Один канал сотового прилагается патч-зажим записи

Summary

Описанный здесь является процедура получения длинные отрезки текущей записи с одного ионного канала с техникой патч-зажим клеток-прилагается. Этот метод позволяет наблюдать в режиме реального времени, картина открытия-закрытия конформации каналов, лежащих в основе биологического сигнала. Эти данные сообщают о свойствах канала в ненарушенных биологических мембран.

Abstract

Ионный канал белки являются универсальными устройствами для быстрой связи через биологические мембраны. Временной подпись ионного потока они создают зависит от свойств, присущих каждому канального белка, а также механизм, с помощью которой он создан и контролируемым и представляет собой важную область текущих исследований. Информация о оперативных динамики белков ионных каналов могут быть получены путем наблюдения протяженных ток, создаваемый одной молекулы. Описанный здесь это протокол для получения клеток-прилагается патч-зажим текущие записи одного канала для лиганд закрытого ионного канала, рецептора NMDA, выразил гетерологично в НЕК293 или изначально в корковых нейронов. Также предложены инструкции о том, чтобы адаптировать метод к другим ионных каналов, представляющих интерес, представляя пример механо-чувствительных канала PIEZO1. Этот метод может предоставить данные о свойствах проводимости телеканала и временной последовательности ОПЕн-закрытые конформации, которые составляют механизм активации канала, тем самым помогая понять свои функции в норме и патологии.

Introduction

Быстрая связь через биологические мембраны опирается почти исключительно на олигомерных пор формирования мембранных белков, как правило, называют каналами. Эти белки отличаются друг от друга в сигналах активации, механизмов вентильных и свойства проводимости. Белки канала, поры селективный к ионам классифицируются как ионных каналов; их активация производит ионные токи через мембрану, и их ответы могут быть записаны с высоким разрешением в реальном времени с использованием электрофизиологические методы. Сигналы активации охватывают широкий спектр химических и физических входов, включая градиентов концентрации, механических и электрических сил и температуры; Таким образом, дальнейшее классификации ионные каналы в лиганда закрытый, механочувствительных, напряжение закрытого или чувствительные тепловые типы. В этой статье, протоколы описаны записывать активность одноканальный от лиганда закрытого канала, рецептора NMDA, и механочувствительных канала, PIEZO1, используя технику патч-зажим.0;

Патч-зажим электрофизиологии является первым и наиболее широко используется экспериментальный метод достаточно чувствительным, чтобы разрешить наблюдение одиночных молекул ^{1, 2.} В дополнение к этому изысканным чувствительности, это значительно расширены биологические препараты поддающиеся электрофизиологического записи, а также позволило наблюдение ионных каналов в интактных мембран. Во-первых, потому что оба зажима напряжения и тока записи осуществляются с тем же электродом, он может быть использован для записи сигналов через мелких клеток или мембран исправлений. Техника показала, что ионные каналы не ограничиваются возбудимых мембран мышц лягушки, угорь electroplaques или кальмаров гигантских аксонов ^{3, 4,} а то, что они представляют вездесущие светильники механизмов сигнализации трансмембранных и пронизывают все сотовые типов мембранных одно-или многоклеточные организмы, а также внутриклеточных мембран. Импортantly, возможность записывать трансмембранных токов, просто подключая стеклянную пипетку, чтобы неповрежденной клетке при условии, что беспрецедентную возможность для записи активности от ионных каналов в их родных бесперебойное мембран. Таким образом, прилагается методика патч-зажим клеток, который описан в этом протоколе, позволяет мониторинг деятельности ионных каналов непрерывно в течение десятков минут или дольше в их родной среде.

При нормальных тепловых флуктуаций, все белки, в том числе белков ионных каналов, пройти структурные изменения в широком масштабе времени, с самых быстрых и частых перестроек, представленных скорее всего движениями боковых цепей и многое медленных, менее частым изменениям, представленных репозиционирования всей домены или подразделения, или в некоторых случаях изменения посттрансляционных или белок-белковых взаимодействий ^{5, 6.} Наблюдая длительные периоды активности, генерируемые одной молекулы может помочь понять функные динамика ионных каналов в неповрежденных физиологических мембран и дает ценную информацию о рабочем механизме молекулы наблюдается.

В отличие от растущего понимания многообразия ионных каналов по всему типов клеток и этапов развития, знаний о молекулярном составе ионных каналов в родных мембран по-прежнему ограничен. Все ионные каналы являются мультимерные белки и большинство родных ионных каналов собрать из нескольких типов субъединиц, производящих белки широкого молекулярного разнообразия, которое часто сопровождается различными проводимости и вентильных свойств. По этой причине, ионные каналы, определенного молекулярного состава изучены при экспрессии в гетерологичных системах. В частности, клетки HEK293, которые клональное линия иммортализованных эмбриональных клеток почки человека ^7, получила широкое признание в качестве предпочтительного системы гетерологичной экспрессии рекомбинантных ионных каналов. Среди человекау преимущества, которые повышенные HEK293 клетки как выбор системы для ионных каналов электрофизиологии являются простота и доступность культивирования и поддержания долгоживущие стабильные культуры, их способность выполнять посттрансляционную складной, обработку и торговлю белков млекопитающих, и во многих случаях , их низкий уровень или даже отсутствие эндогенного выражения для выбранного канала ^{7, 8.} Выражая рекомбинантных ионные каналы и изучения их функциональные свойства в НЕК293 продолжает быть ценным подход для получения информации о структурно-функциональных свойств ионных каналов, а также специфических свойств ионных каналов изоформ и их роли в нативной ткани. Протоколы, описанные в этой статье, могут быть применены в равной степени к рекомбинантным ионных каналов, выраженных в НЕК293 и родных ионных каналов.

Таким образом, методика патч-зажим, через его беспрецедентной производительностью, чтобы решить сигналс от одной молекулы остается, на сегодняшний день, наиболее прямой метод наблюдения за поведением отдельных молекул. В режиме по мобильному подключением, запись патч-зажим позволяет длительные периоды наблюдения, которые, когда сделано для одной молекулы, могут обеспечить исключительное понимание в работе ионных каналов. Ниже представлен протокол для получения текущих записей высокого разрешения от сотовых прикрепленных пластырями, содержащими один белок ионного канала.

Protocol

1. Культура клеток и Экспрессия белка

1. Поддержание клеток НЕК293 (номер ATCC CRL-1573) между проходами 22 и 40, который включает в проходы, выполненные АТСС, в монослойной культуре в DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина смеси при 5% CO ₂ и 37 ° C. Между экспериментов, проход клеток в колбы Т25 5-20 кратных разведений в конечном объеме 10 мл. Примечание: Используя клетки во время этих отрывков гарантирует благоприятный здоровье клеток, которая позволит для оптимального формирования уплотнения и стабильности патч.
2. Для трансфекции клеток НЕК293 пластины в 35 мм чашках при плотности ~ 10 ⁵ клеток / чашку, что соответствует ~ 0,5-0,6 мл клеточной суспензии на чашку и роста клеток в 2 мл среды в течение 18-24 часов.
3. В стерильной 1,5 мл центрифужную пробирку, подготовить трансфекции смесь в течение четырех 35-мм чашки добавлением (в этом порядке): (1) 1 мкг каждого кДНК (GluN1, GluN2A и GFP); (2) 315 мклдважды дистиллированной воды (DDH ₂ O); (3) 350 мкл 42 мМ 4 - (2-гидроксиэтил)-1-пиперазин-кислоты (HEPES) и (4) 35 мкл 2,5 М CaCl ₂ по каплям, который используется для формирования осадка.
4. Вихревой трубы в течение 5 сек и добавить 175 мкл трансфекции суспензии в каждый из четырех 35-мм чашки покрытием накануне, который теперь содержит клетки на 50-60% слияния, и инкубировать клетки при 37 ° С в течение 2 часов.
5. Аспирируйте от трансфекции среду, промывают PBS и заменить 2 мл ростовой среды, дополненной 2 мМ MgCl _2, чтобы предотвратить рецептора NMDA опосредованной эксайтотоксичности ^9. Примечание: клетки могут быть использованы для Электрофизиологические записи 24-48 ч после трансфекции.

2. Электрод Подготовка

1. Создать 2 симметричные пипетки записи, потянув боросиликатного стеклянных трубок с вертикальной съемника. В зависимости от размера и геометрии полученного наконечника пипетки, еще формыиспользуя полировщик. Примечание: размер чаевых может быть оценена визуально и электрически. Визуально, наружный диаметр должен быть в диапазоне 1.4-5.6 мкм. Электрически, оптимальный размер наконечника, при заполнении внеклеточной решение, должны производить сопротивлений в диапазоне 12-24 МОм (см. рисунок 2В).
2. Используйте пипетки решение, которое для сотовых прилагается экспериментов представляющий внеклеточной среде, который будет производить максимальную активность канала и высокие амплитуд тока. Примечание: рецепторы NMDA, это соответствует раствора, содержащего насыщающих концентраций агонистов (глутамат и глицин), 1 мМ ЭДТА, который хелатов ингибиторы двухвалентных катионных и блокаторы и имеет физиологические концентрации натрия (150 мм) в качестве единственного проникающего иона ( в мм: 1 глутамат, 0,1 глицин, 150 NaCl, 2,5 KCl, 1 ЭДТА и 10 HEPBS, буферный при рН 8,0 с 1 N NaOH).

