釉原蛋白 - 壳聚糖水凝胶的发展体外搪瓷愈合了密集接口

Summary

在这篇文章中，我们描述了一个协议，用于制造釉原蛋白，壳聚糖水凝胶浅表性搪瓷重建。组织在磷灰石晶体在水凝胶原位生长形成致密的搪瓷恢复界面，这将提高修复体的有效性和持久性。

Abstract

仿生牙釉质重建是材料科学和牙科的一个重要话题，是治疗龋齿或腐蚀的新方法。Amelogenin 已被证明是控制磷灰石晶体有组织生长的关键蛋白质。在本文中，我们提出了一种使用新型 amelogenin-壳聚糖水凝胶进行浅表牙釉质重建的详细方案。与其他常规治疗方法（如局部氟化物和漱口水）相比，这种方法不仅有可能预防龋齿的发展，还可以促进显着和持久的牙釉质修复。由 amelogenin 组件调节的有组织的珐琅质状微观结构可以显着改善蚀刻牙釉质的机械性能，而磷灰石晶体原位再生形成的致密牙釉质修复界面可以提高修复体的有效性和持久性。此外，壳聚糖水凝胶易于使用，可以抑制细菌感染，这是龋齿发生的主要危险因素。因此，这种生物相容性和可生物降解的 amelogenin-壳聚糖水凝胶有望作为预防、修复和治疗有缺陷的牙釉质的生物材料。

Introduction

牙釉质是人类牙齿坚硬的矿化表面。它由许多针状磷灰石晶体组成，这些晶体捆绑在有组织的平行棱柱中，以确保牙釉质提供的独特机械强度和生物保护^1-2。与其他矿化组织（如骨骼和牙本质）不同，成熟的牙釉质是无细胞的，在矿物质大量流失后无法自我再生^1-2，这通常表现为龋齿或侵蚀。市售产品，如含氟清漆、牙膏和漱口水，可有效使牙釉质再矿化，但它们都没有促进有组织的磷灰石晶体形成的潜力。在临床上，牙釉质修复的常规治疗方法包括使用人造材料（如汞合金、陶瓷或复合树脂）进行填充程序 ³。然而，这些材料通常不能很好地与病变周围的天然组织相连接，因为它们的结构、成分和特性与天然牙釉质不同。因此，继发性龋齿经常在牙齿和异物之间的界面上加班发展。因此，具有致密界面的牙釉质原位再生是材料科学和口腔学领域的一个有吸引力的目标。实现这一目标的一种特别有前途的方法是在牙釉质表面仿生合成类似牙釉质的材料。最近，已经进行了大量体外尝试，使用含有纳米磷灰石或不同有机添加剂的仿生系统来制备类似牙釉质^{的材料 4-12}。然而，开发最佳的仿生策略以促进再矿化晶体以实现完美的致密界面仍然是一个挑战。

在牙釉质矿化过程中，磷灰石晶体的定向生长和伸长受富含 amelogenin 的基质 ^1,13-14 的调节。为了模拟发育中的牙釉质中的有机基质，我们描述了一种详细的方案，用于制造 amelog....

Protocol

人类的臼齿提取以下在南加州大学牙奥斯特鲁夫学校的标准程序提取，并与机构审查委员会的批准处理。

1，酸腐蚀牙齿的制备切片

1. 选择一个人第三磨牙没有任何恢复龋齿。
2. 取出摩尔的根部，并切断摩尔的冠纵切成片2mm厚使用水冷式低速金刚石锯。超声波清洗这些片2分钟，然后用去离子水冲洗一下3倍。
3. 以模拟糜烂性病变，蚀刻牙片，用30％磷酸，持续30秒，然后立即冲洗它们与去离子水。
4. 超声波清洗蚀刻片2分钟，然后用去离子水冲洗一下3倍。

2，釉原蛋白的制备壳聚糖水凝胶

1. 准备事项n个壳聚糖原液
   1. 溶解1％（重量/体积），脱乙酰壳多糖（中分子量75-85％的脱乙酰化），在1％（V / V）的乙酸溶液中，随后在80℃的CO / N搅拌
   2. 将溶液冷却至室温后，用0.45μm的过滤器过滤脱乙酰壳多糖溶液。通过加入1M NaOH溶液将pH值调节至5.0。
2. 钙与磷酸盐贮备液的制备（0.1M）
   1. 称出氯化钙（ _氯化钙 ）和制备的0.1M溶液，然后混合使用涡旋直至溶液澄清。通过加入1M NaOH溶液将pH值调节到11。
   2. 称取磷酸氢二钠（的Na ₂ HPO _4）和制备的0.1M溶液，然后混合使用涡旋....

