Introduction
Den humana stämbands sammansatt av ett epitelskikt, lamina propria (LP) och vocalis muskel, är en specialiserad mjuk vävnad som konverterar luftflödet från lungorna till akustiska vågor för ljudalstring. Ett stämbanden oscillerar regelbundet under normal phonation, uppvisar stammar av upp till 30% i grundfrekvenser som sträcker sig från 100 till 300 Hz. två Vuxen stämbands LP är en gradient struktur bestående av en ytlig (SLP), ett mellanliggande (ILP) och ett djup (DLP) skiktet. Ytterligare klassificeringsgrupper epitelet och SLP som slemhinnan lagret, och kombinerar ILP och DLP i den vokala ligament. 3 SLP skiktet innehåller huvudsakligen en amorf matris med glest spridda kollagenfibrer, medan ligament är berikad med moget kollagen och elastin fibrer för att ge tillräcklig styrka. 4 struktur och mekanik av nyfödda stämbanden varierar avsevärt från sina mogna motsvarigheter. Fastän mekanismens som reglerar stämbands utveckling och mognad är ännu inte helt klarlagda, experimentella bevis har pekat på de definierande roller läte som härrör mekanisk påfrestning.
Flera medicinska tillstånd, inklusive röstmissbruk, infektioner, kemiska irriterande och kirurgiska ingrepp, kan skada stämläppen. Stämbands störningar påverkar uppskattningsvis 3-9% av den amerikanska befolkningen. Nuvarande metoder för behandling av stämbandssjukdomar är begränsade 5 och en stamcellsbaserad tissue engineering strategi har vuxit fram som en lovande strategi för att återställa stämbandsfunktion. Mesenkymala stamceller (MSC) är ett lämpligt alternativ till de primära stämbands fibroblaster för stämbandsvävnadsteknik. 6-9 Stamceller öde specifikation och efterföljande vävnadsutveckling förmedlas av den specifika nisch de bor i, där den mekaniskt skick är en avgörande faktor. 10 Mekaniska krafter är viktiga regulatorer av vävnadsmorfogenes and homeostas, särskilt för vävnader som rutinmässigt utsätts för belastning. 11 Från en vävnadsteknik perspektiv, har det visats att exponering för fysiologiskt relevanta mekaniska stimuli främjar stamcellsdifferentiering och vävnadsspecifika matris ombyggnad. 12-15
Vävnadsodlings bioreaktorer är utformade för att simulera den önskade fysiologiska miljön för cell-eller vävnadstillväxt in vitro. För stämbandsvävnadsteknik, är det särskilt viktigt att återskapa den mekaniska miljön i de phonating stämbanden. En idealisk stämbands bioreaktor bör effektivt leverera vibrations ledtrådar att odla celler, vilket gör facile kontroll över frekvens, amplitud och varaktighet vibrationer. Titze och medarbetare utarbetat en stämbands bioreaktor (T1 bioreaktor) 16 som kombinerar statisk stretch med hög frekvens (20-200 Hz) svängningar för att stimulera cellulär produktion av matrixproteiner. Using denna bioreaktor, Webb och kollegor 17 studerat effekterna av 10-dagars, 100-Hz vibrationer på dermala fibroblaster odlade i en hyaluronsyra (HA)-baserad hydrogel. Konstruktioner som utsätts för vibration uppvisade en förhöjd expression av HA-syntas-2 (HAS2), decorin, fibromodulin och matrix-metalloproteinas-1 (MMP1), i förhållande till de statiska kontroller. De stimulerande effekterna befanns vara tidsberoende. På senare tid, vår grupp 18 monterade en stämbands bioreaktor (J1 bioreaktor) med hjälp av en effektförstärkare, en funktionsgenerator, en sluten högtalare och en omkrets förankrad silikonmembran som överför den oscillerande luft till bifogade cellerna. Neonatal förhud fibroblaster odlas på J1 bioreaktorn utsattes för en timme av vibration vid 60, 110 eller 300 Hz, med en i-planet-stammen av upp till 0,05%. De qPCR resultat föreslog att uttrycket av vissa ECM gener var måttligt revideras med hänsyn till de olika vibrationsfrekvensernaoch amplituder.