3. Cell-прилагается патч-зажим записи

1. Открыть Softwa сбора данных QUBповторно (www.qub.buffalo.edu), и выбрать окно сбора под "макет". Откройте новый файл данных QUB (QDF) нажмите на ссылку "Новые данные" под выпадающего меню под названием «Файл» и введите следующие исходные параметры: частота дискретизации, 40 кГц; A / D масштабирование, 3000; выходной канал, 1; и размер данных A / D, 2. Отрегулируйте амплитуду масштабирование до 0,1 В / Па щелкнув правой кнопкой мыши файл данных, выбрать свойства, и нажав на вкладку «Данные». Примечание: Эти параметры могут быть уточнены для каждой установки с использованием модели-ячейку в режиме клеток-прилагается. Дополнительная инструкция по регистрации данных с программным обеспечением QUB и свойств QDF-лайн в www.qub.buffalo.edu.
2. Выберите 35 мм чашку, содержащую ионные каналы клеток, экспрессирующих и заменить питательную среду с 2 мл PBS, содержащего кальций и магний; смонтировать блюдо на столике микроскопа и сосредоточиться на клеточном поле с помощью фазового контраста микроскопии для оценки что клетки здоровы и хорошо прикреплен к блюдув монослой моды (рис. 1А). Перейти к регистрации флуоресценции чтобы убедиться, что трансфекции был успешным (рис. 1В). Примечание: диапазон интенсивностей флуоресценции могут быть использованы в виде неочищенного мере экспрессии белка.
3. Для записи одного канала, установить выходной усиления усилителя к x10, настройки патч для β = 1, аналоговый фильтр до 10 кГц, режим фиксации потенциала и приложенное напряжение для 100 мВ. С помощью команды холдинга напряжения в положение ВЫКЛ, нажмите кнопку "тест печать".
4. На основе флуоресценции и здоровья клеток, выбрать ячейку залатать. Убедитесь в фазового контраста, что клетка правильно приложен к блюду, имеет большую часть поверхности клетки подвергаются для ямочного ремонта, а в противном случае выглядит здоровым. Примечание: Поддержание фазового контраста освещения, чтобы избежать отбеливания ячейку при заходе на посадку и патч-зажим.
5. Заполните недавно полированной пипетки с достаточным количеством раствора так что имеет контакт с электроде и слегка встряхнуть, чтобы выбить пузырьки воздуха, которые могут попасть в чаевых. Закрепите записи пипетки на усилитель headstage, затянув уплотнительную винт держателя пипетки и убедившись, что серебряной проволоки погружается в пипетки раствора.
6. С помощью небольшой (5 см) пластиковый шприц, который соединен с держателем пипетки на трубки, осторожно применять положительное давление для предотвращения попадания загрязнений и засорения наконечника при заходе на посадку (рис. 2а).
7. Использование микроманипулятор, направляют пипетку в ванну и позиционировать его непосредственно на ячейку, выбранной для исправления (рис. 1c), закрывая электрической цепи. Принять к сведению осциллографа, который следует указать прямоугольную форму волны, соответствующую усилителя уплотнения тестового сигнала (рис. 2В). Примечание: После вступления в ванне, сопротивление пипетки в оптимальном диапазоне является 12-24 МОм. Для тестового сигнала 5 мВ, измеренный ток гАнж соответствует ~ 20-40 мкА.
8. В процессе мониторинга положения пипетки визуально через микроскоп и пипетки сопротивления электрически на осциллографе, продолжают подход с небольшим шагом, пока пипетка не падает мягко на клетки, и испытательный сигнал немного уменьшается, чтобы указать, повышенное сопротивление (фиг.2В).
9. Чтобы образовать уплотнение, подобрать шприц и применять небольшое отрицательное давление через боковую трубки, потянув поршень шприца, который тянет клеточную мембрану в наконечнике пипетки записи и инициирует образование сопротивления ГОм уплотнением ^10. Принять к сведению от формы сигнала испытательного на осциллографа, в котором формирование уплотнение, указанном его полного выравнивания, только с емкостными переходных видимых (рис. 2В). Примечание: Если сигнал не сгладить полностью или базовый становится шумным, это указывает на слабую печать с существенной утечки тока вокруг уплотнения. Это предотвратит гesolving один канал токи. Если это так, снять пипетку из клетки и от ванны, удалить его со сцены головы и выбросьте его. Повторите процесс с только что отполирован пипетки до получения печать в адекватном диапазоне (≥ 1 ГОм).
10. На усилителя, переключить внешний команда переключения от "уплотнения теста 'до' Off '; переключения команды напряжения держит на положительный (который был установлен ранее в 'Off'); и увеличить коэффициент усиления для x100. Соблюдайте осциллограф для активности канала, который, если он присутствует, будет отображаться в качестве квадратных вверх отклонений от ранее плоской базовой линии (рис. 2С).
11. Если деятельность канала отображается на экране осциллографа, получать данные в ранее открытого цифрового файла в QUB, нажав на кнопку «Play», а затем кнопку «запись». Чтобы остановить сбор данных, нажмите кнопку остановки в QUB, и сохраните файл QDF чтобы легко retrievсостоянии расположение на жестком диске компьютера, выбрав "Сохранить данные как ..." в выпадающем меню под названием 'Файл'.

4. Предварительная обработка данных и Идеализация

Примечание: Важная информация может быть извлечена из отдельных записей канала на статистическом анализе которая присваивает каждому точку данных к соответствующему классу проводимости (в простейшем случае, закрыта или открыта). Этот процесс называют идеализации данных и кратким описанием идеализации данных с сегментным помощью K (SKM) метод ¹¹ в QUB описывается ниже.

