（本实验所用引物为75 °C）并保持15分钟进行退火处理，随后置于室温（RT）下自然冷却。在退火孵育期间，用ddH₂O配制60% PEG8000溶液。
3. 向引物混合物中加入50 µl 60% PEG8000（使终浓度为30%）、10 µl 10x 多核苷酸激酶（PNK）缓冲液、27 µl H₂O和3 µl PNK。在37 °C孵育2小时。
4. 孵育结束后于室温冷却，加入11 µl DNA连接酶缓冲液，随后加入3 U DNA连接酶，并在37 °C过夜孵育。

2. DNA 纯化与分析

1. 加入 300 µl 的 H₂O 以增加连接反应体系的体积。注意：由于苯酚:氯仿蒸气具有毒性，操作应在通风橱中进行。
2. 加入等体积（400 µl）苯酚:氯仿，剧烈振荡混匀。
3. 在台式微量离心机中以最大速度离心1分钟。水相与有机相将分层，水相位于上层，两相之间为白色沉淀的蛋白质层。
4. 用移液器小心吸取上层液体，转移至新离心管....

结果

以下结果表明，串联多聚DNA可相对容易地制备，并能够有效激活细胞和小鼠中的天然免疫反应。通过使用PEG8000，可明显观察到所生成DNA的长度显著增加，且同样能够诱导Cxcl10的转录。琼脂糖凝胶分析显示，标准串联多聚反应产生的DNA长度可达约800个碱基对（bp），而添加PEG8000的样本中，DNA长度包含超过10,000 bp的片段（图1A）。将这些DNA转染入小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）或小鼠体内，均可强烈诱导细胞因子和趋化因子的转录，通过qPCR可检测到该反应，表明天然免疫DNA感应机制被有效激活（图1B和图1C）。

讨论

本文所述方案用于生成双链DNA，以在多种细胞类型中可重复地激活胞质先天免疫反应。 体内由于该系统使用的主要底物试剂是合成寡核苷酸，因此具有灵活性，可采用不同的DNA序列或化学修饰。例如，可将本方案中所述的正向链寡核苷酸替换为带有荧光标记或生物素基团的寡核苷酸，以追踪定位或评估其与其他生物大分子的相互作用。

DNA串联化的主要优势之一是能够以可控序列的方式产生长链双链DNA。但该方法存在一个局限性，即DNA长度无法精确监控，因此该反应的产物始终是不同长度DNA的混合物（类似于商用RNA类似物poly(I:C)）。该技术的另一个优势在于能够大量生产具有免疫刺激活性的DNA（产量可达毫克级别）。串联化步骤可根据需要轻松放大，但需注意后续纯化步骤应按照本方案中所述规模分装进行。

与其他DNA串联方法相比，主要增加的步骤是在连接反应体系中加入PEG8000以提高连接效率。需要注意的是，PEG8000可能较难溶解以配制60%（w/v）的储存液，但可通过涡旋振荡并轻微加热以助溶解。连接反应的孵育时间可长于推荐时长，但这似乎.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
正向引物	Integrated DNA Technologies	n/a	TACAGATCTACTAGTGATCTATGA CTGATCTGTACATGATCTACA
反向引物	Integrated DNA Technologies	n/a	TGTAGATCATGTACAGATCAGT CATAGATCACTAGTAGATCTGTA
PEG8000	Sigma-Aldrich	P-4463
分子生物学级水	Sigma-Aldrich	W4502-1L
T4 多核苷酸激酶	Promega	M4101
T4 DNA 连接酶	Promega	M1801
苯酚:氯仿	Fisher Chemical	BPE1752p-400
氯仿	Fisher Chemical	C/4960/PB08
乙醇	Sigma-Aldrich	32221-2.5L
DNA 凝胶上样缓冲液	New England Biolabs	B7021S
琼脂糖	Bioline	BIO-41025
Optimem	Life Technologies	11058021
TransIT-LT1	Mirus Bioscience	MIR 2300
Hamilton 注射器	Hamilton	80901 Model 1705
30 G 针头	BD Bioscience	304000
SYBR Safe DNA 凝胶染料	Life Technologies	S33102
RNeasy Plus Mini 试剂盒	Qiagen	74134
寡聚(dT)引物	Thermo Scientific	SO131
dNTP 混合物	Fermentas	R0192
Super Script III 逆转录酶	Life Technologies	56575
第一链 cDNA 合成缓冲液	Life Technologies	y02321
SybrGreen qPCR Fast 主混合液	Applied Biosystems	4385612
cxcl10 小鼠正向引物	Integrated DNA Technologies	n/a	ACTGCATCCATATCGATGAC
cxcl10 小鼠反向引物	Integrated DNA Technologies	n/a	TTCATCGTGGCAATGATCTC
il6 小鼠正向引物	Integrated DNA Technologies	n/a	GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC
il6 小鼠正向引物	Integrated DNA Technologies	n/a	GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC