Introduction
Der menschliche Stimmlippen, einer epithelialen Schicht, die Lamina propria (LP) und der M. vocalis, ist eine spezialisierte Weichgewebe die den Luftstrom aus der Lunge in akustische Wellen für die Klangerzeugung umwandelt. 1 Stimmlippen schwingen regelmäßig während der normalen Stimmbildung, bei Grundfrequenzen im Bereich aufweisen Stämme von bis zu 30% 100-300 Hz. 2 Erwachsene Stimmlippen LP ist eine Gradienten-Struktur einer oberflächlichen (SLP) zusammengesetzt ist, ein Zwischenprodukt (ILP) und eine Tiefe (DLP)-Schicht. Weitere Klassifikationsgruppen das Epithel und die SLP als Schleimhaut-Schicht und verbindet die ILP-und DLP in die Stimmbandes. 3 Die SLP Schicht enthält in erster Linie eine amorphe Matrix mit spärlich verteilt kollagenen Fasern, während das Band mit reifen Kollagen und Elastin-Fasern angereichert um eine ausreichende Festigkeit verfügen. 4. Die Struktur und Mechanik des Neugeborenen Stimmlippen deutlich von ihrer reifen Kollegen. Obwohl Mechanismuss Regelstimmlippen Entwicklung und Reifung sind noch nicht vollständig verstanden, experimentelle Beweise für die Definition von Rollen der Vokalisation abgeleitete mechanische Belastung hingewiesen.
Mehrere medizinische Bedingungen, einschließlich Sprachmissbrauch, Infektionen, chemische Reizstoffe und chirurgische Verfahren, können die Stimmlippe beschädigen. Stimmlippe Störungen betreffen schätzungsweise 3-9% der US-Bevölkerung. Aktuelle Behandlungsmethoden für Erkrankungen der Stimmlippen sind begrenzt, 5 und eine Stammzellen-basierten Tissue-Engineering-Ansatz hat sich als vielversprechende Strategie zur Wiederherstellung der Stimmlippenfunktion entstanden. Mesenchymalen Stammzellen (MSC) sind eine geeignete Alternative zu den primären Stimmlippen Stimmlippen Fibroblasten für Tissue Engineering. 6-9 Stammzell Schicksal Spezifikation und anschließender Gewebeentwicklung werden durch die spezifische Nische sie wohnen, von denen der mechanische Zustand vermittelt ein entscheidender Faktor. 10. Mechanische Kräfte sind wesentliche Regulatoren der Morphogenese einnd Homöostase, vor allem für Gewebe, die routinemäßig von der Last. ausgesetzt sind 11 Aus einer Perspektive Tissue Engineering hat es sich gezeigt, dass die Exposition gegenüber physiologisch relevanten mechanischen Reize fördert die Stammzelldifferenzierung und gewebespezifischen Matrixumbau. 12-15
Gewebekulturbioreaktoren sind entworfen, um die gewünschte physiologische Umgebung für Zell-oder Gewebewachstum in vitro zu simulieren. Für Stimmlippen Tissue Engineering, ist es besonders wichtig, die mechanische Umgebung der phonating Stimmlippen neu zu erstellen. Eine ideale Stimmlippen Bioreaktor sollte Vibrations effektiv zu liefern Hinweise zur Kultivierung von Zellen, so dass eine leichte Kontrolle über die Frequenz, Amplitude und Dauer der Erschütterungen. Titze und Mitarbeiter entwickelten eine Stimmlippen Bioreaktor (T1 Bioreaktor) 16, die statische Strecke mit hoher Frequenz (20-200 Hz) Schwingungen, die zelluläre Produktion von Matrixproteinen stimulieren kombiniert. Das Arbeg dieser Bioreaktor, Webb und Kollegen 17 suchten die Auswirkungen der 10-Tage, 100-Hz-Schwingungen auf den dermalen Fibroblasten in einer Hyaluronsäure (HA)-basierte Hydrogel kultiviert. Konstrukte Vibrationen ausgesetzt zeigten eine erhöhte Expression von HA-Synthase-2 (HAS2), Decorin, Fibromodulin und Matrix-Metalloproteinase-1 (MMP1), bezogen auf die statische Kontrollen. Die stimulierende Wirkung wurde festgestellt, zeitabhängig sein. Vor kurzem, unsere Gruppe 18 stellte ein Stimmlippen Bioreaktor (J1 Bioreaktor) mit einem Leistungsverstärker, einen Funktionsgenerator, einen geschlossenen Lautsprecher und eine Umfangs verankert Silikonmembran, die die schwingende Luft auf die beigefügten Zellen überträgt. Neonatale Vorhautfibroblasten in der J1-Bioreaktor kultiviert wurden 1 h Vibration bei 60, 110 oder 300 Hz unterzogen wird, mit einer Dehnung in der Ebene von bis zu 0,05%. Die qPCR Ergebnisse zeigten, dass die Expression einiger Gene ECM mäßig in Abhängigkeit von der unterschiedlichen Schwingungsfrequenzen verändertund Amplituden.