1. Откройте файл данных в QUB и просмотра текущих следы в интерфейсе "Pre" в разделе "макет". Дисплей записанный файл нефильтрованное (удалить цифровой фильтр), сняв флажок "Прогноз".
2. Визуально сканировать запись обнаружить неровности и артефакты (рис. 4а). Правильные краткие всплески тока, что OCCUг в след (рис. 4А), выбрав смежную чистом районе того же класса проводимости, выделяя этот регион, щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав "набор буфер стирания. ' Нажмите на шип, пока не могут видеть отдельные точки выборки, выберите регион должны быть заменены и стирать, выделив только этот регион, а затем щелкните правой кнопкой мыши "Erase".
3. Определить текущую базовую нулевой для всей записи, выбрав ранний части записи, где стабильность базовой линии, выделите, щелкните правой кнопкой мыши и выберите "установить базовую линию '. Убедитесь, что руководство, которое появляется точно представляет базовый уровень (фиолетовый на фиг.4В)
4. Определить точки в записи, где сырые исходные данные отклоняется заметно от установленного базового уровня. Исправьте это, выбрав небольшой участок базовой линии в пределах отклоняющимся области щелкните правой кнопкой мыши и выберите команду "Добавить базовый узел".
5. Определить регионы тон запись, содержащий избыточный шум или артефакты, которые не могут быть легко исправлением (фиг.4С). Выделите область, котор нужно сбросить, щелкните правой кнопкой мыши и выберите "Удалить". Примечание: В этом случае кинетическая информация будет потеряна: обрабатывается запись будет короче и точки, возникающие после точки сращивания окажется непрерывной области предварительно шума.
6. Чтобы идеализировать записи с помощью алгоритма SKM ^11, выделить часть трассы, содержащей открытых и закрытых мероприятий и войти в интерфейс "Mod 'под' Макет». В «модельной» панели выделите чистую часть трассы, что является представителем базовой всему файлу, щелкните правой кнопкой мыши черный квадрат (закрытое состояние) и выберите пункт "захват". Сделайте то же самое для отверстий каналов, выделив открытую проводимость, щелкните правой кнопкой мыши красный квадрат в «модельной» панели и выберите пункт "захват".
7. Выполните идеализацияТион для всей записи, выбрав кнопку "Файл" в разделе "Источник данных". Щелкните правой кнопкой мыши на вкладке "идеализировать" под раздел "Моделирование", чтобы убедиться, что желаемые параметры для анализа верны, а затем нажмите кнопку "Выполнить". Результатом идеализации, вместе с амплитудой гистограммы для всего файла, накладывается с данными для обеспечения визуального контроля идеализации (рис. 5). Примечание: Неадекватное идеализация может привести к генерации "ложных событий", в котором QUB обнаруживает канала отверстия и запорные устройства, которые фактически не происходят. В резолюции записи, которая устанавливается аналоговый фильтр усилителя и частоты дискретизации, разрешение, с которым СКМ обнаруживает открытые и закрытые события можно управлять, установив мертвое время для анализа. Оптимальные мертвые раз должен быть выбран путем проб и ошибок и будет зависеть от частоты дискретизации, тем не менее, хорошее правило являетсявыбрать мертвое время, которое 2-3 образцы ^12.
8. Чтобы убедиться, что идеализация точно представляет необработанные данные, вручную сканировать идеализированный след. При обнаружении ошибки в идеализации, выделите след по ложному случае щелкните правой кнопкой мыши и выберите "Регистрация IDL. ' Примечание: Для дополнительных опций и подробного объяснения различных команд и функций в QUB, обратитесь QUB Руководство онлайн (www.qub.buffalo.edu).

Representative Results

Рекомбинантный NMDA рецепторы

Рецепторы NMDA связать и отвечать сопутствующей действия двух со-агонистов: глутамата и глицина. Они собрать как heterotetramers двойки связывания глицина GluN1 субъединицы и два связывания глутамата GluN2 субъединиц. GluN2 субъединицы кодируются четырех генов (AD) и из них наиболее широко транскрибируемые формы в мозге GluN2A у взрослых и GluN2B в отношении несовершеннолетних животных. Из-за разнообразия подтипов рецепторов NMDA в природных препаратах, экспрессирующих рецепторы в клетках НЕК293 (Фиг.1А) позволяет контролировать субъединицы состава, а также возможность записи ток от каналов с использованием мелко полированного стекла пипетки (рис. 1с).

После того, как пипетка касается ячейки, четкое снижение амплитуды импульса сигнала теста происходит (фиг. 2b), что указывает на способность образовывать уплотнение. Адекватное уплотнение, содержащий одинКанал обеспечивает четкое деятельность канала, отображаемого в качестве вниз отклонений от базового уровня, с хорошим отношением сигнал-шум по заявлению положительном напряжении (рис. 2С). Максимальная активность канал для дикого типа рецепторов NMDA рекомбинантный может быть достигнуто, когда оба агонисты присутствуют в высоких концентрациях, и когда ингибиторы и антагонисты отсутствуют. Это идеально подходит, так что, когда патч содержит более одного канала, одновременно отверстия немедленно очевидно, ¹³ (фиг.3В). Для белков с очень низких уровней активности, вероятность того, что один участок отверстия уровня происходит только от одного канала может быть вычислена, если канал открыт вероятность известен или может быть аппроксимирована ^14. Из-за этого, более длинные периоды наблюдений может быть необходимым.

В этих условиях и при применении пипетки удерживающий потенциал 100 мВ (что приводит к приближенному мембранного потенциала -120 мВ), сиngle рекомбинантный GluN1/GluN2A и GluN1/GluN2B открыты с высокой вероятностью (Р _о, 0.3-0.5) к одному относительно высоком уровне проводимости (> 50 пс) (рис. 3А и 5В) ^15-17. При записи, пики тока шум, базовые заносы, или периоды чрезмерного шума может проявиться (4А-C), однако, как уже упоминалось, они могут быть исправлены, если кратко и незначительными. Важно, однако, что деятельность канала записывается непрерывно в течение достаточного количества времени (≥ 10 мин, 10000 событий), чтобы гарантировать, что полная ширина поведения канала в плен.

