Summary
인간 다 능성 줄기 세포 (hPSC)에서 파생 된 신경 능선 (NC) 세포는 인간 발달과 질병 모델링을위한 세포 대체 요법에 대한 큰 가능성이있다. 여기에, 현재 널리 사용의 공급이없는 적응Abstract
인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)는 접시에 인간의 질병을 모델링하고 질병이나 사고 후 재생 응용 프로그램에 이식 가능한 세포의 원천으로, 인간의 배아 발달을 연구하기위한 큰 잠재력이있다. 신경 능선 (NC) 세포는 말초 신경계 및 아교, 멜라닌 세포 및 간엽 세포에서 세포와 같은 성숙한 체세포 많은 다양한 대한 전구체이다. 그들은 세포의 운명 사양 및 마이그레이션을 포함하여 인간의 배아 발달의 측면을 연구하는 세포의 중요한 원천입니다. 말단 분화 세포 유형으로 NC 전구 세포의 분화는 또한, 시험 관내에서 인간의 질병을 모델링 질병 메커니즘을 조사하고 재생 의료용 세포를 생성 할 수있는 가능성을 제공한다. 이 문서 hPSCs에서 NC 세포의 유도에 대한 현재 사용할 수있는 체외 분화 프로토콜의 적응을 선물한다. 이 새로운 프로토콜은 diffe 18 일이 필요합니다rentiation는 장치가없는 인간 배아 줄기 세포 (hESC의) 라인뿐만 아니라 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC) 선 사이에서 쉽게 확장 가능하고 높은 재현성이다. 과거와 현재 프로토콜은 동일한 정체성 NC 세포를 얻을 수 있습니다.
Introduction
인간 배아 줄기 세포 (hESC의) 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC는) 좋은 동물 모델도 기본 조직이 모두 사용할 수있는 인간의 질병의 조사와 미래의 치료에 특히 엄청난 잠재력을 보여 주었다. hESC의 / hiPSC 기술의 적용 예는 다음과 같습니다 특히 관심의 세포는 무제한 수량 1에서 재생 의학에 hESC의 / hiPSCs에서 생성 할 수 있습니다. 세포는 특정 질환을 운반 환자에서 생산하고 시험 관내 질병 모델에서 2,3 확립하는데 사용될 수있다. 이러한 질병 모델은 신약 화합물 4에 대한 탐구뿐만 아니라 효능과 독성 5에 대한 기존의 약물 테스트에서 대규모 약물 검사를 위해 사용될 수있다. 체외 질병 모델이 새로운 질병 메커니즘의 식별로 이어질 수 있습니다. hESC의 / IPSC 기술의 모든 애플리케이션에 특정 작업을하는 것이 중요하다, 잘 정의그 질병에 영향을 D의 세포 유형. 따라서, 고체 및 재현 시험 관내 분화 프로토콜의 가용성은 hESC의 / hiPSC 기술의 모든 응용 프로그램에 대해 매우 중요합니다. 프로토콜의 hESC / hiPSC 라인과 다른 연구자들 사이 최소한의 변화, 시간 비용, 노력, 어려움과 비용뿐만 아니라 최대 재현성을 표시하는 것이 바람직하다.
신경 능선 (NC) 세포는 표피와 신경 상피 세포 사이의 척추 neurulation 동안 등장. 그들은 증식과 배아에 걸쳐 광범위하게 마이그레이션 및 뼈 / 연골, 두개 안면 골격, 감각 신경, 슈반 세포, 멜라닌 세포, 평활근 세포, 장내 신경, 자율 신경, 크롬 친화 세포를 포함, 자손 세포 유형의 인상적인 다양성을 일으키다 , 심장 중격 세포의 치아와 부신 / 갑상선 선의 세포 6. 따라서, NC 세포 매력적인 셀 줄기 세포들에 대한 분류 및 위해 중요이러한 Hirschsprung의 질병 7, 가족 성 자율 신경 8뿐만 아니라 신경 모세포종 9로 암과 같은 질병의 다양한 모델링. 또한, 그들은 체외에서 인간의 배아 발달의 양상을 연구 할 수있는 가능성을 제공합니다.
현재 널리 인간 배아 줄기 세포 (10, 11)에서 NC 세포의 유도에 대한 시험 관내 분화 프로토콜에 적용 분화 35 일까지 요구하고는 MS5 세포와 같은 기질 피더 세포에 신경 유도를 포함하고, 따라서 제대로 정의되지 않은 조건에서 수행된다. 이 NC 세포를 대량으로 생성하는 스케일 업 할 수 있지만, 높은 처리량 약물 스크리닝 4 필요한 예를 들어, 이는 노동 및 비용 집약적이다. 또한, 재현하기 어려울 수 있습니다 신경 근엽, 수동 계대을 포함하고는 hESC의 또는 hiPSC의 큰 다양성에 적용 할 경우, 따라서 특히 전반적인 변동성이 적용됩니다선. 여기서, 피더 세포의 자유 18 일간 프로토콜 NC 세포의 단계적 유도가 도시된다. 이 방법은 현재 사용되는 프로토콜보다 더 짧고 더 정의된다. 또한, 다른 hiPSC 라인 구비 NC 세포 생성에 매우 강력하다. 중요한 것은이 두 프로토콜에 의해 산출 NC 세포가 신경 근엽 (이하 불리는 장미-NC 또는 R-NC)의 경계에서 나오는 것을 알 수있다. 이 프로토콜을 사용하여 유도 된 세포들은 동일한 NC 마커를 표현하고 마이크로 어레이 분석에 함께 클러스터 형태 학적으로 동일하게 보인다. 새로운 프로토콜 (R-NC)를 사용하여 유도 된 NC 세포들은 마이그레이션 및 상기 뉴런으로 분화 할 수 있도록 이전 프로토콜 (MS5-R-NC)를 사용하여 유도 된 NC 세포와 유사한 기능이다. 따라서 세포는 MS5-R-NC 세포와 동시에 사용될 수있다. hESC의 / IPSC에서 NC 세포의 유도를위한 R-NC 세포 프로토콜은 NC의 혈통을 포함 hESC의 / IPSC 기술의 모든 응용 프로그램에 도움이 될 것입니다. </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 문화 미디어, 코팅 식기 hPSCs의 유지 보수의 제조
1.1 미디어 준비
참고 : 최대 2 주 동안 어둠 속에서 4 ° C에서 살균 및 저장에 대한 모든 미디어를 필터링 할 수 있습니다. 시약 이름, 회사 및 카탈로그 번호는 자료 표에 나와 있습니다.