Diese Bioreaktor entwickelt, während faszinierend, haben mehrere Einschränkungen. Zum Beispiel erfordert die T1-System eine große Anzahl von Verbindungsstangen und für mechanische Kopplung, die Begrenzung der Maximalfrequenzen erreichbar. Darüber hinaus können Zellen, um unerwünschte mechanische Bewegung und Flüssigkeits Störung, die die Datenauswertung erschweren unterworfen werden. Die J1-Bioreaktor, auf der anderen Seite, zeigt relativ geringe Wirkungsgrad der Energieumwandlung und ist nicht benutzerfreundlich. Darüber hinaus löst Vibrationen häufig die Zellbeladenen Konstrukte aus der zugrunde liegenden Silikonmembran. Der J2 Stimmlippen Bioreaktor hier berichtet, basierend auf dem gleichen Prinzip wie die J1-Version entworfen, wird die Konsistenz und Reproduzierbarkeit optimiert. Die Stimmbildung ähnlicher Vibrationen sind aerodynamisch in individuell angepassten Vibrationskammern, in denen MSC besiedelten Faser Poly (ε-Caprolacton) (PCL) Gerüste sind effektiver erzeugtEly gesichert. Laservibrometrie (LDV) ermöglicht dem Benutzer, den Vibrationsprofils der Membran / Gerüstanordnung zu überprüfen. In unserer Demonstration werden MSCs 200-Hz-Sinusschwingungen mit einer 1-Stunden-on-1-h-aus (OF) Muster für insgesamt 12 Stunden täglich für 7 Tage ausgesetzt. Zelluläre Antworten auf die verhängte Vibrations Hinweise werden systematisch untersucht. Insgesamt bietet die J2 Stimmlippen die benutzerfreundlichen Funktionen, so dass dynamische Zellkulturstudien, in einem hohen Durchsatz und reproduzierbar durchgeführt werden.
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Protocol
1. Bioreaktor Versammlung (Video 1)
- Machen Sie eine Aluminiumform (kreisförmige Düse + Abstandsstift) mit vorgegebenen Innen-und Außenmaße (Abbildung 1).
- Mit der Form aus Schritt 1.1, fabrizieren eine Silikonmembran (Durchmesser: 42 mm, Dicke: 1,5 mm, Abbildung 1) mit einem verschanzten Hülse (Durchmesser: 12 mm, Dicke ~ 0,25 mm, von der Abstandsstift in Abbildung 1 förmig) in die mittlere mit einem handelsüblichen Silikon-Elastomer-Kit.
- Machen Sie ein Paar Acrylblöcke (Abbildung 2 (4, 5)) mit einer kreisförmigen Öffnung (Durchmesser: 24 mm) in der Mitte, gravieren die Spitze (1,8 cm dick) und unten (0,9 cm dick) Blöcke mit passenden Rippen und Rillen . 10.
- Sandwich die Silikonmembran zwischen den gepaarten Acrylblöcke. Sichern Sie die Montage mit vier Schrauben Ecke mit einer Micro-Drehmomentschrauber einer konstanten Kraft (35 cN · m) eingestellt. Als Ergebnis wird eine wasserdichte, 24 mm breit und 18 mm tief Vibrationskammer erzeugt wird (Fig. 2C).
- Montieren Sie einen 3 "erweiterten Bereich Mini-Woofer (2D, 8 Ω/20 W) unter der Vibrationskammer durch einen anderen Satz von Ecke Schrauben auf der Unterseite Acrylblock. An diesem Punkt wird eine einzelne Vibrationsmodul montiert.
- Replizieren sieben zusätzliche Schwingungsmodule. Anbringen vier davon mit einem von zwei feststehenden Aluminiumstangen (40 cm x 10 cm x 2,5 cm), indem die Lautsprecher Basen in gleichmäßig beabstandeten kreisförmigen Öffnungen (Durchmesser: 7 cm, Dicke: 2 cm) in die Stäbe zu schneiden. Stabilisieren Sie jeden Lautsprecher durch Einsetzen einer Schraube durch die Seite der Aluminiumstange in jeder kreisförmigen Loch.
- Individuell steuern die Lautsprecher durch einen Lautsprecher Selector. Verbinden einzelnen Lautsprecher an den Selektor durch Anbringen Drähte an die positiven und negativen Eingänge des Lautsprechers Körper dann an die entsprechenden Ausgänge des Wählers. Das Lautsprecherwähler ermöglicht das Signal von ter Funktionsgenerator, nachdem es durch einen Leistungsverstärker, um alle acht Lautsprecher auf einmal (2E) zu erreichen.
- Platzieren Sie die beiden Kammeranordnungen, die Lautsprecherauswahl und die zugehörige Elektronik in einem Gehäuse zum Schutz gegen Feuchtigkeit. Haus die gesamte Baugruppe in einem kommerziellen Zellkulturbrutschrank.
- Führen Sie die Hauptkabel (durch eine medizinische Qualität PVC-Schlauch), die den Leistungsverstärker und Lautsprecherwähler durch die Filteranordnung auf der Rückseite des Inkubators.
