Summary
여기에 설명하는 세포 부착 된 패치 클램프 기술로 하나의 이온 채널에서 현재 기록의 장기 복역을 얻기위한 절차입니다. 이 방법은 실시간으로 관찰을 허용, 생물학적 신호를 기초 개폐 채널 입체 형태의 패턴. 이 데이터는 그대로 생체막의 채널 특성에 대해 알려 드리겠습니다.
Abstract
이온 채널 단백질은 생물의 세포막에 걸쳐 빠른 통신을위한 보편적 인 장치입니다. 그들이 생성하는 이온 플럭스의 시간 서명은 각 채널 단백질뿐 아니라 생성하고 제어하는 메커니즘에 대한 고유 특성에 따라 현재 연구의 중요한 영역을 나타냅니다. 이온 채널 단백질의 동역학 연산에 대한 정보는 단일 분자에 의해 생성 된 전류의 긴 뻗기를 관찰함으로써 수득 될 수있다. 리간드 게이트 이온 채널, NMDA 수용체에 대한 하나의 채널 세포 부착 된 패치 클램프 현재 녹음을 얻기위한 프로토콜이 여기에 설명, 대뇌 피질의 신경 세포 HEK293 세포 또는 기본적으로 발현 된. 또한 메카에 민감한 채널 PIEZO1의 예를 제시하여 관심의 다른 이온 채널에 방법을 적용하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 이 방법은 채널의 전도도 특성 및 OPE의 시간적 순서에 관한 데이터를 제공 할 수 있습니다따라서 건강과 질병에서의 기능을 이해하는 데 도움이 채널의 활성화 메커니즘을 구성하는 N-폐쇄 입체 형태.
Introduction
생체막 걸쳐 패스트 통신은 일반적으로 채널로 지칭 올리고머 기공 형성하는 막 단백질에 거의 전적으로 의존한다. 이 단백질은 활성화 신호 게이팅 메커니즘 및 전도성 속성에서 크게 다르다. 그 구멍 이온에 선택적인 채널 단백질은 이온 채널로 분류됩니다; 그들의 활성화를 막을 가로 질러 이온 전류를 생성하고, 그 응답은 전기 생리 기법을 사용하여 실시간으로 높은 해상도로 기록 될 수있다. 활성화 신호는 농도 기울기, 기계적 및 전기적 힘 및 온도를 포함하여 화학적 및 물리적 입력의 광범위한 어레이에 걸쳐; 따라서, 추가 리간드에 이온 채널을 분류하면, 게이트 mechanosensitive, 전압 게이트, 또는 열에 민감한 타입. 이 글에서, 프로토콜은 패치 클램프 기술을 사용하여, 리간드 게이트 채널, NMDA 수용체 및 mechanosensitive 채널, PIEZO1에서 1 채널 활동을 기록 할 수 있도록 서술되어있다.0;
패치 클램프 전기 생리학 단일 분자 1, 2의 관찰을 허용하도록 충분히 민감한 첫 번째이자 가장 널리 사용되는 실험 방법이다. 이 절묘한 감도 이외에, 그것은 크게 전기 생리 기록 의무 생물학적 제제를 확장하고 또한 양막에있는 이온 채널의 관찰을 허용했다. 클램핑 전압 및 전류의 기록이 모두 동일 전극으로 수행되기 때문에 먼저, 그것은 작은 세포 또는 세포막 패치 걸쳐 신호를 기록하는데 사용될 수있다. 이 기술은 이온 채널이 개구리의 근육, 장어 electroplaques, 또는 오징어 거대한 축삭 3, 4, 오히려 그들이 횡단 신호 전달 메커니즘의 유비쿼터스기구를 대표하고 단방향 또는 모든 세포막 유형에 본질적인 것으로의 흥분 막에 제한되지 않는 것으로 나타났다 다세포 생물, 또한 세포 세포막에. 수입antly, 단순히 그대로 셀에 유리 피펫을 부착하여 횡단 전류를 기록 할 수있는 기능은 기본 파쇄되지 않은 세포막에있는 이온 채널에서 활동을 기록 할 수있는 전례없는 기회를 제공했다. 따라서,이 프로토콜에서 설명하는 세포 부착 패치 - 클램프 기술은, 최소한 수십 또는 네이티브 환경 이상 연속 이온 채널의 활성을 모니터링 허용한다.