Dessa bioreaktor designer, medan spännande, har flera begränsningar. Exempelvis krävs det T1-systemet ett stort antal kontakter och barer för mekanisk koppling, begränsa de maximala frekvenserna uppnås. Vidare kan cellerna utsättas för oönskad mekanisk omrörning och vätske perturbation som komplicerar tolkning av data. Den J1 bioreaktor, å andra sidan, uppvisar effektivitet relativt låg energiomvandling och är inte användarvänligt. Dessutom vibrationer lossnar ofta cell-lastad konstruktioner från den underliggande silikonmembranet. Den J2 stämbands bioreaktor redovisas här, utformat bygger på samma princip som den J1 versionen är optimerad för konsekvens och reproducerbarhet. De fonation liknande vibrationer genereras aerodynamiskt i individuellt monterade vibrationskammare där MSC-befolkade fibrösa poly (ε-kaprolakton) (PCL) byggnadsställningar är effektiv attely säkrad. Laser Doppler Vibrometry (LDV) tillåter användaren att kontrollera vibrationsprofilen av membran / scaffold montering. I vår demonstration, är MSC exponerade för 200-Hz-sinusformade svängningar med en 1-tim-on-1-hr-off (OF) mönster för totalt 12 tim dagligen under 7 dagar. Cellulära svaren på de ålagts vibrations ledtrådar undersöks systematiskt. Sammantaget ger J2 stämbands de mest användarvänliga funktioner, vilket gör dynamiska cellkulturstudier som ska genomföras i en hög genomströmning och reproducerbart sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bioreaktor Assembly (Video 1)
- Gör en aluminiumform (cirkulärt munstycke + distans stift) med förutbestämda inre och yttre dimensioner (Figur 1).
- Med hjälp av formen från steg 1,1, tillverka ett silikonmembran (diameter: 42 mm, tjocklek: 1,5 mm, fig 1) med en fast förankrad hylsa (diameter: 12 mm, tjocklek ~ 0,25 mm, formad av distansstiftet i fig 1) i i mitten med hjälp av en kommersiellt tillgänglig silikonelastomersats.
- Gör ett par av akrylblock (figur 2 (4, 5)) med en cirkulär öppning (diameter: 24 mm) i mitten, gravera toppen (1,8 cm tjock) och botten (0,9 cm tjock) block med matchande åsar och spår . 10
- Sandwich silikonmembranet mellan de parade akrylblock. Säkra monteringen med fyra hörnskruvarna med hjälp av en mikro vridmoment skruvmejsel satt till en konstant kraft (35 cN · m). Som ett resultat av ett vattentätt, 24 mm bred och 18 mm djup vibrationskammare skapas (Figur 2C).
- Montera en 3 "utökad räckvidd mini-woofer (Figur 2D, 8 Ω/20 W) under vibrationskammaren genom en annan uppsättning hörnskruvar på botten akrylblocket. Vid denna punkt, är en individuell vibrationsmodul monteras.
- Replikera sju extra vibrationsmoduler. Anbringa fyra av dem till en av två stationära aluminiumstänger (40 cm x 10 cm x 2,5 cm) genom att placera högtalar baser i jämnt fördelade cirkulära hål (diameter: 7 cm, tjocklek: 2 cm) skärs i staplarna. Stabilisera varje högtalare genom att sätta in en skruv genom sidan av aluminium bar i varje cirkulärt hål.
- Individuellt styra högtalarna med en högtalarväljare. Anslut enskilda högtalare till väljaren genom att fästa trådar till de positiva och negativa ingångar på högtalaren kroppen sedan till motsvarande utgångar på väljaren. Talaren Väljaren låter signalen från tHan funktionsgenerator, efter att ha passerat genom en effektförstärkare, för att nå alla åtta högtalare på en gång (figur 2E).
- Placera de två kammar arrayer, högtalarväljare och tillhörande elektronik i ett fukt kapsling. Hysa hela församlingen i en kommersiell cellkultur inkubator.
- Mata huvudkablarna (genom en medicinsk kvalitet PVC-rör) som ansluter slutsteg och högtalare väljare genom filterenheten på baksidan av inkubatorn.
2. Ställnings tillverkning och karakterisering
- Lös PCL-pelletar i kloroform vid en koncentration av 15 vikt-%. Placera lösningen i en 10 ml spruta utjämnade med en 21 G trubbig nål.
- Lås sprutan till en programmerbar sprutpump och ställ in flödeshastighet vid 1 ml / timme.
- Placera aluminiumfolie täckta samlare över från nålen vågrätt, med en nålspets-till-samlare avstånd av ~ 18 cm.
- Kläm fast positiva allialligator klipp till mitten av nålen, och jordklämma till aluminium samlare, ställ sedan in spänningen på högspänningsströmförsörjningen på 15 kV. VARNING: högspänning, hålla avstånd från nålen.
- Sekventiellt slå på sprutpumpen och strömförsörjning; snabbt ren / ta bort den kvarvarande polymerlösning kring nålspetsen med en torr pappershandduk innan stabila fiber jets och Taylor kon 19 bildas.
- Låt fibermaterialet samlas på Al samlare till en tjocklek på ~ 250-300 nm (~ 7 tim under nuvarande spinnförhållanden). Förvara de resulte ställningar i en vakuumexsickator under 1 till 2 dagar för att avlägsna eventuellt kvarvarande lösningsmedel.