Полученные таких записей данных может предоставить информацию о двух кинетики канала и проникающие свойства. Здесь мы демонстрируем идеализацию исполнении QUB использованием алгоритма SKM (Рисунок 5A), однако идеализация данные могут быть выполнены с использованием других программ, таких как pClamp или SCAN ^12,й может быть осуществлено с использованием различных алгоритмов или критериев, таких как половина методом пороговой, при этом каждый из этих вариантов, содержащих свои собственные преимущества и недостатки. Место этих данных кинетических моделей могут быть выполнены, чтобы получить дальнейшее понимание поведении ионного канала. Максимальный фитинг вероятность может быть выполнена с программным обеспечением, таким как QUB или HJCFIT ^18, в котором алгоритмы, реализуемые каждой программы имеют свои собственные преимущества. В то время как идеализация показано на рисунке 5 требует только простейший модель одной закрытом состоянии и один открытое состояние должны быть выполнены, установка полную кинетическую модель ионного канала требуется последовательно добавляя закрытого и открытого состояния до определенного критерия не будет достигнута. Этот процесс показал, что дикого типа GluN1/GluN2A рецепторы есть пять кинетически различных замкнутых государств и 3:58 кинетически различные открытые состояния (рис. 5C) ^19, в которых этистробирования характеристики имеют решающее значение для определения формы рецептора NMDA опосредованной синаптической сигнала ^{20, 21.} Этот стиль анализа может быть распространен на другие ионные каналы меньшего проводимости, таких как АМРА-рецепторов, чтобы разобраться в своих различных механизмов вентильных ^22,23,24. Одно предостережение, однако, так как АМРА-рецепторы имеют несколько уровней проводимости,, успешно идеализация помощью QUB могут потребовать дополнительные государства включены в предварительно построенном модели.

Эти методы также могут быть расширены, чтобы получить информацию о проницаемости ионных каналов и проводимости путем изменения пронизывающей композиции и / или концентрацию ионов. Запись деятельность через одно-рецепторов GluN1/GluN2A использованием методов, описанных здесь, но с заменой 150 мМ NaCl с 75 мМ CaCl ₂ в записи пипетки, дает токи с ~ 20% от проводимости (~ 10 пс). Это показывает, что в то время как кальций проникает рецепторы NMDA в приветУровни ГР в физиологических условиях, на самом деле проходит через канал медленнее, чем ионов натрия, указывая, что может быть потенциальным кальций связывающий сайт в проникающей пути. Кроме того, несмотря на это малой проводимости, записи могут быть адекватно идеализировал с использованием алгоритма SKM в QUB, открытие существование промежуточного подуровня проводимости, что составляет около 50% в настоящее время амплитуда основного уровня проводимости (6А, Б). Эти подуровень отверстия, однако, может быть идеализированный только в QUB когда дополнительный класс проводимость включен в начальной кинетической модели. Дальнейшие кинетические анализы показали, что в этих условиях, рецепторы еще проявляют пять кинетически различных замкнутых государств, однако эти государства имеют очень разные постоянные времени и заселенности по сравнению с, когда канал пропускает только ионы натрия (рис. 6в). Кроме того, только два открытых состояний наблюдаются UNDER эти условия, демонстрирующие, что, в дополнение к влияющих канала проводимости, ионы кальция могут модулировать рецептор стробирования.

Там нет определенного способ получить только один канал патчи. Вместо этого несколько экспериментальных манипуляций может способствовать повышению вероятности успеха. Во-первых, стремиться к низким уровнем экспрессии канала путем оценки интенсивности флуоресценции трансфицированных клеток (фиг. 1b). Успешные подходы могут быть: уменьшить общее количество кДНК использовали для трансфекции или уменьшить количество кДНК для требуемого субъединицы, как GluN1; чтобы уменьшить время инкубации с ДНК / осадка фосфата кальция; и выбрать для ямочного ремонта только смутно флуоресцентные клетки от поля зрения. Эти подходы должны осуществляться, если патчи, полученные часто содержат несколько каналов. Кроме того, уменьшение размера наконечника пипетки может также способствовать захвата только один канал в ПАТСчас В конечном счете, однако, один становится успешным в получении одноканальные патчи, систематически воздерживаются от записи в течение длительного времени из патчей, которые содержатся четко определенные более одного канала.

Рекомбинантные PIEZO1 каналы

Методы, описанные в данном протоколе могут быть легко применены к любому лиганда ионный канал, и действительно может быть адаптирован для записи одного активность канала из любого ионного канала, будь то активируется химических веществ, напряжения, силы, температуры или других средств. Один пример того, как этот протокол может быть адаптирован для записи одного канала токов от других ионных каналов, в частности, мышь PIEZO1, механочувствительных ионного канала, представлен ниже (рис. 7) ^{25, 26.}

Как и в случае каналов рецепторов NMDA, PIEZO1 и GFP выражены в клетках HEK293 по фосфата кальция опосредованной трансфекции и используют клетки 24-48 ч после трансфекции в качествеописано в разделе 1.2. Потому PIEZO1 активируется мембранный участке, следует позаботиться, чтобы манипулировать мембрану осторожно во время формирования патч и соответствующих устройств для доставки и управления механической силы, приложенной должны быть доступны. Эти условия могут быть достигнуты путем большие пипетки записи, с сопротивлением в диапазоне 2-3 МОм и с использованием высокоскоростного прижимного устройства (HSPC), соединенный с регистрирующей пипетки через держатель пипетки на усилителе headstage. Параметры усилитель аналогичны тем, которые описаны в отношении рецепторов NMDA в разделе 3.3, для переключения на "внешней" командной ручкой так, что усилитель может управляться с помощью программного обеспечения захвата кроме.