Results

这里描述的协议的有效性证明用扫描电子显微镜（SEM），选择区域电子衍射（SAED）和X-射线衍射（XRD）分析。修复由牙釉质蛋白 - 壳聚糖（CS-AMEL）水凝胶7天之后，形成在蚀刻釉质表面的搪瓷状层的厚度为15微米的。新生长层呈结晶的高度有序阵列的直径为约50 nm，优选沿c轴生长，垂直于表面（ 图3A中箭头）。值得注意的是，这些针状晶体被组织成束，这是类似天然牙釉质（ 图3B）的基本单位。修补层的选区电子衍射结果显示出一个弧形图案显露沿[002]方向（ 图3C）的新生长的晶体的分层对应。 X射线衍射分析证实该新生长层由磷灰石的晶体，将其沿所述晶体的c-轴排列，根据扫描电子显微镜和选区电子衍射的观察（ 图3D）。

图4示出了新生长层和天然釉质之间的界面的微观结构。注意，该晶体在相同的方向为原来的搪瓷晶粒不生长。可以看出，该蛋白介导的磷灰石增长导致相对于天然牙釉质的晶体（ 图4A）

Discussion

而牙釉质的矿物质含量高使得它在人体中最硬的矿化组织，这种生物陶瓷是易受除盐处理，这往往会出现龋齿或侵蚀。基因突变也可导致薄或软珐琅导致一系列的釉质畸形称为牙釉质发育不全²⁰的遗传性疾病。含氟化物或CPP-ACP的口腔保健产品已在市场上几年（ 即 ，清漆，牙膏和漱口水），以促进初始釉质龋再矿化。然而，没有这些市售品，有促进组织磷灰石晶体的形成的潜力。深搪瓷腔的传统治疗方法包括机械钻孔和随后的填充人工材料，如银汞合金，陶瓷或复合树脂。这样的做法是不理想的早期病变和情况下，当大型AR侵蚀EAS发生在牙釉质。这是因为健康的牙釉质不成比例必须拆除令到牙齿更大的伤害。银汞合金和复合树脂只是暂时的"修复"牙齿与这种馅料通常不会阻止牙齿的蛀牙。原来牙齿表面，并且在填充物之间的粘附健壮是因为材料收缩而在化学成分和微观结构的不同的挑战。

CS-AMEL水凝胶的优势

为了克服上述难题之一的替代策略是再生搪瓷状层，直接到时可以形成紧密的化学接触到的天然底物的.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
人类第三磨牙	南加州大学奥斯特罗牙科学院	N/A	人类磨牙是按照南加州大学奥斯特罗牙科学院的标准拔牙程序提取的，并在机构审查委员会的批准下处理。
重组 pocine amelogenin	表达和纯化 实验室	N/A	rP172，全长
壳聚糖	Sigma-Aldrich	448877	中等分子量，75-85% 脱乙酰
磷酸	VWR	AA033266
醋酸 冰川	VWR	A036289
氢氧化钠	VWR	BDH9292
氯化钙	Sigma-Aldrich	223506
氢磷酸钠无水	VWR	BDH0316
BL21-CodonPlus （DE3）-RP	安捷伦科技公司
硫酸铵	VWR	BDH8001
三氟乙酸	VWR	AAAL06374
乙腈	VWR	BDH1103
氯化镁	VWR	BDH0244
磷酸二氢钾	VWR	BDH9268
氯化钾	VWR	BDH0258
氯化铵	VWR	AAAA15000
HEPES（4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙烷-磺酸）	VWR	AAA14777
氟化钠	VWR	AA11561
Tris 缓冲盐水	Bio-Rad	170-6435	10&次;TBS
牛血清白蛋白	EMD Millipore	12659	CalBioChem， 白蛋白， 牛血清， 组分 V， 低重金属
Triton X-100	EMD Millipore	TX1568-1
鸡抗 Amelogenin	N/A	N/A	来自南加州大学 Malcolm Snead 教授的礼物
牛抗鸡 IgY-FITC	Santa Cruz Biotechnology	Sc-2700
高效液相色谱系统	Agilent Technologies Inc.	Varian Prostar 210
C4 色谱柱	Phenomenx	Jupiter 5μ 300A
扫描电子显微镜	JEOL	JSM-7001
FIB-SEM	JEOL	JIB-4500
透射电子显微镜	JEOL	JEM-2100F
数字低速金刚石锯	MTI Corporation	SYJ-150
荧光显微镜	Leica	DMI3000 B
超声波清洗机	布兰森	2510	42 kHz，100 W
纳米压痕仪	安捷伦科技公司	MTS 经验值