- Bild byggnadsställningar, spotta belagda med guld, med hjälp av ett svepelektronmikroskop för att visa konsekvent fiber morfologi. 10
3. Bioreaktor Assembly och karakterisering
- Stansa en cylindrisk skiva (diameter 8 mm) med fyra armar (längd: 2mm) ur den spunna PCL matta (Figur 2A) genom att först använda en 12 mm biopsi diameter punch att skära ytterdiameter av disken. Använd sedan en andra, 8 mm biopsi punch för att göra fyra 2 mm långa skåror jämnt fördelade runt det cirkulära bladet att göra mål när vapnen som ska skäras. Efter poäng med 8 mm punsch, använd en skalpell blad för att skära av kanterna på armarna utåt. Sätt i scaffold in i spåret av silikonmembranet via de förlängda armar (Video 1). Platta till insatt byggnadsställning genom att försiktigt trycka på ytan med hjälp av flathead pincett.
- Fäst en liten bit tunn Al-folie (8 mm x 2 mm, ortogonal form, fig. 2B) till PCL scaffold på stöd laserreflektion.
- Fäst den monterade silikonmembranet / PCL byggnadsställning (som beskrivs i steg 1,4) i vibrationskammaren. Lägg till 1,5 ml vatten i kammaren för att återfukta PCL schavotten före vibrationer.
- Med hjälp av funktionsgenerator, införa vibrations teckenals (t.ex. 200 Hz sinusformade vågor med en topp-till-topp spänning, Vpp, 0,1 V) till inklämt akryl kammare. Använd en voltmeter för att noggrant mäta spänningen vid varje ingång högtalare. Notera: den Vpp avläsning från funktionsgeneratorn att skilja sig från den slutliga spänningen som levereras till högtalaren.
- Montera den enda punkt LDV och säkra den fiberoptiska lasersensor huvud till en pan-tilthuvud stativ. Vinkel sensorhuvudet, så att den är riktad vinkelrätt mot bordsskivan. Anslut LDV sensorhuvudet till datainsamlingsenheten via koaxialkabel då modulen till den bärbara datorn via USB.
- Fokusera laserstrålen vinkelrätt vid olika förutbestämda punkter på silikonmembranet (figur 2B och figur 3).
- Med hjälp av datainsamling programvara, spela in mid-membranförskjutning. Klicka på "Förvärv Settings" i menyn "Alternativ"; sedan ändrar mätningsläget till "FFT221,. Klicka sedan på "Continuous Measurement" i verktygsfältet och klicka sedan på toppen som bildas vid den valda frekvensen (figur 6D) för att spela in förskjutning.
- Plotta den normala mittmembranförskjutning (W 0) som en funktion av den relativa positionen mellan substratet. Konstruera en 3D-färgkarta av ytan vibrerande profil med Origin 8.5 dataanalys programvara.
4. Vibratory Cellodling
- Subkultur mänskliga benmärgsderiverade MSC i T150 vävnadsodlingskolvar vid en första sådd densitet av 4000-5000 celler / cm 2 i MSC underhållsmedier.
- Efter 7-8 dagars cellodling (till ~ 85% konfluens), trypsinize cellerna med en cell dissociation reagens såsom Accutase, räkna med en hemocytometer, centrifug (440 x g under 5 min) och återsuspendera cellpelleten i färsk MSC underhåll media med en koncentration av 4,5 x 10 6 celler / ml.
- Sänk PCL scaffold i 70% etanol O / N. Efter att lösningsmedlet avdunstat, exponera båda sidorna av skelett för bakteriedödande UV-ljus (254 nm) under 5-8 min.
- Blöt PCL ställningen i en 20 | ig / ml fibronektin-lösning vid 37 ° C under 1 timme. Sätt i fibronektin belagda byggnadsställning i silikonmembranet. Montera bioreaktorn som beskrivs i steg 1.
- Fördela 40 ul av cellsuspensionen jämnt på det säkrade PCL ställningen. Låt cellerna fästa under 1 till 1,5 h före tillsats av ytterligare 1,5 ml färskt medium till vibrationskammaren.
- Kultur MSC-laden PCL klätterställning statiskt i 3 dagar och uppdatera media efter slutförandet av den statiska kulturen.
- Införa valda vibrations regimer att de cellulära konstruktioner. Anmärkning: Som ett exempel, celler utsattes för en 1-tim-on-1-hr-off (OF) vibrationer vid 200 Hz med en w 0 av ~ 40 | im under 12 timmar per dag under upp till 7 dagar. Konstruktioner som utsätts för vibrations stimuli betecknas som Vib prover och de kulturöd statiskt i identiska vibrationskammare fungera som statiska kontroller (Stat).
5. Biologiska utvärderingar
- Samla 200 ^ cellodlingsmedia från varje kammare varannan dag (dag 1, 3, 5 och 7) och slå ihop de alikvoter från samma prov tillsammans (800 l vardera).