- DMEM/10 % FBS : 885 ml의 DMEM, 100 ㎖의 FBS, 10 ㎖ 펜 / Strep의 5 ML L-글루타민을 결합합니다.
- HES - 중간 : 800 ml의 DMEM/F12, 200 ㎖의 KSR, 5 ㎖ L-글루타민, 5 ㎖ 펜 / Strep의, 10 ㎖ MEM 최소 필수 아미노산 용액 1 ㎖ β-메르 캅토 에탄올을 결합합니다. FGF-2 미디어를 필터링 한 후 10 NG / ㎖를 추가합니다.
주의 : β-메르 캅토 에탄올은 흡입, 섭취, 피부 접촉을 피할 것, 독성이다. - KSR-차별화 매체 : 820 ml의 녹아웃 DMEM, 150 ㎖의 KSR, 10 ㎖ L-글루타민, 10 ㎖ 펜 / Strep의, 10 ㎖ MEM 최소 필수 아미노산 용액 1 ㎖ β-메르 캅토 에탄올을 결합합니다.
- N2-differentiati매체 : 980 ml의 dH보다 2 O에 12g의 DMEM/F12 분말을 녹여 1.55 g 포도당, 2g 중탄산 나트륨 100 mg의 APO 인간 트랜스페린을 추가합니다. 매체에 용해 된 솔루션을 추가, 25 mg의 인간 인슐린과 40 ㎕의 1 N NaOH로 2 ㎖ Dh를 2 O 혼합. 100 ㎕의 퓨 트레 디 히드로 클로라이드, 60 μL 셀렌, 100 ㎕의 프로게스테론을 추가하고 dH보다 2 O로 1 L까지의 볼륨을 일정하게
문화 요리의 1.2 코팅
- 리겔 코팅 : 해동 1 ㎖는 용해 될 때까지 나누어지는에 19 ㎖의 DMEM/F12를 피펫으로 리겔 나누어지는 냉동. 40 μm의 셀 스트레이너 및 판 (8) ml/10 cm 접시를 통과하여 덩어리를 제거합니다. 실온에서 1 시간 동안 요리를 품어. 즉시 세포를 도금하기 전에 리겔을 대기음.
참고 : 4 ° C 이상의 온도에서 응집 할 수 있기 때문에 리겔 빠르게 작업 - PO / 램 / FN 코팅 : 10cm 접시에 15 ㎍ / ㎖의 폴리-L Ornithin 브롬화 수소 산염을 포함하는 1X PBS의 10 ML을 추가. 37 ℃에서 밤새 요리를 품어 한 번 1X PBS로 접시를 씻고 2 ㎍ / ㎖의 마우스 라미닌-I 및 2 ㎍ / ml의 피브로넥틴을 포함하는 1X PBS의 10 ml/10 cm 접시를 추가합니다. 37 ℃에서 밤새 요리를 품다 세포를 도금하기 전에 완전히 솔루션을 제거하고 플레이트에 뚜껑없이 조직 문화 후드의 벽에 그들을 서서 15 ~ 20 분 동안 실온에서 건조시킵니다.
참고 : 요리는 하나 (눈에 보이는) 표면에 결정 구조를 볼 수 있습니다 때 완전히 건조 및 세포 도금을위한 준비가되어 있습니다. 번호판이 건조 상태에서 몇 시간 동안 RT에서 유지 될 수있다. PO / 램 / FN 요리 2 일간 미리 준비해야합니다. 비상 사태의 경우 램 / FN은 2 ~ 4 시간 동안 배양 할 수있다. 그러나, 이는 차선의 분화 / 생존 결과 위험있다.
hPSCs 1.3 유지
참고 : hPSCs는 0.1 % 젤라틴 및 mitotically 불 활성화 된 마우스 배아 섬유 아 세포 (M에 유지HES 매체에서 EFS를) 보충 10 NG / ML FGF-2 이전에 10, 12 설명한대로. 세포는 6~8일마다 분할해야합니다.
- 5 분 동안 실온에서 (마그네슘이나 칼슘없이 1X PBS에서) 8 ㎖의 0.1 % 젤라틴 코팅 10cm 접시.
- 37 ° C의 물을 욕조에 신속하게 냉동 MEFs 해동. 10 ㎖ DMEM/10 % FBS에 1 백만 MEFs를 추가합니다.
- 젤라틴을 기음과 세포를 접시. 최소 6 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다.
- 한 번 1X PBS로 접시를 씻고 10 μM Y-27632 디 히드로 클로라이드로 보충 10 ㎖의 HES 매체를 추가, 준비된 MEF 플레이트에서 DMEM/10의 %의 FBS를 대기음. 매체는 20 분 동안 37 ° C로 예열합니다.
참고 : hPSCs 수동 분할하는 임베디드 현미경 층류 후드가 사용된다. 그러나, 세포는 적절한 대안적인 방법을 사용하여 계대 배양 할 수있다. - 임베디드 현미경으로 층류 후드에서 셀 리프터를 사용하여 별도의 식민지를 분리하고 그들을 떠 보자.
- 을 사용하여부동 식민지를 대기음 신선하고 따뜻한 MEF 접시에 그들을 파견하는 1 ML의 주사기. 새 접시에 세포의 약 사분의를 전송합니다. 37 ° C에서 알을 품다
- 신선한 HES 매체 매일 세포를 피드.
차별화를위한 hPSCs 2. 도금
참고 : hPSCs (그림 1B 참조) 분할 또는 도금 차별화 식민지가 대형 인 경우에,하지만 여전히 자신의 테두리에서 가능한 차별화 된 세포와 같은 적은 날카로운 가장자리가되어야한다. 세포 계대 설명서를 사용하여 유지하는 경우 콜로니를 쉽게 눈으로 볼 수 있도록 충분히 커야한다. 이 시점에 맞는 느낌을 얻으려면 하나는 계대없이 2 주 동안 별도의 hPSC 요리를 유지하고 세포에 도달보고를 차별화 / 계대를위한 최적의 시점을 통과 할 수있다.
- 분화를 시작하기 전에 리겔 1 시간으로 10 센티미터 요리를 준비합니다. 성공적인 매트 리겔이 도포 될 수있다배의 배율로 확인.
- hPSCs 분할 할 준비가되면, 매체를 기음과 세포에 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 4 ㎖를 추가합니다.
- 하나 하나의 세포가 현미경으로 접시를 들기로 MEFs을 볼 수 있습니다 적극적으로 될 때까지 2 분 동안 수평으로 요리를 흔들어. hPSC 식민지는 식민지로 첨부 남아있다.
- 즉시 철저하게, 트립신을 대기음 판은 2-4 분 동안 RT에 서 보자.
- 플레이트에 HES - 중간 2 ML을 추가하고 P1000 피펫을 사용하여 세포를 분리.
주 : 세포가 쉽게 표면으로부터 들어 올려 질 수없는 경우에, 플레이트가 다른 2-3 분 동안 RT에서 비어 인큐베이션 될 수있다. - 10 μM Y-27632 디 히드로 클로라이드 보충 8 ML의 HES-매체에 세포를 전송합니다.
- 이전에 준비 10cm 접시에서 리겔을 대기음. 리겔 판에 (한 10cm 접시에서 세포가 2 개의 10 센티미터 요리로 분할됩니다 예를 들어) 1:1 또는 1:2의 세포를 접시. 37 ° 품다밤에 C.
참고 :이 도금은 약 10 만 셀 / ㎠가 발생한다.
신경 분화 3. 유도
참고 : 세포 90-100 % 년 합류 (그림 1C 참조), 일반적으로 다음과 같은 일 때 차별화 (0 일) 시작할 수 있습니다. 정확한 컨 플루가 아직 도달하지 않은 경우가 차별화를위한 준비가 될 때까지, 세포 HES 중간 매일 공급 될 수있다. 대안 적으로, 도금 셀의 초기 수는 증가 될 수있다.
- 3 0 일에, 0.1 μM의 LDN193189 및 10 μM SB431542를 포함 KSR-분화 매체를 접시 10 ml/10 cm 매일 세포를 공급.
- 하루 4, 5 급지 75 % KSR-분화 매체 및 25 % N2-분화 배지로 세포 LDN193189와 SB431542을 포함 모두.
- 6 일, 7 사료에 50 % KSR-분화 배지와 50 % N2-분화 배지로 세포 LDN193189 및 SB4를 포함 모두31542.
- 하루에 8, 9 공급에 25 % KSR-분화 매체 75 % N2-분화 배지로 세포 LDN193189와 SB431542을 포함 모두.
- 하루 11 세포의 replating 1.2.2에 표시된 날에 9와 10은 PO / 램 / FN 요리를 준비합니다.
- 날 N2-분화 배지로 10 피드 세포 LDN193189와 SB431542를 포함.
NC 사양의 물방울 4. Replating
- 하루 11 대기음 램 / FN의 이전 준비 판에서와 1.2.2에 설명 된대로 그들이, 20 ~ 30 분 동안 실온에서 완전히 건조 보자.
- 분화 세포에서 매체를 제거 1X PBS로 한 번 세포를 씻어 8 ML의 accutase/10 센티미터 요리를 추가합니다. 37 ℃에서 20 분 동안 품어
- 셀 리프터를 사용하여 세포를 분리하고 5 ㎖ 피펫 accutase에이를 재현 탁. 15 ML 튜브에 현탁액을 전송합니다.