Для записи деятельность с PIEZO1, используйте пипетку записи наполненный (в мм): 130 NaCl, 5 KCl, 10 HEPES, 1 CaCl _2, 1 MgCl _2, 10 TEA-Cl, рН 7,3 с помощью NaOH. В этих условиях отверстия можно контролировать как Inward токи натрия, которые появятся на экране осциллографа как вниз отклонений от нулевой текущей базовой линии. Поместите записи пипетки на сцене усилителя головы и убедитесь, что диск на HSPC на нуле. Перед входом в ванну, нанесите 3-5 мм рт.ст. положительного давления. Использование микроманипулятора, снизить пипетку в ванну, проверьте желаемого сопротивления пипетки, и принести пипетку в непосредственной близости от выбранной ячейки, как описано в разделе 3.6. Осторожно коснитесь клетки в микроскоп руководством и путем мониторинга осциллограф, наблюдать небольшое снижение амплитуды испытательного уплотнение сигнала в аналогичным образом, как это сделано в отношении рецепторов NMDA (раздел 3.7). Быстрое освобождение положительный давление, приложенное через пипетку путем изменения уровня удержания давления от 3-5 до 0 мм рт. Подождите ГОм печатью, чтобы сформировать путем мониторинга форму тест уплотнение волны. В этом случае не отрицательное давление не применяется для формирования уплотнения. После того, как оптимальная уплотнение получается нажмите &# 8216;. Кнопку записи "в QUB начать сбор данных Рисунок 7 показывает, представитель след mPIEZO1 одноканальных токов активированных путем применения -20 мм рт.ст. давления с патч пипетки. Эти токи были фильтрации нижних частот с 2 кГц и пробовали на частоте 20 кГц.

В отличие от лиганда закрытых каналов с внеклеточных лигандов связывающих доменов, стимул активации механочувствительных каналов может изменяться под 2 протоколов. Первый «без зазоров, 'где постоянная отрицательное давление применяется к патч для всей продолжительности записи. Этот протокол является полезной в получении минут длиной записи и является наиболее успешным, с меньшими стимулами давления (от 0 до 20 мм рт.ст.), которые сохраняют целостность мембраны. Активность производится под высоким давлением, что, вероятно, привести к разрыву мембраны, лучше всего получается с «эпизодических» записей, где импульсы разной давления могут быть применены к патча для более коротких периодов времени (<сильный> рис. 7). Как и лигандов закрытого каналов, записи с ячейки прилагается один канал патчи обеспечить богатство информации относительно обоих проводимости и вентильных свойств канала ведется расследование.

Нейронов NMDA рецепторы

Описанный здесь метод для записи одного канала клеток-прикреплен могут быть использованы для получения информации о проводимости и литниковых каналов свойств эндогенных к определенному типу клеток и / или стадии развития. Как и в случае со многими другими гетеромерных каналов, точное молекулярный состав нативных рецепторов NMDA, не известно. Сравнивая результаты, полученные рекомбинантными рецепторами известного состава с данными, полученными из природных препаратов, гипотезы о составе субъединицы и функции каналов в их родной среде можно сформулировать или тестируемого ^17.

Нейроны были выделены из префронтальнойкоре эмбрионов крыс и выращивают в культуре до 6 недель ^17. В дополнение к компонентам, описанным для рекомбинантных рецепторов NMDA записи в разделе 2.2, пипетка Раствор содержал также CNQX (20 мкм) и бикукуллин (10 мкМ), чтобы ингибировать родные АМРА и ГАМК-рецепторов соответственно. В зависимости от возраста культуры, записи, полученные из природных рецепторов NMDA показал кинетику, которые были совершенно различны. Записи с начала (рис. 8А, 5 дней в пробирке) культура больше напоминают кинетика, описанные для GluN1/GluN2B рецепторов и записей с конца (рис. 8B, 27 дней в пробирке) культуры больше напоминают кинетика, описанные для GluN1/GluN2A рецепторов (рис. 3А и 5А). Это наблюдение согласуется с узорами NMDA экспрессии рецепторов изоформ и осторожными характеристик токов записанных от сотовых прилагается патчей одноканальных в бедреpocampal культуры ^16.

Рисунок 1. Выбор клетки НЕК293 клетки для прикрепленной записи.) HEK293-клетки, культивируемые в 35 мм чашку помещают на столик микроскопа и просматривать с фазовым контрастом при 40-кратном увеличении. B) флуоресценции GFP из того же поля зрения, как и в панели А идентифицирует трансфекции клеток. Стрелка указывает на ячейку, которая выражает GFP, появляется здоровый, и находится в положении, поддающейся для доступа пипетки. C) Запись пипетка принес в непосредственной близости от выбранной ячейки с помощью тонкой манипулятор движения под визуальным руководством. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное рисунке.