- Kvantifiera cellulär produktion av matrixmetalloproteinas-1 (MMP1) och HA med hjälp av en MMP1 ELISA Utvecklingspaket och en hyaluronan kompetitiv ELISA kit, respektive, efter tillverkarens förfarande. Samtidigt, analysera produktionen av lösligt elastin gångare efter den tidigare rapporterade ELISA-proceduren. 8
- Efter avslutad sista vibrationscykeln på dag 7, snabbt ta bort de cellulära konstruktioner från vibrationskammare som använder vassa pincett och kortfattat skölj med kallt fosfat saltlösning (PBS, 4 ° C).
- För den levande / döda färgning, inkubera konstruktionerna med propidiumjodid (1:2000 i PBS) ochSyto-13 (1:1000 i PBS) samtidigt i 5 min vid rumstemperatur. Bild de färgade konstruktioner med en multi konfokalmikroskop.
- Separat, snap-frysa PBS-sköljda cellulära konstruktioner på torris och extrahera den totala cellulära RNA efter en tidigare rapporterat protokoll för genanalys. 9
- Verifiera den kvantitet och kvalitet av det extraherade RNA med användning av en UV-Vis spektrofotometer. RNA-prover med A260/A280 och A260/A230 förhållanden av 1,8-2,2 används för efterföljande qPCR analys.
- Omvänd transkribera RNA (500 ng / prov) till cDNA med användning av ett kommersiellt tillgängligt omvänd transkriptionssats.
- Utför PCR-reaktionen på en realtidssekvensdetektionssystem med hjälp av en kommersiellt tillgänglig PCR Master Mix efter det tidigare detaljerade proceduren. 8
- Analysera qPCR resultat med hjälp av kommersiella qPCR dataanalys programvara. För att säkerställa tillförlitligheten i dataanalysen, finns flera referensgener (YWHAZ, TBP, PPIA) anställd som internal kontroller, och variationen av specifika primer effektivitet beaktas. 8
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De PCL scaffolds tillverkats genom electro innehålla mikronstorlek interstitiala porer och slumpmässigt hoptrasslade fibrer med en medeldiameter av 4,7 | im (figur 4A). Vid en större förstoring, nanoskala spår och porer är synliga på enskilda fibrer (Figur 4B). Beläggning av ställningar med fibronektin förbättrar hydrofilicitet och underlättar den initiala celladhesion / spridning på PCL schavotten (opublicerad observation).
Sinusvågformer med önskad frekvens (f, 100-300 Hz) och spänning (Vpp: 0 till 0,125 V) introduceras till högtalaren under varje vibrationskammare, och luften begränsas mellan botten av silikon membran och strut av en mini-woofer drivs till oscillering. Luften svängning levereras till PCL ställningen med eller utan celler. LDV används för att analysera de vibrationsegenskaper hos byggnadsställning vid en given f och Vpp,med hänsyn till brytningsindex för vatten (1,33). 20 Figur 5 visar den normala förskjutnings (W 0) vid centrum av den PCL-byggnadsställning som en funktion av Vpp och f. De vibrationsfrekvenser är valda för att återspegla de grundläggande mänskliga talande frekvenser. 21 Det finns ett linjärt samband mellan w 0 och Vpp i intervallet från 0 till 0,125 V för samtliga testade frekvenser. Vid en given Vpp, v 0 minskar när f ökar från 100 till 300 Hz.
En specifik vibrationstillstånd (f = 200 Hz, Vpp = 0,1 V) väljs för ytterligare analys. Hastighetsprofilen som funktion av tiden (figur 6A) visar att den sinusformade signalen introduceras till högtalaren fångas upp av PCL schavotten med high fidelity. I mitten av PCL schavotten oscillerar i längsled med en topphastighet på 52 mm / sek, en maximal acceleration på 66 m / s 2 (~ 6,7 g) och ennormal förskjutning av ~ 40 | im. De harmoniska signaler vid 100, 300, 400 och 500 Hz är åtminstone en storleksordning lägre än de vid grundfrekvensen (200 Hz). Men om Vpp värdet är för högt (0,15 V), är flera harmoniska toppar av jämförbar intensitet till grundfrekvensen upptäckts (Figur 7). Vibrationen profilen över scaffold skapas genom att övervaka den normala förflyttningen av ett totalt antal av 73 representativa punkter på de radiella riktningarna hos det PCL-yta (figur 3). 3D-färgkarta (figur 8) visar att vibrationen detekteras på ytan av membranet är axisymmetrical förhållande till centrum och dess vilolägen. Den normala förskjutnings befinns minska monotont från centrumet till kanten, där membranet är fäst.