- 1X PBS의 5 ML을 추가, 114 X g에서 5 분 동안 세포를 스핀.
- 10 ㎖ 1 세포를 재현 탁X PBS. 단일 세포 현탁액을 위해 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 필터링 및 혈구 또는 이에 상응하는 기술을 사용하여 세포 수를 세는 방법을 보여줍니다.
- 아래 세포를 스핀 100,000의 농도 200 μM 아스 코르 빈산 (AA), 20 NG / ML BDNF, 100 NG / ML FGF8, 20 NG / ML SHH, 10 μM Y-27632 디 히드로 클로라이드를 포함하는 N2-분화 배지를 재현 탁 -150,000 cells/10 μL.
- 그들이 건조 PO / 램 / FN 15cm 접시에 닿지 않고 서로 가까이 반복 - 피펫, 판 (10) μL 방울을 사용.
참고 : 분화 된 세포의 한 10cm 접시는 일반적으로 약 2 ~ 3 배 15cm 접시 또는 약 100 × 10 μL의 droplets/15 센티미터 요리를 초래한다. - 물방울 N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y 30 ㎖를 추가하고 37 ℃에서 부화 (방울을 방해하지 않는) 매우 신중하게 한 다음, 20 ~ 30 분 동안 실온에서 서 보자
- 하루에 12에서주의 깊게 20 ml/15 cm 접시 N2/AA/BDNF/FGF8/SHH으로 세포를 공급.
- 다에서Y 14-17 N2/AA/BDNF/FGF8으로 모든 두 번째 또는 세 번째 날 세포를 공급.
- 하루에 16, 17에 FACS 정렬 후 NC 세포를 replate하는 PO / 램 / FN 판을 준비합니다.
오. 형광 활성화 된 셀 NC 셀들 (FACS)를 정렬
참고 : FACS에 대한 세포의 준비는 약 2 시간이 필요합니다.
- 18 일째 제거 매체에서 접시에 1X PBS로 한 번 세포를 세척하고 12 ML의 accutase를 추가합니다. 37 ℃에서 20 분 동안 세포를 품어
- 셀 리프터를 사용하여, 표면으로부터 세포를 분리하고 그들을 플로트하자. 50 ML 튜브로 전송하고 1X PBS 30 ㎖를 추가, 5 ㎖ 피펫을 사용하여 현탁액에 세포를 피펫. 114 X g에서 5 분 동안 세포를 스핀.
- P1000 피펫을 사용하여, 1 ㎖ 2 % FBS / HBSS (HBSS 15 mM의 HEPES를 포함)에있는 세포를 재현 탁. 2 % FBS / HBSS의 19 ML을 추가하고 단일 세포 현탁액을 보장하기 위해 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포를 필터링 할 수 있습니다. 15m 얼음에 세포를 품어항체 블로킹에서 다음 혈구를 사용하여 계산합니다.
- 아래 세포를 스핀 및 2 % FBS / HBSS에서 천만 세포 / ml의 농도로 재현 탁 그들을.
- 컨트롤 만 (APC 만 및 488 만) FACS 염색 흠, 단일 염색 (HNK-1 만 만 P75) 및 이차 항체에 대한 1 백만 세포에게 별도로 각을 설정합니다.
- 적절한 샘플을 1 ㎖ 정학 천만 셀 당 P75 차 항체의 HNK-1과 5 μL의 5 μl를 추가하고 얼음에 20 분 동안 품어.
- 10 ㎖의 1X PBS (114 XG에 원심 분리기 5 분)에서 세포를 세척하고 1 ㎖ 2 % FBS / HBSS에있는 세포를 재현 탁. 적절한 샘플을 1 ㎖ 정학 APC의 2 μL 및 1,000 만 셀 당 488 차 항체의 1 μl를 추가하고 어둠 속에서 얼음에 20 분 동안 품어.
참고 : APC와 488은 각각 HNK-1, P75 염색 여기에 사용되는 이차 항체이다. - 10 ㎖의 1X PBS로 세포를 씻어 두 번, 500 ㎕의 1 천만 세포를 재현 탁DAPI (0.5에서 NG / μL) 또는 FACS 분석에서 죽은 세포를 제외 할 수있는 대체 라이브 셀 얼룩을 포함하는 2 % FBS / HBSS.
- FACS 튜브를 충당하기 위해 샘플을 전송합니다.
- 세포 수집에 0.5 ㎖의 2 % FBS / HBSS와 FACS 튜브를 준비합니다.
참고 : 세포 및 수집 튜브가 정렬 시간 동안 어둠 속에서 얼음에 보관됩니다. - DAPI, APC와 488 종류의 DAPI-/HNK-1 + / P75 + 더블 양성 세포를 검출 할 수있는 레이저와 셀 정렬 기계를 사용.
주 : 이들 세포가 정렬 된 모집단에서 제외하기위한 준비 시간 및 셀의 처리는 세포 사멸의 작은 비율에 이르게 DAPI 얼룩 사균에만 따라서 허용한다. 어떤 대안 죽은 / 라이브 얼룩은이 목적을 위해 동일하게 작동합니다. DAPI 자체는 살아있는 세포 인구의 세포 독성을 유발하지 않습니다.
6. 순위 세포의 Replating, NC 유지 보수 및 확장
참고 : FACS 분류 세포는 손이어야한다최적의 생존을 보장하기 위해 특별한주의와 함께했다. 그들을 replating까지 얼음에 있습니다. 와동 또는 가혹를 피펫하지 마십시오. 셀은 튜브를 가볍게 치면 재현 탁 될 수있다.