2. Gerüst Herstellung und Charakterisierung
- Auflösen PCL-Pellets in Chloroform bei einer Konzentration von 15 Gew.%. Laden Sie die Lösung in eine 10 ml Spritze mit einer 21 G Nadel stumpfen Enden gekappt.
- Sperren Sie die Spritze auf einem programmierbaren Spritzenpumpe und stellen Sie die Durchflussmenge bei 1 ml / Std.
- Platzieren der Aluminiumfolie bedeckten Kollektor gegenüber der Nadel horizontal, mit einer Nadelspitze-zu-Kollektor-Strecke von ca. 18 cm.
- Klemmen Sie die positive alliAlligator-Clip in der Mitte der Nadel und dem Boden Krokodilklemme an die Aluminiumkollektor, dann die Spannung auf der Hochspannungsversorgung mit 15 kV. ACHTUNG: Hochspannung, halten Sie Abstand von der Nadel.
- Nacheinander auf dem Spritzenpumpe und Stromversorgung drehen; schnell reinigen / entfernen Sie die Restpolymerlösung rund um die Spitze der Nadel mit einem trockenen Papiertuch vor stabile Faserdüsen und Taylor-Konus 19 gebildet werden.
- Die Fasern auf der Sammel Al in einer Dicke von ca. 250-300 &mgr; m akkumulieren (~ 7 Stunden unter den derzeitigen Spinnbedingungen). Speichern Sie die resultierende Gerüste im Vakuumtrockenschrank für 1-2 Tage, um restliche Lösungsmittel zu entfernen.
- Bild die Gerüste, mit Gold beschichtet Sputtern mit einem Raster-Elektronen-Mikroskop, um konsistente Fasermorphologie zeigen. 10.
3. Bioreaktor Assemblierung und Charakterisierung
- Lochen Sie ein zylindrische Scheibe (Durchmesser: 8 mm) mit vier Armen (Länge: 2mm) aus der wie gesponnenen PCL Matte (2A), indem zuerst mit einem Durchmesser von 12 mm Stanzbiopsie, um den äußeren Durchmesser der Platte geschnitten. Dann mit einem zweiten, 8 mm Stanzbiopsie zu vier 2 mm langen Kerben gleichmäßig um den Kreismesser Abstand zu punkten, wo die Arme zu schneiden sind zu machen. Nach der Wertung mit der 8 mm-Stanz, verwenden Sie ein Skalpell, um die Kanten der Arme nach außen abgeschnitten. Einfügen des Gerüsts in die Nut der Silikonmembran über den verlängerten Armen (Video 1). Glätten Sie das Gerüst eingefügt durch sanftes Drücken Sie die Oberfläche mit Flachkopf-Pinzette.
- Bringen Sie ein kleines Stück von dünnen Al-Folie (8 mm x 2 mm, senkrecht Form, 2B) mit dem PCL-Gerüst Laserreflexion unterstützen.
- Befestigen Sie den zusammengebauten Silikonmembran / PCL Gerüst (wie in Schritt 1.4 beschrieben) in der Vibrationskammer. 1,5 ml Wasser in der Kammer, um die PCL-Gerüst vor Vibrationen Hydrat.
- Mit dem Funktionsgenerator, einzuführen Vibrations ZeichenALS (z. B. 200 Hz-Sinuswellen mit einer Spitze-zu-Spitze-Spannung Vpp von 0,1 V) an die sandwichartig Acrylkammer. Mit einem Voltmeter die Spannung exakt messen an jedem Lautsprechereingang. Hinweis: die Vpp Auslesen aus dem Funktionsgenerator von der eventuellen Spannungs an den Lautsprecher geliefert abweichen.
- Montieren Sie den Ein-Punkt-LDV und sichern die Laserlichtsensorkopf auf eine Schwenk-Neige-Kopf Stativ. Angle den Sensorkopf, so dass sie senkrecht auf der Tischplatte zeigt. Schließen Sie das LDV Sensorkopf mit dem Datenerfassungsmodul über Koaxialkabel dann das Modul an den Laptop über USB.
- Fokussierung des Laserstrahls senkrecht an verschiedenen vorbestimmten Stellen auf der Silikon-Membran (Fig. 2B und Fig. 3).
- Mit der Software zur Datenerfassung, notieren Sie die Mitte Membranverschiebung. Klicken Sie auf "Übernahme-Einstellungen" aus dem Menü "Optionen"; ändern Sie dann den Messmodus auf "FFT221;. Als nächstes klicken Sie auf die "Dauermessung" in der Hauptsymbolleiste klicken Sie dann auf die Spitze, die bei der gewählten Frequenz (6D) bildet, um eine Verschiebung zu erfassen.
- Zur Erstellung der normalen Halbmembranverschiebung (w 0) als Funktion der relativen Position gegenüber dem Substrat. Erstellen Sie ein 3D-Farbtabelle der Oberfläche Vibrations Profil mit Origin 8.5 Datenanalyse-Software.
4. Vibrationszellkultur
- Sub-Kultur menschlichen Knochenmark abgeleiteten MSCs in T150 Zellkulturflaschen mit einer Anfangsaussaatdichte von 4000-5000 Zellen / cm 2 in MSC Wartung Medien.