MSCs odlade på PCL byggnadsställningar odlas under valda vibrationsförhållanden. Celler som utsätts för en 7-daY av stimulering upprätthålla liknande livskraft och spridningsegenskaper som de statiska kontroller (Figur 9), vilket bekräftar att de fibrösa byggnadsställningar var cytocompatible och vibrationer tillämpas inte i någon förlust av livskraft. Cellulära svaren på vibrations stimuli undersöks på mRNA-nivåer i fråga om uttrycket av viktiga stämbands ECM-proteiner, såsom elastin (ELN), hyaluronansyntas-1 (has1), Col3A1 och MMP1 (Figur 10). Den vibration leder till en 2,3-faldig ökning i ELN expression vid dag 7, i förhållande till de statiska kontroller. De vibrerande stimuli ökade också Col3A1 uttryck måttligt. Det är anmärkningsvärt att ett uttryck för större ECM remodeling enzymer, has1 och MMP1, betydligt förstärks av vibrationssignaler. Specifikt ledde den dynamiska behandlingen i en trefaldig ökning av ~ 1.7 och ~ 16,3 för has1 och MMP1 uttryck (båda p <0,05), respektive, över sina statiska kontroller på dag 7. Sammantaget, den induktiva effekten av vibrationerna på has1 och MMP1 förbättrades från dag 3 till dag 7.
För att ytterligare underbygga de qPCR resultat, är den cellulära produktionen av HA, lösligt elastin och MMP1 kvantifieras med ELISA på translationell nivå (Figur 11). De dynamiskt odlade celler producerar 4,2 ± 0,1 ng / mg (per torr scaffold vikt) löslig elastin efter 7 dagar av vibrationer, medan de statiska kontroller ackumuleras endast 2,7 ± 0,2 pg / mg) elastin. I genomsnitt 7-dagars AV vibrationer resulterar i 2,2-och 4,7-faldig ökning av HA och MMP1 sekretion, i förhållande till motsvarande statiska kontroller.
Video 1: En 3D-simulering som visar montering av en J2 bioreaktor. Videon skapades av Autodesk 3ds Max Design (Med tillstånd av Congfei Xie).
"Fo: keep-together.within-page =" alltid ">
. Figur 1 Fotografera illustrerar dimension Al mögel som används för att tillverka silikonmembranet med inrotade hylsa Ø:. Diameter, d: tjocklek / djup, h:. Höjd Klicka här för att se en större version av denna siffra.
.. Figur 2 Flödesschema som visar bioreaktom aggregat (A) Ett fotografi av en fyra-armad formade PCL scaffold, (B) ett fotografi som visar PCL scaffold säkrad i vibrationskammaren och vibrometer lasern fokuserad på botten av kammaren; ( C) Ett tvärsnittal vy av vibrationskammaren. 1: PCL byggnadsställning (röd); 2: silikonmembranet (cyan); 3: Al stationära bar; 4: top akryl block; 5: bottom akryl block; 6: mini-woofer, (D) sidovy av den vibrationsmodulen, (e) Ett fotografi som visar hela anordningen. Denna siffra har modifierats Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Illustration av radiellt märkt silikon membran för enstaka punkt LDV mätningar. Siffran har modifierats Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc.
Figur 4. SEM-bilder av PCL byggnadsställningar vid olika förstoringsgrader (A) 600X, (b). 7000 X. Denna siffra har modifierats Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Det normala förskjutning vid mitten av silikonmembran (w 0) som en funktion av den pålagda frekvensen (100, 200 och 300 Hz) och drivspänningen (Vpp = 0 till 0,125 V). Denna figur har modifierats från Tong et al. 10 Copyright 2013, Ma ry Ann Liebert, Inc.
Figur 6. Vibrationsegenskaper detekterade vid centrum av silikonmembranet med f = 200 Hz och en Vpp = 0,1 V. (A) hastighetsprofil som en funktion av tid. (B) hastighetsprofil som en funktion av frekvensen. (C) Acceleration som en funktion av frekvensen. (D) Normal deplacement (vikt 0) som en funktion av frekvensen. Denna siffra har modifierats Tong et al. 10. Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
/ 51594fig7highres.jpg "/>
Figur 7. Normal förskjutning detekteras vid centrum av membranet (w 0) som en funktion av frekvensen, när en 200 Hz sinusvåg införes till mini-woofer vid en Vpp = 0,15 V.
Figur 8. 3D-färgkarta konstrueras av ytan gridding med normala förskjutnings data från alla platser markerade på PCL schavotten. Siffran har modifierats Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc.
Figur 9. Cellviabilitet, visualiseras genom levande / döda färgning, efter 7 dagar av vibrationer. Siffran har modifierats Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10. Cellular svar på de vibrerande stimuli i fråga om uttrycket av stämbands relevant, ECM-gener. Den relativa genuttryck (fold change) normaliseras till respektive statiska kontroller på dag 3 och dag 7 (streckad baslinjen). **: Signifikant skillnad (p <0,05) mellan dag 3 och 7, #: väsentligt förändrats (p <0,05) jämfört med baslinjen. Data representerar medelvärde ± standardfelet för medelvärdet (SEM, n = 4). Tvåsidiga Students t-test används för statistisk analys, med p <0,05 betraktas som signifikant difference (samma som nedan). Denna siffra har modifierats Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc.