보통 열 변동에 따라, 이온 채널 단백질을 포함한 모든 단백질은, 사이드 체인의 움직임과 전체의 재배치로 표현 훨씬 느린, 덜 자주 변경에 의한 가능성이 가장 높은 표현하는 가장 빠르고 가장 빈번하게 재 배열로, 다양한 시간 규모에 구조적인 변화를 겪을 도메인이나 서브 유닛, 또는 포스트 번역 상 수정 또는 단백질 - 단백질 상호 작용 (5, 6)에 의해 일부의 경우. 하나의 분자에 의해 생성 된 활동의 긴 기간을 준수하면 기능을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다tional의 본래 생리 세포막에있는 이온 채널의 역학은 관찰 된 분자의 작동 메커니즘에 대한 중요한 정보를 제공합니다.
세포 유형 및 발달 단계에 걸쳐 이온 채널, 네이티브 세포막 이온 채널의 분자 조성에 대한 지식의 다양성 증가 이해와 대조적으로 여전히 제한된다. 모든 이온 채널은 다중 체 단백질 및 네이티브 이온 채널의 대부분은 종종 다양한 컨덕턴스 및 게이팅 특성이 수반되는 다양한 분자 다양성의 단백질을 생산하는 여러 종류의 서브 유닛에서 조립한다. 이 때문에, 정의 분자 조성물의 이온 채널은 이종 시스템에서 발현에 다룬다. 특히, 불멸의 인간 배아 신장 세포 (7)의 클론 라인입니다 HEK293 세포는 재조합 이온 채널의 이종 식에 대한 선호 시스템으로 광범위한 수용을 얻었다. 남자 중이온 채널 전기 생리학에 대한 선택 시스템으로 HEK293 세포를 상승 Y 장점은 간편하고 배양 능력이며, 수명이 긴 안정 문화를 유지, 번역 후 폴딩, 가공, 포유 동물 단백질의 거래를 수행 할 수있는 능력, 그리고 많은 경우에 그들의 낮은 수준 또는 그 7, 8 채널의 내인성 표현의도 부재. 재조합 이온 채널을 표현하고 HEK293 세포에서의 기능적 특성을 연구하는 구조 기능의 이온 채널의 특성뿐만 아니라 이온 채널 이소 및 기본 조직에서 자신의 역할의 특정 속성에 대한 정보를 얻을 수있는 유용한 방법이 될 것을 계속한다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 HEK293 세포에서 발현 된 재조합 이온 채널 및 네이티브 이온 채널에 동일하게 잘 적용될 수있다.
요약하면, 전례없는 능력을 통해 패치 클램프 기술은 신호를 해결하기 위해한 분자에서의 날짜에, 단일 분자의 거동을 관찰하기위한 가장 직접적인 방법 남아있다. 그 셀에 연결된 모드에서 패치 클램프 기록을 한 분자에 대해 수행 될 때, 이온 채널의 동작에 뛰어난 통찰력을 제공 할 수있는, 긴 관측주기를 허용한다. 아래는 하나의 이온 채널 단백질을 함유하는 세포 부착 패치로부터 고해상도 현재 녹화를 얻기위한 프로토콜을 제시한다.
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Protocol
1. 세포 배양 및 단백질 발현
- HEK293 세포를 10 % 태아 소 혈청 (FBS)이 보충 된 DMEM에서 단층 배양에서, ATCC에 의해 수행 통로를 포함 통로 (22)와 (40) 사이 (ATCC 번호 CRL-1573) 및 5 % CO 2에서 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 혼합물을 유지 37 ° C. 실험 사이에, 10 ㎖의 최종 부피의 5 ~ 20 배 희석에서 T25 플라스크에 통과 세포. 참고 :이 구절 동안 세포를 사용하여 최적의 인감 형성 및 패치 안정성을 위해 수 유리한 세포의 건강을 보장합니다.