- FACS 정렬 한 후, 그 아래로 회전 한 후, NC 세포를 계산하고 N2-분화 배지에서 재현 탁 30,000 세포에서 그들을 replate에 해당하는 양의 10 NG / ML FGF2, 20 NG / ML EGF와 10 μM Y-27632 디 히드로 클로라이드로 보충 / 10 μL 방울.
- 완전히 건조 이전에 PO / 램 / FN 접시와 10cm 접시 당 플레이트 약 50 ~ 70 방울을 준비했다. 요리는 20 ~ 30 분 동안 실온에서 서 보자.
- 매우 조심스럽게 방울을 방해하지 않고 N2/FGF2/EGF/Y-27632 20 ml/10 cm 요리를 추가합니다. 37 ° C에서 세포를 품어
- N2/FGF2/EGF으로 2-3 일마다 세포를 공급.
참고 : 그들은 방울 내에서 말뚝 박기 시작할 때 NC 세포가 확장 또는 계대마다 약 4 ~ 5 일이나된다. - 통로 NC 세포는 배지, WA 제거SH 세포는 한 번 1X PBS와 및 CM 요리 accutase/10 8 ML을 추가합니다. 37 ℃에서 20 분 동안 품어
- 5 ㎖ 피펫을 사용하여 플레이트 떨어져 세포를 피펫과 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. PBS 1X 6 ML을 추가합니다.
- 114 X g에서 5 분 동안 세포를 스핀.
- 물방울 μL 20,000 cells/10을 위해 10 NG / ML FGF2, 20 NG / ML EGF와 10 μM Y-27632 디 히드로 클로라이드 보충 N2-분화 배지에서 세포를 Resuspend.
- 건조 PO / 램 / FN 판에 10 μL 방울의 세포를 Replate. 요리는 20 ~ 30 분 동안 실온에서 서 보자.
- 조심스럽게 N2/FGF2/EGF/Y-27632 20 ml/10 cm 요리를 추가합니다. 37 ° C에서 알을 품다
참고 : NC 세포가 유지되거나 상대적으로 균일 한 전구 인구로 최대 2 주 동안 확장 할 수 있습니다. 더 이상 문화가 다양한 자손 세포 유형으로 분화하도록 발생할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MS5-R-NC 프로토콜 (11)를 통해 R-NC 프로토콜의 두 가지 가장 중요한 개선 피더가없는, 정의 분화 조건 및 시간 요건의 전체적인 단축이다. MS5 피더 셀 (13)는 인간 배아 줄기 세포 (14)로부터의 신경 분화를 지원하기 위해 표시되었습니다 쥐의 골수 유래 기질 세포이다. 인간 배아 줄기 세포 따라서 초기 인간 신경 발달을 흉내 낸, NC 세포가 10 등장하는의 주변에, 저밀도 형태의 상피 구조와 신경 근엽 15에 MS5 피더 세포 배양. 그러나, 분자 및 성장 인자 시그널링 MS5 피더 세포로부터 방출하는지 명확하지 않다. 따라서 분화 조건을 제대로 어려운 재발 실험과 hPSC 라인을 통해이를 재현하고, 정의되어 있습니다. 적절한 신경 유도를 들어, 인간 배아 줄기 세포는 합병증이 MS5 피더 세포에 작은 식민지에서 낮은 밀도로 접종 할 필요가팅 스케일링 업 및 분화 된 세포의 높은 수율에 도달. 2009 년, 방법이 매우 효율적으로 12 hPSCs을의 중화하기위한 것으로 개발되었다. 이 방법에서는 hPSCs 10 일 후 신경 유도의 높은 수율을 달성 MS5 피더 세포의 부재하에 단층에서 고밀도로 시딩 하였다. 우리는 MS5-R-NC 분화 프로토콜 (그림 1A)에 적응이 방법의 방식을 따랐다. MEFs (그림 1B)에 식민지에서 배양 HPSCs 고밀도 (그림 1C)에서 단일 층의 문화에 하나의 세포로 리겔에 분산 씨앗을 품고있다. 분화 11 일에, 세포의 대부분은 성공적 (PAX6 양성 12 미도) neuralized있다. 물방울 고밀도 세포를 Replating하면 물방울 (그림 1D 및 그림 2) 내에서 응축 신경 로제트 형성에게 있습니다. NC 세포는 신경 근엽 (그림 1D <의 국경에 등장/ strong>을)과 방울 (그림 1E) 밖으로 이동한다. 상기 배양 7 일 후 NC 세포는 FACS 선별에 의해 단리 될 수있다. HNK-1/p75 이중 긍정적 인 NC 세포는 20-40% (그림 1 층)의 효율로 분리 할 수있다. MS5-R-NC 프로토콜은 다운 스트림 응용 프로그램의 다양한 R-NC 세포 프로토콜이보다 유용하고 35 일까지해야하지만이 프로토콜은 18 일이 걸림.