Figur 11. Biokemisk kvantifiering av HA (A), lösligt ELN (B) och MMP1 (C) som produceras av MSC: er odlade med PCL-byggnadsställning enligt Stat och VIb villkor för 7 dagar. Total mängd ECM-molekyler per torr scaffold vikt (mg) representeras som medelvärde ± SEM, n = 4 från den representativa prov #:. betydligt bättre (p <0,05) jämfört med Stat kontrollerna. Denna siffra har modifierats Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Framgångsrik konstruktion av funktionella stämbands vävnader in vitro kräver återskapande av en stämbandsliknande mikromiljö för att medla beteenden av multipotenta celler. Det är allmänt accepterat att vävnads-eller organstrukturer avspeglar de funktioner som de är skyldiga att utföra. 22 För stämbands vävnader, är de högfrekventa vibrationer som uppstår under fonation föreslagits vara viktiga för vävnads mognad. I vår studie, är PCL-ställningar som används för att ge en ligament-liknande konstruktionsstöd medan stämbands bioreaktorn syftar till att införa fysiologiskt relevanta mekaniska signaler till de odlade MSC. Bioreaktorn beskrivs här (J2) skapar vibrationer elektromagnetiskt genom individuella högtalare och överför energi aerodynamiskt till de odlade cellerna. Jämfört med vår tidigare design, rör sig 18 det nuvarande systemet källan till vibrations stimulering direkt under varje prov också, så att fora effektivare energiomvandling. Som ett resultat, är en betydligt större normal förskjutning och en högre acceleration uppnås med det nuvarande systemet. Den modulära konstruktionen minimerar även systemets variationer och mekanisk störning mellan olika vibrationskammare.
Vår design bygger på ett silikonmembran att leverera vibrationssignaler. Därför är det viktigt att upprätthålla membranintegritet och homogenitet. Efter prekursorn lösningen hälls in i aluminiumform, är det önskvärt att avlägsna överskott av vätska genom att dra en glasskiva över formytan. Konsekvent membran utan några inneslutna luftbubblor kan framställas genom att sänka härdningstemperaturen och samtidigt öka härdningstiden. Dessutom kan en 70% etanollösning användas för att tillfälligt svälla membranet vid aluminium gränssnitt för att möjliggöra enkel borttagning av det härdade silikon. För att tillgodose de cellulära konstruktioner för 3D dynamisk kultur, en centralt placerad tunn skåra imellan ingjutna i silikonmembranet, så att PCL-ställningar kan periferiellt förankrad i vibrationskammaren. Geometrin hos spåret är justerbar; sålunda formen hos den cellulära konstruktionen kan anpassas i enlighet med detta för att bättre efterlikna geometrin hos nativa stämbanden. 23 Om PCL byggnadsställning inte är ordentligt fastsatt i silikonmembranet, LDV-signaler som detekteras vid PCL och på det yttre området på silikonen membran kommer inte att överlappa perfekt. Vid montering bioreaktorn, är det viktigt att alla komponenter är säkrade och dras åt i samma utsträckning för att undvika oönskade rörelser och minimera kammaren till kammarvariationer.
För att validera nyttan av bioreaktorn är MSCs odlas på PCL byggnadsställningar och utsätts för intermittent (OF) vibrationer i 7 dagar. Den av vibrationer under en period på flera timmar per dag används för att återge de talande förhållanden tunga röst användare, t.ex. professionell sjunga ers och lärare. 23 Till skillnad från tidigare rapporterade stämbands bioreaktorer, vårt inte orsakar någon skadlig effekt eller fysiologisk trauma till cellerna.
De 200-Hz-vibrationer befinns differentiellt reglera cellulär produktion av viktiga ECM-komponenter. Elastin är ett viktigt strukturellt protein som finns i hela stämbands LP, och ger spänst och elasticitet. 24 Interstitial amorfa komponenter, såsom HA, bidra till att de har rätt vävnad viskoelasticitet och förebyggande av ärrbildning. 25,26 MSCs utsätts till 7-behandlingsdagen producera en betydligt större mängd elastin än de statiskt odlade motsvarigheter. HA biosyntesen är också känslig för vibrationer, vilket bekräftas av qPCR resultat på has1 och ELISA-resultat på HA. Dessa fynd tyder på att vibrationsstimulering aktiveras av bioreaktorn bidrar till produktionen av anti-ärrbildning molekyler.