- Nach 7-8 Tagen Zellkultur (um ~ 85% Konfluenz), trypsinize die Zellen mit einer Zellspalt Reagens wie Accutase zählen mit einer Zählkammer, Zentrifuge (440 × g für 5 min) und Resuspension der Zellpellets in Frisch MSC Erhaltungsmedium bei einer Konzentration von 4,5 x 10 6 Zellen / ml.
- Tauchen Sie den PCL scaffold in 70% Ethanol O / N. Nachdem das Lösungsmittel verdampft ist, setzen beide Seiten des Gerüsts mit UV-Licht (254 nm) für 5-8 min keimtötende.
- Einweichen des PCL-Gerüst in einem 20 ug / ml Fibronektin-Lösung bei 37 ° C für 1 Stunde. Legen Sie die Fibronektin-beschichtete Gerüst in die Silikonmembran. Montieren Sie den Bioreaktor wie in Schritt 1 beschrieben.
- Verteilen 40 ul der Zellsuspension gleichmäßig auf die gesicherte PCL Gerüst. Lassen Sie die Zellen für 1 bis 1,5 Stunden, bevor Sie weitere 1,5 ml frisches Medium mit der Vibrationskammer zu befestigen.
- Kultur der MSC-beladenen PCL Gerüst statisch für 3 Tage und aktualisieren Sie die Medien nach Abschluss der statischen Kultur.
- Impose ausgewählten Vibrations Regime auf die Zellkonstrukte. Anmerkung: Als Beispiel werden die Zellen in einen 1-Stunden-on-1-h-aus (OF) Schwingung bei 200 Hz mit einem w von 0 ~ 40 &mgr; m für 12 Stunden pro Tag für bis zu 7 Tage unterzogen. Konstrukte, um Schwingungsanregungen unterzogen werden, wie Vib Proben und diesen kul bezeichnetrot statisch in identischen Schwingungs Kammern dienen als statische Kontrollen (Stat).
5. Biologische Bewertung
- Sammeln Sie 200 ul Zellkulturmedien aus jeder Kammer jeden zweiten Tag (Tag 1, 3, 5 und 7) und bündeln die Portionen aus der gleichen Probe zusammen (jeweils 800 ul).
- Quantifizierung der zellulären Produktion von Matrix-Metalloproteinase-1 (MMP1) und HA mit einem MMP1 ELISA-Entwicklung-Kit und eine Hyaluronsäure kompetitiven ELISA-Kit, jeweils folgende Verfahren der Hersteller. Unterdessen untersuchen die Produktion von löslichem Elastin-Vorläufer nach dem zuvor berichtet ELISA-Verfahren. 8
- Nach Abschluss der letzten Schwingungszyklus am Tag 7, schnell zu entfernen, die zellulären Konstrukte aus den Schwingungs Kammern mit scharfen Pinzette und spülen Sie sie kurz mit kaltem Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS, 4 ° C).
- Für die Live / Dead-Färbung, brüten die Konstrukte mit Propidiumiodid (1:2000 in PBS) undSyto-13 (1:1000 in PBS) gleichzeitig für 5 min bei RT. Bild die gefärbten Konstrukte mit einem Multiphotonen-konfokalen Mikroskop.
- Getrennt Snap-Einfrieren der PBS-gespült Zellkonstrukte auf Trockeneis und extrahieren Sie die gesamte zelluläre RNA nach einer zuvor berichtet Protokoll für die Gen-Analyse. 9
- Überprüfen Sie, ob die Quantität und Qualität der extrahierten RNA mit Hilfe eines UV-Vis-Spektrophotometer. RNA-Proben mit A260/A280 und A260/A230 Verhältnisse von 1,8 bis 2,2 sind für die anschließende qPCR-Analyse verwendet.
- Reverse Transkription der RNA (500 ng / Probe) in cDNA mit einem kommerziell erhältlichen Kit der reversen Transkription.
- Führen Sie die PCR-Reaktion auf einer Echtzeit-Sequenz-Detektionssystem mit einem handelsüblichen PCR Master Mix nach der vorher beschrieben Verfahren. 8
- Analysieren Sie die qPCR Ergebnisse mit kommerziellen qPCR Datenanalyse-Software. Um die Zuverlässigkeit der Datenanalyse zu gewährleisten, werden mehrere Referenzgene (YWHAZ, TBP, PPIA) als int verwendetern Kontrollen und die Varianz der spezifischen Primer Effizienz berücksichtigt wird. 8
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Representative Results
Die PCL-Scaffolds durch Elektrospinning hergestellt enthalten mikrometergroßen Poren und Zwischen zufällig verstrickt Fasern mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 4,7 um (Abbildung 4A). Bei einer höheren Vergrößerung, nanoskalige Rillen und Poren auf einzelnen Fasern (4B) sichtbar. Die Beschichtung der Gerüste mit Fibronektin verbessert Hydrophilie und erleichtert die anfängliche Zelladhäsion / Verteilung auf der PCL-Gerüst (unveröffentlichte Beobachtung).