이 작업의 목적은 기존의 NC 프로토콜로 동일한 세포를 산출, 짧고,보다 재현성 저렴 프로토콜 NC 세포를 생성하는 것입니다. 우리는 성공적으로 다른 hPSC 라인에 걸쳐 프로토콜의 고체 재현성을 보여 적어도 10의 hESC와 hiPSC 환자에서 파생 된 라인과 건강한 컨트롤 (데이터가 표시되지 않음)를 구별하기 위해 새로운 프로토콜을 사용했습니다. 새로운 프로토콜은 소량, SHH 덜 사용 MS5 생산 비용의 부족에 대 LDN의 사용으로 인한 비용을 절약 할 수 있습니다. 새로운 프로토콜은 삼십오일에 비해 십팔일 지속약 5 수유를하기 때문에 그와 관련된 미디어 비용을 절약 기존 프로토콜에의. 두 프로토콜을 생산 세포가 유사한 정체성을 가지고 있는지 조사하기 위해, 우리는 두 가지 프로토콜에서 NC의 세포 발달이 같은 차별화 패턴 (그림 2)는 다음을 보여준다. 세포는 신경 장미 단계를 통과 FACS 정렬 후 동일한 형태로 NC 세포를 얻을 수 있습니다. 기존의 프로토콜에 비해 새로운 프로토콜에 신경 근엽의 작은 크기는 하루에 11에서 replating 후 높은 세포 밀도에 의한 것입니다. 반면에, 기존의 프로토콜 근엽에서 응축으로하지 hPSC 식민지 내에서 형성한다. 두 프로토콜 파생 NC 세포는 HNK-1, AP2 및 네 스틴과 같은 생물학적 NC의 마커를 표현한다. 우리는 해외 유전자 발현 수준 (도 3a)에이 프로토콜 생성 NC 세포를 분석하고 프로토콜이 생성 NC 세포가 밀접하게 서로 클러스터링 것을 발견했다. 장군이었다 NC 세포로 Wnt 신호 전달 경로 (Wnt의-NC)의 활성화에 의해 테드와이 다른 NC 인구 수 있다는 것을 나타내는, 글로벌 유전자 발현 분석 할 때 별도로 생성하는 멜라닌 세포 16, 클러스터의 잠재력을 가지고 표시했다. 실제로, 우리는 R-NC 또는 MS5-R-NC 셀 (데이터 미도시)로부터 시험 관내에서 멜라닌 세포 전구 세포를 생성 할 수 없었다. 마찬가지로, neuroepithelial 세포 (LSB), LDN193189와 SB431542에 10 일 동안 분화 만 분명히 별개의 유전자 발현 패턴을 보여줍니다. Neuroepithelial 세포는 신경계의 초기 조상이며, 따라서 NC 세포에 비해 덜 분화이며 여기서 음성 대조군 집단으로 포함된다. 여기에 생성 된 R-NC 세포가 오래된 프로토콜로 만든 세포와 유사한 경우 평가하기 위해, 우리는 체외 스크래치 분석 (그림 3B)에서의 이동 능력을 보여줍니다. 48 시간 정렬 된 R-NC 세포의 합류 잘 긁 후, 세포 scra로 마이그레이션TCH 성공적으로. 마지막으로, R-NC 세포에서 자율 신경계 세포로 분화 할 수있는 잠재력을 가지고 있음을 보여준다. 세포는 저절로 사일 포스트 HNK1 + / P75 + FACS를위한 차별화 Mash1 및 Tuj1, 자율 신경 (그림 3C)로 표현되는 유전자 염색 하였다.
그림 1. R-NC 분화 프로토콜의 중요한 단계. . MS5-R-NC 10, 11 및 R-NC 분화 프로토콜 체계. 두 프로토콜의 특정 분화 단계가 표시됩니다. MS5 : 피더 기질 세포, KSR : KSR-분화 매체, N2 : N2-분화 매체, LDN : LDN193189, SB : SB431542, S : 소닉 고슴도치, 8 FGF8, A : 아스 코르 빈산, B :. BDNF B. 미분화 hPSC 식민지를 표시합니다 차별화. C 유도하기 전에 월 4 DAPI로 염색. 일반적으로 일일 hPSCs. D 도금 후 차별화 0 일에 세포 밀도 (90~100%의 포화 상태)를 표시합니다. PAX6와 방울. E에서 HNK-1 염색 신흥 NC 세포와 스테인드 신경 로제트를 표시합니다. 하루에게 물방울과 물방울. F의 가장자리에서 신흥 NC 세포에서의 하루 (11)에 replated 13 세포를 표시합니다. 대표 FACS는 차별화 일 18시 HNK-1/p75 이중 긍정적 인 NC 세포를 보여주는 플롯을 정렬. 게이트는 흠 및 단일 스테인드 컨트롤 (도시되지 않음)에 기초하여 선택되었다. 플롯을 정렬 FACS 실험, hPSC 라인과 더블 긍정적 인 단일 양성 세포의 비율의 측면에서 기존의 또는 새로운 프로토콜을 사용하는 사이에 다를 수 있습니다. 따라서, 적절한 NC 세포가 추출되도록하는 이중 양성 집단을 분리하는 것이 중요하다. F로 이미지 C는 새로운 R-NC 프로토콜을 사용하여 생성 하였다.= "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51609/51609fig1highres.jpg"대상 = "_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. MS5-R-NC 또는 R-NC 프로토콜 파생 된 세포의 대등 한 신경 능선 세포의 ID입니다. 두 프로토콜에있는 세포는 신경 장미의 단계를 통해 전달합니다. 정렬 NC 세포는 형태로하고 HNK-1과 AP2로 NC 마커의 발현에 의해 동일하게 보인다. NC 세포가 전구 세포 것을 보여주는, 네 스틴 양성. 스케일 바 : 200 μm의. 모든 형광 사진을 DAPI에 대한 대조된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