jove_content "> Balanserad ECM omsättning bygger på samtidig matris nedfall och nedbrytning. 27 typ III kollagen är den stora retikulära kollagen fibrer som finns i stämbanden, vilket ger vävnaden med bärande egenskaper. 28 De 7-dagars vibrationer tillämpas häri öka genuttryck av Col3A1, men till en storleksordning mycket lägre än den hos elastin. därför de pålagda vibrationer differentiellt reglera cellulära maskineriet involverad i syntesen av kollagen III och elastin. Interestingly MMP1, en av de viktigaste MMP: er som är involverade i matrisnedbrytning och vävnadsombildning 27 , är mycket känslig för vibrationssignaler. Dessa resultat stämmer väl överens med tidigare rapporter om vibrations-inducerad MMP1 uppreglering av celler som infångats i en HA-matris. 29 Sammantaget vibrerande stimuli som genereras av stämbands bioreaktor djupt medla MSC funktioner genom att främja homeostas av stämbandsliknande matriser.Överallt är det nya stämbands bioreaktor presenteras här modulära och användarvänliga, vilket tillåter dynamisk cellkultur som ska utföras på ett reproducerbart sätt. Det finns dock flera begränsningar i den nuvarande utformningen. Först den vibrationsamplitud, även förbättrats från J1-versionen, är fortfarande liten jämfört med stämbands vävnad. För det andra behöver vi bioreaktor inte simulera bilaterala kollision mellan stämbanden under normal fonation. För det tredje behöver vi fibrösa PCL byggnadsställning inte speglar vävnaden anisotropi. Framtida arbete är att förbättra konstruktionen för att bättre efterlikna de infödda fonation förhållanden. Under tiden kommer optimala system för 3D dynamisk kultur undersökas för en framgångsrik funktionell stämbands församling in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga konkurrerande ekonomiska intressen finns.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Jeffrey Caplan för hans utbildning och rådgivning om konfokal avbildning. Vi tackar också Keck Electron Microscopy Lab och Dr Chaoying Ni för SEM hjälp. Detta arbete finansieras av National Institutes of Health (NIDCD, R01DC008965 och R01DC011377). ABZ erkänner NSF integrativ forskarutbildning och forskning Praktik (IGERT) program för finansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | Cure the membrane at 100 °C for 2 hr |
| PCL | Sigma Aldrich | 440744-500G | Mn ~80 kDa, dissolve O/N |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
| Human bone marrow-derived MSCs | Lonza | PT-2501 | Received with passage 2 |
| MSC maintenance media | Lonza | PT-3001 | 10% FBS in basal media supplemented with L-glutamine, gentamicin and amphotericin |
| Accutase cell dissociation reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F2006-1MG | |
| MMP1 DuoSet ELISA kit | R&D systems | DY901 | |
| HA ELISA kit | Echelon Biosciences | K-1200 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| Propidium iodide | Life Technologies | P1304MP | |
| Syto-13 | Life Technologies | S7575 | |
| QuantiTect reverse transcription kit | Qiagen | 205311 | |
| SYBR Green PCR master mix | Life Technologies | 4309155 | |
| Replacement speaker | DAYTON audio (via Parts Express) |
DS90-8 | Paper cone, full range (80-13,000 Hz), 85 dB |
| Ergo Micro torque screwdriver | Mountz | # 020377 | Torque range: 20-120 cN·m |
| Stereo speaker selector | RadioShack | 40-244 | Maximum power handling 50 W |
| Function generator | Agilent | 33220A | Frequency range 1 µHz-20 MHz |
| Power amplifier | PYLE audio | PylePro PT2400 | Frequency response: 10 Hz-50 kHz, two speaker channels |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | Steri-Cult 3307 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| High voltage power supply | Spellman | CZE 1000R | Output voltage: 0-30 kV |
| Scanning electron microscope | JEOL-USA | JSM-7400F | |
| Desk gold sputter coater | Denton Vacuum | DSK00V-0013 | |
| Doppler laser vibrometer | Polytec | PDV-100 | Non-contact velocity measurement (0-22 kHz) |
| PCR sequence detection system | Applied Biosystems | ABI7300 | |
| Multiphoton confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510Meta NLO | |
| UV-VIS Spectrophotometer | NanoDrop Products via Thermo Scientific |
ND-2000 | |
| VibSoft Data Acquisition Software | Polytec | Acquisition bandwidth up to 40 MHz | |
| Origin 8.5 data analysis software | OriginLab | ||
| qbasePlus qPCR data analysis software | Biogazelle | V2.3 | |
| Aluminium alloy | McMaster-Carr | Alloy 6061 | |
| Acrylic blocks | McMaster-Carr | ||
| Polycarbonate anti-humidity chamber | McMaster-Carr | Impact-Resistant Polycarbonate | |
| screws | McMaster-Carr | ||
| Electronic cable/wire | |||
| Medical grade PVC tubing | US Plastic Corp. | Tygon S-50-HL | Clear, biocompatible |
| 10 ml Syringe | Becton Dickinson | 309604 | |
| 21 G Blunt ended needle | Small Parts | NE-213PL-25 | 1-1/2" length |
| Alligator clip adapters | RadioShack | 270-354 | Fully insulated |
| 8 mm Biopsy punch | Sklar Surgical Instruments | 96-1152 | Sterile, disposable |
| 12 mm Biopsy punch | Acuderm (via Fisher Scientific) | NC9998681 | |
| Tissue culture flasks | Corning | Cell culture treated |
References
- Titze, I. R.