Sinuswellenformen mit einer gewünschten Frequenz (f, 100-300 Hz) und Spannung (Vpp: 0-0,125 V) an den Lautsprecher unterhalb jeder Vibrationskammer, und die Luft zwischen der Unterseite der Silikonmembran und der Papierkonus einer geschlossenen eingeführt Mini-Woofer wird in Schwingung versetzt. Die Luftschwingung ist mit der PCL-Gerüst mit oder ohne Zellen geliefert. LDV wird verwendet, um das Schwingungsverhalten des Gerüsts bei einer gegebenen f und Vpp zu analysieren,unter Berücksichtigung des Brechungsindex von Wasser (1,33). 20 Fig. 5 zeigt die normale Verschiebung (W 0) in der Mitte des PCL-Gerüst als Funktion der Vpp und f. Die Vibrationsfrequenzen sind so gewählt, grundlegenden menschlichen Sprechfrequenzen reflektieren. 21. Es besteht eine lineare Beziehung zwischen w 0 und Vpp im Bereich von 0 bis 0,125 V für alle getesteten Frequenzen. Bei einer gegebenen Vpp, w 0 abnimmt, steigt f von 100 bis 300 Hz liegt.
Eine spezifische Schwingungszustand (f = 200 Hz, Vpp = 0,1 V) wird für die weitere Analyse ausgewählt. Das Geschwindigkeitsprofil als Funktion der Zeit (Fig. 6A) zeigt, daß die an den Lautsprecher eingeführt Sinussignal durch die PCL-Gerüst mit hoher Genauigkeit erfasst werden. Das Zentrum des PCL Gerüst schwingt in Längsrichtung mit einer Spitzengeschwindigkeit von 52 mm / sec, eine maximale Beschleunigung von 66 m / sec 2 (~ 6,7 g) und einnormale Verschiebung von ~ 40 um. Die harmonischen Signale bei 100, 300, 400 und 500 Hz zumindest eine Größenordnung niedriger als die bei der Grundfrequenz (200 Hz). Jedoch, wenn die Vpp-Wert zu hoch ist (0,15 V), mehreren harmonischen Spitzen von vergleichbarer Intensität der Grundfrequenz detektiert werden (Abbildung 7). Der Vibrationsprofil über die Gerüst durch Überwachen der normalen Verschiebung von insgesamt 73 repräsentativen Punkte an den radialen Richtungen des PCL Oberfläche (Fig. 3) angelegt. Die 3D-Farbtabelle (Fig. 8) zeigt, dass die auf der Oberfläche der Membran erfaßte Schwingungs achssymmetrisch relativ zur Mitte und seiner Ruheposition ist. Die normale Verschiebung festgestellt wird, monoton von der Mitte zu der Kante, wo die Membran befestigt verringern.
MSCs auf PCL Gerüste kultiviert werden unter ausgewählten Vibrationsbedingungen kultiviert. Zellen zu einer 7-da unterzogenY Stimulierung ähnlichen Lebensfähigkeit und Proliferation Eigenschaften wie die statische Steuerelemente (Fig. 9), was bestätigt, daß das Fasergerüst waren cytocompatible und die Schwingung aufgebracht ergab keinen Verlust an Lebensfähigkeit. Zellreaktionen auf Vibrationsanregungen an den mRNA-Niveaus in Bezug auf die Expression von essentiellen Stimmlippen ECM-Proteine wie Elastin (ELN), Hyaluronan-Synthase-1 (HAS1), COL3A1 und MMP1 (Fig. 10) untersucht. Die Schwingungs führt zu einer 2,3 fachen Erhöhung der ELN Expression an Tag 7 im Vergleich zu den statischen Kontrollen. Die Schwingungsanregungen auch COL3A1 Ausdruck mäßig erhöht. Bemerkenswert ist, dass die Expression von großen ECM Umbau Enzyme HAS1 und MMP1, wird wesentlich durch die Schwingungssignale verstärkt. Insbesondere führte die dynamische Behandlung in einem fachen Anstieg von ~ ~ 1,7 und 16,3 für HAS1 und MMP1 Ausdruck (beide p <0,05), die jeweils über ihre statische Kontrollen an Tag 7. Insgesamt ist die induktive Wirkung der Vibrationen auf HAS1 und MMP1 wurde von Tag 3 bis Tag 7 verbessert.
Um die qPCR Ergebnisse weiter zu untermauern, wird die zelluläre Produktion von HA, lösliche Elastin und MMP1 durch ELISA auf der Translationsebene (Abbildung 11) quantifiziert. Die dynamisch kultivierten Zellen produzieren 4,2 ± 0,1 pg / mg (bezogen auf das Trockengewicht Gerüst) löslich Elastin nach 7 Tagen von Vibrationen, während die statischen Kontrollen 2,7 ± 0,2 pg / mg) Elastin nur akkumulieren. Im Durchschnitt 7 Tage von Schwingungen führen zu 2.2-und 4.7-fache Erhöhung der HA und MMP1-Sekretion, relativ zu den entsprechenden statischen Kontrollen.
Video 1: Ein 3D-Simulation, die die Anordnung einer J2-Bioreaktor. Das Video wurde von Autodesk 3ds Max Design (mit freundlicher Genehmigung von Congfei Xie) erstellt.