Рисунок 2. Сотовый прилагается образование уплотнения. A) маленький шприц подключен к стороне держателя пипетки позволяет ручное управление давлением внутри пипетки. B) тока, проходящего через пипетку, погруженного в раствор бани в ответ на тесте усилителя, который при 5 мВ (0,5 кГц) является 18 Па и соответствует размеру пипетки 28 МОм. По касаясь ячейку (Стрелка влево), уровень наблюдаемых ток уменьшается, что свидетельствует о повышенной устойчивостью пипетки. Применяя отрицательное давление через пипетку (Стрелка вправо) инициирует образование уплотнения и снижает сигнал, создаваемый тестового импульса к только емкостных переходных процессов. C) При отсутствии тестовый импульс, и если напряжение не подается через пипетку (0 В), базовый устойчиво (слева стрелкой). Применяя положительное напряжение (стрелки, +100 мВ) пр. oduces стохастические унитарные токи, которые указывают отверстия канала. Красный пунктир показывает текущее базовый нулевой.

Рисунок 3. Сотовые прикрепленные токи, записанные с GluN1/GluN2A рецепторов) Один канал патч:. Сегмент 50 сек непрерывной записи иллюстрирует отверстия каналов к одному единая амплитуды B) Несколько каналов патч:. Сегмент 50 сек непрерывной записи иллюстрирует отверстия каналов на два амплитудных уровнях, указывающих, что патч содержит по крайней мере 2 активные каналы. Красный пунктир указывает нулевую текущую базовую линию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

">
Рисунок 4. Обработка данных.) Поправка на импульсных помех. Данные Показать нефильтрованное и вручную заменить посторонний сигнал (красный) с базовой сигнала. Расширенный вид иллюстрирует шип до (в середине) и после (ниже) шип (красный) был заменен сигнала линии. B) коррекции для дрейфа базовой линии. В начале записи, выберите небольшой сегмент исходного и установить его в качестве текущего нулевого уровня для всей записи (фиолетовая линия). Правильный базовый дрейф выбрав небольшую часть дрейфовал базовый (стрелка) и добавления базового узла (фиолетовый круг). C) более длительных периодов записи с шумной базовой линии (красный), которые трудно исправить могут быть удалены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное рисунке.

Рисунок 5. Идеализация данных. A) Текущие следы (черный) были записаны с одного GluN1/GluN2A рецептора, проходящей только ионы натрия с техникой патч-зажим клеток-прилагается. Идеализированные точки данных (красный) проиллюстрированы на 30 сек одном сегменте с канала. Эти перекрываются хорошо, указывая, что идеализация является точной. B) Гистограмма амплитуды тока иллюстрируют распределение, которое хорошо описывается только двух гауссовых функций с пиками при нуле (0,02 ± 0,8 Па), что свидетельствует о закрытых каналов событий и на 10,3 ± 1,3 пА свидетельствует о только одного типа открытых мероприятий каналов для всей продолжительности записи (130 мин). C) Не работает (слева) и открытым (справа) Выдержка времени гистограмм для всей записи, показанной в (А). Вероятфункция плотности ность для гистограмм (толстые линии) и индивидуальные кинетические компоненты (тонкие линии) накладываются и были рассчитаны путем подгонки данных в модели, содержащей пять закрытых государств и три открытых государства. Вставки обеспечивают постоянную времени (τ) и относительной площади (А) для каждого из отдельных кинетических компонентов.

Рисунок 6. Токи кальция через отдельных рецепторов NMDA. A) Текущие следы (черный) были записаны с одного GluN1/GluN2A рецептора передавая только ионы кальция с техникой патч-зажим клеток-прилагается. Идеализированные точки данных (красные) проиллюстрированы на 30 сегмента с. Б) Гистограмма амплитуд токов иллюстрируют распределение, которое хорошо описывается тремя гауссовых функций с пиками в нуле (0 ± 0,3 мкА), что свидетельствует о завершениисобытия г каналов, 1,3 ± 0,4 мкА свидетельствует о открытых мероприятий каналов к подуровня проводимости, и 2,1 ± 0,3, свидетельствует о открытых мероприятий канала на уровень главного проводимости. C) Не работает (слева), основной уровень проводимости в открытом состоянии (в центре) и подуровень проводимость в открытом состоянии (справа) Выдержка времени гистограмм для всей записи, показанной в (А). Функция плотности вероятности для гистограмм (толстые линии) и индивидуальные кинетические компоненты (тонкие линии) накладываются и были рассчитаны путем подгонки данных в модели, содержащей пять закрытых государств, два основных уровня проводимости открытые государства и один подуровень проводимости открытое состояние. Вставки обеспечивают постоянную времени (τ) и относительной площади (А) для каждого из отдельных кинетических компонентов.

Рисунок 7. Сотовый прилагается одной записи каналаот mPIEZO1 выражается в НЕК293. Активность вызванное применением -20 мм рт.ст. давление с устройством HSPC через патч-пипетки, в течение постоянного применения напряжения (80 мВ). Красный пунктир указывает текущий уровень нулевой.

Рисунок 8. Cell присоединены одна запись канала из нативных каналов. Пипетки была прикреплена на сомы нейрона, который был отделены от префронтальной коры крысы эмбриона и поддерживали в культуре в течение 5 дней (А) или 27 дней (В) . Непрерывная активность рецептора NMDA был записан с помощью пипетки растворов, содержащих глутамат (1 мм) и глицин (0.1 мм), а также CNQX (20 мкм) и бикукуллин (10 мкМ), чтобы ингибировать родные АМРА и ГАМК-рецепторов соответственно. Активность была получена путем применения 100 мВ твозь записи пипетки. Красный пунктир указывает текущий уровень нулевой.