- 형질의 경우, 접시 당 세포 현탁액에 ~ 0.5 ~ 0.6 ㎖에 해당 ~ 10 5 세포 / 요리의 밀도, 직경 35 ㎜ 요리 HEK293 세포를 플레이트와 18 ~ 24 시간 동안 2 ㎖ 배지에서 세포를 성장.
- 멸균 된 1.5 ㎖의 원심 분리 관에서, (이 순서대로)를 추가하여 네 개의 35mm 요리의 형질 전환 혼합물을 제조 : 각각의 cDNA (GluN1, GluN2A 및 GFP)의 (1) 1 μg을; (2) 315 μL의증류수 (DDH 2 O); (2 - 히드 록시 에틸) -1 - 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES), 침전물을 형성하기 위해 사용된다 현명한 2.5 M 염화칼슘 드롭, (4) 35 μL - (3) 350 42 mM의 4 μL.
- 소용돌이 5 초 동안 튜브 4 개의 35mm 요리의 각 형질 현탁액 175 μl를 추가 현재 50 ~ 60 %의 합류에 세포를 포함하고 2 시간 동안 37 ° C에서 세포를 품어 전날, 도금했다.
- 형질 매체 대기음은 PBS로 세척 및 NMDA 수용체가 흥분 독성 9 매개 방지하기 위해 2 mM의 MgCl2를 보충 성장 배지 2 ㎖로 대체합니다. 주 : 세포는 전기 생리 레코딩 24-48 시간 포스트 형질 감염을 위해 사용될 수있다.
2. 전극의 제조
- 수직 풀러와 붕규산 유리 튜브를 잡아 당겨 2 대칭 기록 피펫을 생성합니다. 얻어진 팁의 크기와 형상, 상기 형상 피펫에 근거폴리 셔를 사용하여. 참고 : 팁 크기 외형과 전기적으로 평가 될 수있다. 시각적 외경 1.4-5.6 μm의 범위에 있어야한다. 전기, 최적의 크기 팁, 세포 외 용액으로 가득 할 때, (그림 2B 참조) 12 ~ 24 MΩ 범위에서 저항을 생산한다.
- 세포 부착 실험을 위해 최대 채널 활동과 높은 전류 진폭을 생성합니다 세포 외 환경을 나타내는 피펫 솔루션을 사용합니다. 참고 : NMDA 수용체의 경우, 이는 효능 (글루타민산, 글리신), 가의 양이온 억제제 및 차단제를 킬레이트 1 mM의 EDTA의 포화 농도를 함유하는 용액에 대응하고, 구두창 투과 이온 (나트륨의 생리적 농도 (150 mm)를 가지고 mm 단위 : 1 글루타민산, 글리신 0.1, 150의 NaCl, 2.5 KCl을, 1 N NaOH로 pH를 8.0에서 버퍼 1 EDTA, 10 HEPBS).
3. 세포 부착 된 패치 클램프 녹음
- 오픈 QUB 데이터 취득 softwa 사용(www.qub.buffalo.edu)을 다시, 그리고 '레이아웃'에서 획득 창을 선택합니다. 라는 제목의 드롭 다운 메뉴에서 '파일'에서 '새 데이터'를 클릭하여 새 QUB 데이터 파일 (QDF)를 열고 다음과 같은 초기 매개 변수 입력 : 샘플링 속도, 40 kHz의를; A / D 스케일링, 3000; 출력 채널, 1; 및 A / D 데이터 크기, 2., 데이터 파일을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 속성을 선택하고 '데이터'탭을 클릭하여 0.1 V / 펜실바니아에 진폭 배율을 조정합니다. 참고 : 이러한 매개 변수는 세포 부착 된 모드에서 모델 셀을 사용하여 각 설정에 정제 할 수있다. QUB 소프트웨어와 QDF 특성을 가진 데이터 수집에 대한 추가 명령은 www.qub.buffalo.edu에서 온라인입니다.