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. Abbildung 1 Foto, das die Dimension des für die Herstellung der Silikonmembran mit verschanzt Hülse verwendet Al Form Ø:. Durchmesser, d: Dicke / Tiefe, Höhe:. Höhe Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
.. Fig. 2 Ablaufdiagramm, das Bioreaktoranordnung (A) Eine Fotografie eines vierarmigen förmige PCL Gerüst, (B) eine Photographie, die PCL-Gerüst in der Vibrationskammer und der Laser-Vibrometer auf dem Boden der Kammer ausgerichtet befestigt ist, ( C) Ein Querschnittal Ansicht der Vibrationskammer. 1: PCL-Gerüst (rot); 2: Silikonmembran (Cyan); 3: Al stationären bar; 4: Top-Acryl-Block; 5: Bodenacrylblock; 6: Mini-Woofer, (d) Seitenansicht des Vibrationsmoduls, (E) eine Fotografie, die die gesamte Anordnung. Diese Zahl hat sich von Tong et al geändert. Urheberrecht 10 2013, Mary Ann Liebert, Inc. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Illustration von radial markiert Silikonmembran für die Einzelpunkt LDV-Messungen. Diese Zahl hat sich von Tong et al geändert. Urheberrecht 10 2013, Mary Ann Liebert, Inc.
4. REM-Aufnahmen von PCL Gerüste in unterschiedlichen Vergrößerungen. (A) 600X, (B) 7,000 X. Diese Zahl hat sich von Tong et al geändert. Urheberrecht 10 2013, Mary Ann Liebert, Inc. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
5. Die normale Verschiebung in der Mitte der Silikonmembran (w 0) als eine Funktion der angelegten Frequenz (100, 200 und 300 Hz) und der Antriebsspannung (Vpp = 0 bis 0,125 V). Diese Zahl wurde geändert von Tong et al. Urheberrecht 10 2013, Ma ry Ann Liebert, Inc.
6. Schwingungsverhalten an der Mitte der Silikonmembran mit f = 200 Hz und Vpp = 0,1 V (A) Geschwindigkeitsprofil als Funktion der Zeit detektiert. (B) Geschwindigkeitsprofil als eine Funktion der Frequenz. (C) Beschleunigung als Funktion der Frequenz. (D) normale Verschiebung (w 0) als Funktion der Frequenz. Diese Zahl hat sich von Tong et al. 10 geändert. Urheberrecht 2013 Mary Ann Liebert, Inc. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Figur 7. Normale Verschiebung in der Mitte der Membran (w 0) als eine Funktion der Frequenz festgestellt, wenn ein 200-Hz-Sinuswelle wird an den Mini-Woofer an einer Vpp = 0,15 V. eingeführt
Abbildung 8. 3D-Farbtabelle durch Oberflächengridding mit den normalen Verschiebungsdaten von allen Standorten gesammelt gebaut auf der PCL-Gerüst markiert. Hat diese Zahl von Tong et al geändert. Urheberrecht 10 2013, Mary Ann Liebert, Inc.
Abbildung 9. Lebensfähigkeit der Zellen, durch Live / Dead-Färbung sichtbar gemacht, nach 7 Tagen von Schwingungen. Diese Zahl hat sich von Tong e modifiziert wordent al. Urheberrecht 10 2013, Mary Ann Liebert, Inc. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 10. Zelluläre Antworten auf die Vibrationsreize in Bezug auf die Expression von Stimmlippen relevanten ECM-Gene. Die relative Genexpression (fold change) ist normiert auf den jeweiligen statischen Kontrollen an Tag 3 und Tag 7 (gestrichelte Baseline). **: Signifikanter Unterschied (p <0,05) zwischen Tag 3 und 7, #: signifikant verändert (p <0,05) gegenüber dem Ausgangswert. Daten repräsentieren Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM, n = 4). Zwei seitigen Student-t-Test wird für die statistische Analyse verwendet, wobei p <0,05 als signifikant angesehen wird difference (wie unten). Diese Zahl hat sich von Tong et al geändert. Urheberrecht 10 2013, Mary Ann Liebert, Inc.
Abbildung 11. Biochemische Quantifizierung von HA (A), lösliche ELN (B) und MMP1 (C) von MSCs in der PCL-Gerüst unter Stat und Vib Bedingungen für 7 Tage kultiviert produziert. Gesamtbetrag von ECM-Molekülen pro Trockengerüst Gewicht (mg) dargestellt als Mittelwert ± SEM, n = 4 aus der repräsentativen Studie #:. deutlich verbessert (p <0,05) im Vergleich zu den Kontrollen Stat. Diese Zahl hat sich von Tong et al geändert. Urheberrecht 10 2013, Mary Ann Liebert, Inc.