- Titze, I. R. On the Relation Between Subglottal Pressure and Fundamental-Frequency in Phonation. J. Acoust. Soc. Am. 85, 901-906 (1989).
- Gray, S. D.
- Thibeault, S. L., Gray, S. D., Bless, D. M., Chan, R. W., Ford, C. N. Histologic and rheologic characterization of vocal fold scarring. J. Voice. 16, 96-104 (2002).
- Hansen, J. K., Thibeault, S. L. Current understanding and review of the literature: Vocal fold scarring. J. Voice. 20, 110-120 (2006).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Hanson, S. E., et al. Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Vocal Fold Fibroblasts. Laryngoscope. 120, 546-551 (2010).
- Tong, Z., Duncan, R. L., Jia, X. Modulating the behaviors of mesenchymal stem cells via the combination of high-frequency vibratory stimulations and fibrous scaffolds. Tissue Eng. Part A. 19, 1862-1878 (2013).
- Tong, Z., Sant, S., Khademhosseini, A., Jia, X. Controlling the Fibroblastic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Via the Combination of Fibrous Scaffolds and Connective Tissue Growth Factor. Tissue Eng. Part A. 17, 2773-2785 (2011).
- Jones, D. L., Wagers, A. J. No place like home: anatomy and function of the stem cell niche. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, DOI. 11-21 (1038).
- Wang, J. H., Thampatty, B. P. Mechanobiology of Adult and Stem Cells. Int. Rev. of Cell Mol. Biol. 271, 301-346 (2008).
- Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly (ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Eng. Part A. 16, 3457-3466 (2010).
- Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Mooney, D. J. Cyclic mechanical strain regulates the development of engineered smooth muscle tissue. Nat. Biotechnol. 17, 979-983 (1999).
- Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. J. Biomech. 39, 1136-1144 (2006).
- Kim, Y. J., Sah, R. L. Y., Grodzinsky, A. J., Plaas, A. H. K., Sandy, J. D. Mechanical Regulation of Cartilage Biosynthetic Behavior - Physical Stimuli. Arch. Biochem. Biophys. 311, 1-12 (1994).
- Titze, I. R., et al. Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses. J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).
- Kutty, J. K., Webb, K. Vibration stimulates vocal mucosa-like matrix expression by hydrogel-encapsulated fibroblasts. J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 62-72 (2010).
- Farran, A. J. E., et al. Design and Characterization of a Dynamic Vibrational Culture System. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2011).
- Reneker, D. H., Yarin, A. L. Electrospinning jets and polymer nanofibers. Polymer. 49, 2387-2425 (2008).
- Wang, Y., Theobald, P., Tyrer, J., Lepper, P. The application of scanning vibrometer in mapping ultrasound fields. J. Phys.: Conf. Ser. 1, 167-173 (2004).
- Brown, W. S., Morris, R. J., Hollien, H., Howell, E. Speaking Fundamental-Frequency Characteristics as a Function of Age and Professional. J. Voice. 5, 310-315 (1991).
- Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. Faseb J. 20, 811-827 (2006).
- Titze, I. R., et al. Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses. J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).
- Moore, J., Thibeault, S. Insights Into the Role of Elastin in Vocal Fold Health and Disease. J. Voice. 26, 269-275 (2012).
- Thibeault, S. L., Bless, D. M., Gray, S. D. Interstitial protein alterations in rabbit vocal fold with scar. J. Voice. 17, 377-383 (2003).
- Branski, R. C., Verdolini, K., Sandulache, V., Rosen, C. A., Hebda, P. A. Vocal fold wound healing: A review for clinicians. J. Voice. 20, 432-442 (2006).
- Clark, I. A., Swingler, T. E., Sampieri, C. L., Edwards, D. R. The regulation of matrix metalloproteinases and their inhibitors. Int. J. Biochem. Cell B. 40, 1362-1378 (2008).
- Silver, F. H., Horvath, I., Foran, D. J. Viscoelasticity of the vessel wall: The role of collagen and elastic fibers. Crit. Rev. Biomed. Eng. 29, 279-301 (2001).
- Kutty, J. K., Webb, K. Tissue Engineering Therapies for the Vocal Fold Lamina Propria. Tissue Eng. Part B: Rev. 15, 249-262 (2009).