신구 프로토콜로 생성 그림 3. NC 세포와 유사한 ID입니다.이있다. MS5-NC-R 및 R-NC 프로토콜 NC 유래 세포를 비교 Illumina의 마이크로 어레이 유전자 발현 데이터의 자율 클러스터링. MS5-R-NC 또는 35 일 또는 18 일에 각각의 R-NC 프로토콜 NC 유래 세포는 인간 12 Illumina의 올리고 뉴클레오티드 어레이에 혼성화로 삼중으로 분석 하였다. 데이터 분석은 PARTEK 게놈 스위트 소프트웨어를 사용하여 수행 하였다. 중요한 차이는 0.05 배 2보다 더 큰 변화와 FDR를 가진 사람으로 정의했다. 1421 유전자 분석 하였다. 그러한 덴드로 길이 유클리드 샘플 유사성, 평균 링키지 클러스터 방법 및 25과 같은 기본 설정, 사용 하였다. 로 Wnt 신호 (Wnt의-NC)를 활성화에 의해 유도 된 NC 세포 (세포의 다른 작풍이었다 하였다LDN193189 일 0-3, SB431542 하루 0-4에서 ntiated, CHIR99021 일 0-11 및 FACS)는 sox10 1 일 11시 16 정렬. 이러한 세포로 Wnt-NC 세포 및 R-NC 세포 집단 구별되어 있음을 나타내는 R-NC 세포 별도로 클러스터. LDN193189와 SB431542 11 일 동안 분화 된 세포는 neuroepithelial 제어 (LSB)에 포함되었다. R-NC와 MS5-R-NC 세포는 대조군 세포에 비해 긴밀 클러스터. 원시 유전자 발현 데이터는 GEO (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) 기탁 #을 사용할 수 있습니다. GSE50643 B. 마이그레이션 분석. HNK1 + / P75 + FACS는 R-NC 세포를 96 - 웰 PO / 램 / FN에 도금 및 24 시간 후 수동으로 상처를 선별하였습니다. 0 시간의 사진은 바로 헥스 긁 및 사후 염색 후 촬영했다. 나머지 우물은 두 번째 사진을 촬영하기 전에 48 시간 동안 이주하는 것이 허용되었다. 스케일 바 : 200 ㎛의 C. 정렬 R-NC 세포는 자발적으로 4 일 동안 차별화시켰다와 엄마를위한 염색SH1, Tuj1 및 DAPI. 스케일 바 :. 500 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
hESC의 / hiPSCs에서 R-NC 세포의 성공적 분화를 들어 다음과 같은 고려 사항이되어야한다. 그것은 항상 무균 배양 조건에서 작동하는 것이 중요합니다. 특히,이 오염이 성공적 분화를 방해 할 것이기 때문에, 정기적으로 마이코 플라스마 오염 hPSC 배양 물을 시험하는 것이 중요하지만, 좀처럼 hPSC 배양 시각적 검출 될 수 없다. R-NC 차별화 90-100% 세포 밀도에서 시작되어야한다; 낮은 세포 밀도는 세포의 생존과 R-NC 분화의 효율성에 영향을 미친다. 그것은 경험적으로 효율적인 NC 차별화를 지원하는 특정 KSR에서 최적의 농도와 시약의 일부 로트 번호를 확인하는 것이 중요합니다. 세포에서 물방울 일 11시 replated 때, 10 ㎕의 방울 내의 셀 밀도가 높아야하고 유용한 실험적으로 결정된다. 적절한 장미와 NC-형성은 액적 내에서 적절한 세포 밀도에 따라 달라집니다. 우리는 obser을 경험적으로세포가 accutase 치료 후 두 번 이상 세척 할 때 VED는 세포의 생존을 증가 시켰습니다. FACS에 의한 R-NC 세포의 성공적인 분리를위한 스테인드 흠, 단일 항체 및 이차 항체 만 염색 된 세포와 같은 적절한 실험 컨트롤은 매우 중요하다. 사균은 DAPI, 7-AAD 또는 프로피 듐 요오다 이드 염색으로 배제 할 수있다. 또한, 항체 희석 경험적으로 각각의 특정 항체의 많은에 대해 결정해야한다. 단일 염색 등 P75 양성 CNS 세포와 같은 원치 않는 세포 유형, 초기 중배엽 또는 placode와 NC 인구의 오염으로 이어질 수 있기 때문에 그것은, HNK-1 P75 이중 염색 R-NC 세포를 정화 FACS 중요합니다. 하나의 스테인드 인구에 비해 두 배의 우리의 경험 비율에서 hPSC 라인과 분화 실험에 따라 다를 수 있습니다. R-NC 세포 생존 포스트 FACS 권할 대신에 세포를 다시 중단 튜브 플릭, 셀의 피펫 팅을 거친되어 피함으로써 증가 될 수있다. 또한, R-NC의 FACS 도금에어컨 매체 (세포는 FACS 이전에 성장 여과 매체)에서 격리 된 세포는 생존 (11)를 개선하기 위해 표시되었습니다. 그것은 효율적으로 중화 로제트 형성을 위해 하루 11 및 14 일째에 신경 상피 마커 PAX6으로 염색 할 수있는 병렬로 작은 규모의 차별화를 수행하는 것이 좋습니다. 이러한 적절한 NC의 차별화를위한 장미 단계에서 HNK-1 또는 AP2로 NC 마커뿐만 아니라, 평가해야한다. 또한, 고립 된 R-NC 세포는 AP2, HNK-1 및 네 스틴 (그림 2)와 같은 NC 마커에 대한 형태와 염색으로 확인해야합니다.