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Discussion
Erfolgreiche Engineering von funktionellen Stimmlippengewebe in vitro erfordert die Erholung von einem Stimmlippenartigen Mikroumgebung, um die Verhaltensweisen der multipotenten Zellen vermitteln. Es ist allgemein anerkannt, dass Gewebe-oder Organstrukturen spiegeln die Funktionen, die sie benötigt, um durchzuführen. Für 22 Stimmlippengewebe werden die hochfrequenten Schwingungen, die bei der Lautbildung auftreten vorgeschlagen wichtig für die Gewebereifung zu sein. In unserer Studie sind PCL Gerüste verwendet, um eine Band-ähnliche strukturelle Unterstützung, während die Stimmlippen Bioreaktor entwickelt, um physiologisch relevante mechanische Signale zu den kultivierten MSCs einzuführen. Die hier beschriebene (J2) Bioreaktor erzeugt die Schwingung elektromagnetisch durch individuelle Lautsprecher und überträgt die Energie aerodynamisch zu den kultivierten Zellen. Im Vergleich zu unseren früheren Design, 18 bewegt das derzeitige System die Quelle der Schwingungsstimulation direkt unter jeder Probe gut, so fora effizientere Energieumwandlung. Als Ergebnis wird eine wesentlich größere normale Verschiebung und eine höhere Beschleunigung unter Verwendung des gegenwärtigen Systems erreicht. Die modulare Bauweise minimiert auch Systemvarianten und mechanische Störung über verschiedene Vibrationskammern.
Unser Design basiert auf einer Silikonmembran, um die Schwingungssignale zu liefern. Es ist daher wichtig, die Membranintegrität und die Homogenität aufrechtzuerhalten. Nachdem die Vorläuferlösung wird in eine Aluminiumform gegossen wird, ist es wünschenswert, die überschüssige Flüssigkeit durch Ziehen eines Glasobjektträger über der Formoberfläche zu entfernen. Konsequente Membranen ohne eingeschlossenen Luftblasen durch Absenken Härtetemperatur und erhöht Härtezeit hergestellt werden. Zusätzlich kann eine 70% ige Ethanollösung verwendet, um vorübergehend quellen die Membran an der Aluminium Schnittstelle zum einfachen Entfernen des gehärteten Silicon ermöglichen. Um die Zellkonstrukte zur dynamischen 3D-Kultur, einer zentral positionierten dünnen Nut zubringen iS in die Silikonmembran, so dass die PCL Gerüste peripher in der Vibrationskammer verankert werden geformt. Die Geometrie der Nut einstellbar ist; damit die Form des Zellkonstrukt kann entsprechend eingestellt, um eine bessere Nachahmung der Geometrie des nativen Stimmlippen werden. 23. Wenn die PCL-Gerüst nicht fest in die Silikonmembran befestigt ist, die LDV Signale an den PCL-und dem Außenbereich auf der Silikon erkannt Membran nicht perfekt überlappen. Bei der Montage des Bioreaktors ist es wichtig, dass alle Komponenten befestigt sind und in dem Maße verschärft, um unerwünschte Bewegungen zu verhindern und um die Kammer zu Kammer Variationen zu minimieren.
Um die Nützlichkeit des Bioreaktors zu validieren, werden MSCs auf PCL Gerüste angebaut und sind intermittierende (OF) Schwingungen für 7 Tage unterzogen. Die von Schwingungen über einen Zeitraum von mehreren Stunden pro Tag eingesetzt, um die Bedingungen zu sprechen von schweren Sprachteilnehmer zu reproduzieren, z. B. Berufs singen ten und Lehrer. 23. Anders als zuvor berichtet, Stimmlippen Bioreaktoren, unsere verursachen keine schädliche Wirkung oder physiologische Trauma zu den Zellen.
Die 200-Hz-Schwingungen werden differentiell regulieren zelluläre Produktion von wichtigen ECM-Komponenten. Elastin ist ein entscheidender Strukturprotein, das in der gesamten Stimmlippen LP gefunden wird, und verleiht Widerstandskraft und Elastizität. 24 Interstitial amorphen Komponenten, wie HA, für die Aufrechterhaltung der richtigen Gewebe Viskoelastizität und die Verhinderung von Narbenbildung bei. 25,26 MSCs unterworfen an die 7-Tage-Behandlung produzieren eine deutlich höhere Menge an Elastin als die statisch kultivierten Kollegen. HA-Biosynthese ist auch empfindlich auf die Schwingungen, wie qPCR Ergebnisse auf HAS1 und ELISA-Ergebnisse auf der HA bestätigt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Vibrationsstimulation durch den Bioreaktor aktiviert ist, die der Produktion von Anti-Narben-Moleküle.