Discussion

В области ионных каналов, важной областью исследований посвящена пониманию последовательность событий, которая приводит к каналу открытие или механизм стробирования канала. Для большинства каналов, этот процесс является сложным и включает в себя несколько кинетических шаги, которые не могут быть выведены из макроскопической многоканального сигнала. Напротив, эксперименты могут быть разработаны, где соблюдая последовательность открытый / закрытый событий в одной записи канала может произвести более детальную информацию о стробирования механизмы. В способах, описанных здесь, внешне расположенный лиганд-связывающий домен обладает рецепторов NMDA позволяет минимально инвазивные патч-зажим записи должна быть выполнена при постоянных условиях. Этот протокол может должны быть адаптированы для того, чтобы быть пригодным для исследования другим лигандом ионные каналы в зависимости от обоих лигандов рецепторов и свойствами.

Отчеты деятельности одноканальном предоставляют два типа ценной информации. Во-первых,потому что амплитуда унитарное ток может быть измерена непосредственно, эксперименты могут быть разработаны, чтобы получить информацию о свойствах пор, таких как канал проводимости, проницаемости и селективности. Во-вторых, поскольку длительность открытых и закрытых событий можно также измерить непосредственно из записи, эксперименты могут быть разработаны, чтобы получить информацию о кинетической стробирования и, таким образом, сделать выводы о операционного механизма канала. Для обоих типов экспериментов, смысл статистический анализ требуется биннинга каждой отдельной точки от текущей трассы к определенному классу проводимости. Представленные здесь был одним из таких способов сделать это, с помощью сегментные К-средние (SKM) ¹¹ алгоритм, однако, это может быть достигнуто несколькими более или менее сложных алгоритмов в том числе наполовину порог, SCAN ^12, Baum-Welch, Витерби, и т.д.

Записи с использованием конфигурации клеток подключением являются мощным в том, что ионные каналы сохранились в биологическихмембран с невозмущенной внутриклеточных кругах. Из-за этого, очень важно, чтобы мембрана уплотнения адекватно формируется и сохраняется на протяжении записи для двух целей: 1) экспериментальный непрерывности и 2) поддержание благоприятного сигнал-шум (от пика до пика базовой шум <2 Па). Размер и форма наконечника пипетки генерируемого определяет вероятность успешного мембраны печать, содержащую только один канал. Плоский наконечник гарантирует, что при приближении к пипетка ячейку она будет касаться и нажмите на клеточной мембране со всей поверхностью наконечника сразу, помогая, чтобы запечатать равномерно на клетку. Пипетки с наконечником, который является слишком широким, менее вероятно, приведет к одноканальных патчей; в отличие от этого, при потянув пипетку с наконечником, который является слишком узким приведет к омега-образной петли мембраны, которые могут герметизировать у основания и засорить пипетки ^10.

Благоприятный отношение сигнала к шуму можно управлять путем минимизации источников электрическойшум. Функция охлаждения headstage на Axopatch 200B позволило оптимальным разрешением сигнала; Однако шум все еще могут быть получены любым из приборов, участвующих в электрофизиологических установки, а также внешних источников, таких как свет и неродственных электроники. К счастью, несколько стратегий могут быть реализованы, чтобы минимизировать шум до желаемого уровня ^{2, 27.} Вкратце, убедитесь, что элементы оборудования, которые способны производить шум заземлены в одной точке в пределах установки. Делая это, важно, чтобы предотвратить образование контуров заземления, который вызовет значительный шум. Кроме того, если 60 шума цикл присутствует, обязательно выключите флуоресцентный свет, что может быть помехи для сигнала записи. Наконец, поставив клетку Фарадея вокруг устройства записи предотвратит близлежащие препятствия от причинения электрический шум.

Наблюдение один канал в течение длительного периода времени показал, что стробированиеконформационные изменения могут происходить в широком диапазоне временных шкал. Временно, данные патч-зажим ограничены в "короткой" конца по ширине полосы усилителем и скорости, с которой усиленный сигнал в цифровую форму и в "длинных" конец у окна наблюдения. Для конформационных изменений, которые быстрее, чем нижний предел, патч-зажим записи могут только предоставить информацию в сочетании с дополнительными экспериментальных подходов. Для конформационных изменений, которые происходят с очень низкой скоростью и, таким образом отбираются нечасто, можно увеличить количество наблюдений или увеличить продолжительность записи, однако, это не всегда возможно.

Несмотря на эти ограничения, данные патч-зажим, особенно когда полученные из отдельного канала, часто содержат больше информации, чем сразу извлекаемые с текущими вычислительных методик. Таким образом, ожидается, что в будущем рост вычислительной мощности и в Софаistication алгоритмов анализа сделает возможными дополнительные приложения. По появлением таких достижений, можно предвидеть, что патч-зажим записи с одного каналов могут происходить параллельно с измерениями FRET, визуализации кальция или даже в естественных препаратов предоставить дополнительную информацию о структуре, функции и динамики ионных каналов в оба родные и контролируемые среды.

Как разнообразие ионных каналов исследованы увеличивается, детальное понимание механизмов их стробирования и в конечном итоге понять, как их работа способствует их уникальных биологических функций выиграют от одиночных наблюдений молекулы. В частности, данные, полученные с одноканальной патч-зажим обещание информировать о унитарных свойств проводимости и вентильных последовательностей рекомбинантных и отечественных каналов.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1x51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1