hPSC에서 MS5-R-NC 세포의 유도는 리 외. (10)에 의해 2007 년에 설명되었다. 그것은이 전구체 인구는 NC 계보의 파생 상품으로 전파 추가로 체외에서 분화 할 수있는 것으로 나타났다. MS5-R-NC 세포는 자발적 신경 구 방식 10,17을 이용하여 구별 될 수있다나에 의해 체외 분화에 지시했다. 그것은 MS5-R-NC 세포는 말초 신경계 (자율과 감각 뉴런), 말초 아교 (슈반 세포), 근육 섬유 모세포, 간엽 줄기 세포 및 그 자손 및 평활근 (10)의 셀에 야기 할 수 있음을 확립 하였다. 병아리와 마우스에 이식 MS5-R-NC 세포가 이주 및 생체 내 10에 차별화 것으로 나타났다. MS5-R-NC 세포는 또한 인간의 질병의 모델링에 연루되어있다. 유전 질환 가족의 Disautonomia (FD)의 특성 표현형 환자 특정 hiPSC 파생 MS5-R-NC 세포 2를 사용하여 체외에서 모델로했다. 그러한 장애 NC 셀 개발 및 마이그레이션 등 NC 특성 표현형은 FD 환자 유래의 세포가 아니라 건강한 대조군 세포에 나타냈다. MS5-R-NC 세포는 인간 배아 중에 신경 능선 마이그레이션에 영향을 미치는 화합물의 독성 시험을 확립하는 데에 이용되었다개발, 부정적인 신경 발달 5에 영향을 미칠 수있는 미래의 약물의 방출을 방지 할 수있는 잠재력을 가진. hPSC 기술의 흥미로운 응용 프로그램은 높은 처리량 검사 및 인간의 질병에 대한 의약품 치료 옵션의 테스트입니다. MS5-R-NC 세포 IPSC 계 질환 모델, 즉 '가족 성 자율 신경 소재 최초 화면을 달성하기 위해 사용되었다. 이 화면은 추가 임상 시험에서 평가 될 수있다 새로운 화합물의 확인되었다.
hPSC 필드의 모든 응용 프로그램에 대해 시험 관내 분화 프로토콜의 정확한 재현, 정의 된 특정 사용할 수 있습니다하는 것이 중요합니다. 이 보고서에서, 우리는 hPSCs에서 R-NC 세포의 유도를 위해 설립 된 체외 분화 프로토콜의 적응을 보여줍니다. 보고 된 프로토콜은 이전에 정의 해 배양 조건에서 10을보고 같은 세포와 shorte의를 산출연구 기간. 이 프로토콜은 인간의 질병은 화합물 스크리닝, 독성 시험 및 NC 계통 유래의 세포 유형에 관한 분화 프로토콜의 발전을 위해, NC 계통의 세포에 영향을위한 R-NC 세포를 생성하는데 사용될 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개하는 이해 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
및 트라이 제도 줄기 세포 이니셔티브 (스타 재단)이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서와 NYSTEM (C026447 C026446)에서 교부금을 통해 고급 연구자를위한 친교에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Lot should be tested |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicinlin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | toxic |
| Recombinant human FGF basic (FGF2) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| APO human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Human insulin | Sigma | I2643 | |
| Putriscine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Ornithin hydrobromide | Sigma | P3655 | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5 U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R&D Systems | 423-F8 | |
| Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 464SH | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| Human recombinant EGF | R&D Systems | 236EG | |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | ||
| Antibodies: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | lot should be tested |
| Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | lot should be tested |
| APC rat anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | lot should be tested |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | lot should be tested |
| Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution) | Santa Cruz | sc-5279 | lot should be tested |
| Material/Equipment: | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Cell culture dishes: 10 cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes, pipettes, pipette tips | |||
| Glass hematocytometer | |||
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled) | |||
| Cell culture laminar flow hood with embedded microscope | |||
| Cell culture biosafety hood | |||
| Cell sorting machine, i.e. MoFlo | |||
| Inverted microscope | |||
| 1 ml TB syringe 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Cell lifter Polyethylene | Corning Incorporated | 3008 |
References
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat Biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
- Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Dev Biol. 366, 83-95 (2012).
- McKeown, S. J., Stamp, L., Hao, M. M., Young, H. M. Hirschsprung disease: a developmental disorder of the enteric nervous system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 113-129 (2013).
- Slaugenhaupt, S. A., et al. Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia. Am J Hum Genet. 68, 598-605 (2001).
- Cheung, N. K., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat Rev Cancer. 13, 397-411 (2013).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Itoh, K., et al. Reproducible establishment of hemopoietic supportive stromal cell lines from murine bone marrow. Exp Hematol. 17, 145-153 (1989).
- Barberi, T., et al. Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice. Nat Biotechnol. 21, 1200-1207 (2003).
- Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22, 152-165 (2008).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Molofsky, A. V., et al. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation. Nature. 425, 962-967 (2003).