jove_content "> Balanced ECM Umsatz beruht auf gleichzeitige Matrixabscheidung und Abbau. 27 Typ-III-Kollagen ist die Hauptnetzartige Kollagenfaser in Stimmlippen gefunden, wodurch das Gewebe mit tragenden Eigenschaften. 28. Die hier zur Verbesserung der Genexpression angewendet 7-Tage-Schwingungen von COL3A1, aber bei einer viel geringeren Ausmaß als der Elastin. Daher sind die aufgebrachten Schwingungen differentiell reguliert zelluläre Maschinerie für die Synthese von Kollagen und Elastin III beteiligt. Interessanterweise MMP1, eine der wichtigsten MMPs in Matrixabbau und Gewebe einbezogen Umbau 27 ist sehr empfindlich auf die Vibrations Cues. Diese Ergebnisse stimmen gut mit früheren Berichten über vibrationsbedingte MMP1 Hochregulation von Zellen in einem HA-Matrix eingeschlossen. 29. Insgesamt sind die Schwingungsanregungen durch die Stimmlippen Bioreaktor erzeugt zutiefst MSC-Funktionen zu vermitteln, indem sie die Homöostase von Stimmlippenartigen Matrizen.Überallem ist der Roman Stimmlippen Bioreaktor hier vorgestellten modularen und benutzerfreundlich, so dass dynamische Zellkultur in einer reproduzierbaren Art und Weise durchgeführt werden. Allerdings gibt es einige Einschränkungen in der aktuellen Design. Zunächst wird die Schwingungsamplitude, obwohl von der J1-Version verbessert wird, ist immer noch klein im Vergleich zu der Stimmlippengewebe. Zweitens hat unsere Bioreaktor nicht simulieren die bilateralen Kollision von Stimmlippen während der normalen Stimmbildung. Drittens ist unsere PCL Fasergerüst, spiegeln nicht die Gewebe Anisotropie. Zukünftige Arbeiten für die Verbesserung der Design besser zu imitieren, die nativen Bedingungen Stimmbildung gewidmet. In der Zwischenzeit wird eine optimale Regime für 3D dynamische Kultur für die erfolgreiche funktionelle Stimmlippen Montage in vitro untersucht werden.
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Disclosures
Keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Jeffrey Caplan für seine Ausbildung und Erfahrungsberichte zu konfokale Bildgebung. Wir danken auch dem Keck Electron Microscopy Lab und Dr. Chaoying Ni für die SEM-Unterstützung. Diese Arbeit wird von National Institutes of Health (NIDCD, R01DC008965 und R01DC011377) finanziert. ABZ erkennt NSF Integrative Graduate Education & Research Traineeship (IGERT)-Programm für die Finanzierung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | Cure the membrane at 100 °C for 2 hr |
| PCL | Sigma Aldrich | 440744-500G | Mn ~80 kDa, dissolve O/N |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
| Human bone marrow-derived MSCs | Lonza | PT-2501 | Received with passage 2 |
| MSC maintenance media | Lonza | PT-3001 | 10% FBS in basal media supplemented with L-glutamine, gentamicin and amphotericin |
| Accutase cell dissociation reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F2006-1MG | |
| MMP1 DuoSet ELISA kit | R&D systems | DY901 | |
| HA ELISA kit | Echelon Biosciences | K-1200 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| Propidium iodide | Life Technologies | P1304MP | |
| Syto-13 | Life Technologies | S7575 | |
| QuantiTect reverse transcription kit | Qiagen | 205311 | |
| SYBR Green PCR master mix | Life Technologies | 4309155 | |
| Replacement speaker | DAYTON audio (via Parts Express) |
DS90-8 | Paper cone, full range (80-13,000 Hz), 85 dB |
| Ergo Micro torque screwdriver | Mountz | # 020377 | Torque range: 20-120 cN·m |
| Stereo speaker selector | RadioShack | 40-244 | Maximum power handling 50 W |
| Function generator | Agilent | 33220A | Frequency range 1 µHz-20 MHz |
| Power amplifier | PYLE audio | PylePro PT2400 | Frequency response: 10 Hz-50 kHz, two speaker channels |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | Steri-Cult 3307 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| High voltage power supply | Spellman | CZE 1000R | Output voltage: 0-30 kV |
| Scanning electron microscope | JEOL-USA | JSM-7400F | |
| Desk gold sputter coater | Denton Vacuum | DSK00V-0013 | |
| Doppler laser vibrometer | Polytec | PDV-100 | Non-contact velocity measurement (0-22 kHz) |
| PCR sequence detection system | Applied Biosystems | ABI7300 | |
| Multiphoton confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510Meta NLO | |
| UV-VIS Spectrophotometer | NanoDrop Products via Thermo Scientific |
ND-2000 | |
| VibSoft Data Acquisition Software | Polytec | Acquisition bandwidth up to 40 MHz | |
| Origin 8.5 data analysis software | OriginLab | ||
| qbasePlus qPCR data analysis software | Biogazelle | V2.3 | |
| Aluminium alloy | McMaster-Carr | Alloy 6061 | |
| Acrylic blocks | McMaster-Carr | ||
| Polycarbonate anti-humidity chamber | McMaster-Carr | Impact-Resistant Polycarbonate | |
| screws | McMaster-Carr | ||
| Electronic cable/wire | |||
| Medical grade PVC tubing | US Plastic Corp. | Tygon S-50-HL | Clear, biocompatible |
| 10 ml Syringe | Becton Dickinson | 309604 | |
| 21 G Blunt ended needle | Small Parts | NE-213PL-25 | 1-1/2" length |
| Alligator clip adapters | RadioShack | 270-354 | Fully insulated |
| 8 mm Biopsy punch | Sklar Surgical Instruments | 96-1152 | Sterile, disposable |
| 12 mm Biopsy punch | Acuderm (via Fisher Scientific) | NC9998681 | |
| Tissue culture flasks | Corning | Cell culture treated |
References
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