- 발현 세포 이온 채널을 함유 35mm 접시를 선택하고, 칼슘 및 마그네슘을 함유하는 2 ㎖의 PBS와 함께 성장 배지를 교체; 현미경 무대에 접시를 탑재하고 세포가 건강하고 잘 접시에 부착 된 것을 평가하기 위해 위상차 현미경을 사용하여 세포 분야에 초점을단일 층 패션 (그림 1A)에서. 형질 전환 (그림 1B) 성공했는지 확인하기 위해 형광 검출로 전환합니다. 참고 : 형광 농도의 범위가 단백질 발현의 조질 척도로서 사용될 수있다.
- 단일 채널 녹음의 경우, 10 배에 앰프의 출력 게인 = 1 β에 패치 구성, 10 kHz의 아날로그 필터,-클램프 전압 모드를 설정 +100 MV에 전압을인가. OFF 위치에서의 전압 유지 명령으로, '씰 테스트'버튼을 선택합니다.
- 형광 및 셀 상태에 기초하여, 패치 할 셀을 선택한다. 셀이 아니라 접시에 부착되는 위상차에 따라 검증, 패치 노출 세포 표면의 넓은 부분을 가지고 있으며, 그렇지 않으면 건강한 보인다. 참고 : 접근과 패치 클램핑 동안 셀을 표백 피하기 위해 위상 콘트라스트 조명을 유지한다.
- 그것은 electrod에 닿을 수 있도록 충분히 솔루션을 갓 광택 피펫을 기입전자 가볍게 흔들어 팁에 갇혀 될 수 있습니다 공기 방울을 제거 할 수 있습니다. 피펫 홀더의 밀봉 나사를 체결하고 실버 와이어는 피펫 용액에 침지되어 있는지 확인하여 증폭기 headstage에 기록 피펫을 고정합니다.
- 튜브로 피펫 홀더에 연결되는 작은 (5 CC) 플라스틱 주사기를 사용하여 부드럽게 (도 2A)를 입력하고 접근하는 동안 팁 막힘 불순물을 방지하기 위해 양압을 적용한다.
- 미세 조작기를 사용하여 욕조에 피펫을 지시하고 전기 회로를 폐쇄 (그림 1C)을 패치에 대해 선택한 셀 위에 직접 위치. 앰프의 인감 테스트 신호 (그림 2B)에 해당하는 구형 파형을 표시해야하는 오실로스코프에주의하십시오. 참고 : 화장실에 진입하면, 최적의 범위 내에서 피펫 저항이 12 ~ 24 MΩ입니다. 5 MV 시험 신호에 대한, 측정 된 전류 R앤지는 ~ ~ 40 펜실바니아에 해당합니다.
- 오실로스코프에 전기적으로 현미경 피펫 저항을 통해 시각적으로 피펫의 위치를 모니터링하면서, 피펫 세포에 부드럽게 충돌 할 때까지 조금씩 접근을 계속하고, 테스트 신호는 저항 증가 (그림 2B)를 나타 내기 위해 약간 감소한다.
- , 시일을 형성 주사기를 들고 녹음 피펫의 끝으로 세포막을 구해 GΩ 저항 시일 (10)의 형성을 시작하는 주사기 플런저를 잡아 당겨 측면 튜브를 통해 약간의 부정적인 압력을 적용합니다. 씰 형성이 볼 만 용량 과도 (그림 2B)로, 그 완벽한 평탄화로 표시되는 오실로스코프에 테스트 신호의 파형에주의하십시오. 참고 : 신호가 완전히 평평하지 않거나 기준에 잡음이되면,이 물개의 주위에 상당한 누설 전류와 약실을 나타냅니다. 이것은 R을 방지 할하나의 채널 전류를 esolving. 이 경우, 셀로부터 피펫을 철회 멀리 조로부터, 헤드 단계에서 분리 해 버린다. 적절한 범위 (≥ 1 GΩ)에 씰을 획득 할 때까지 새로 연마 피펫 과정을 반복합니다.
- 앰프에서 '해제'에서 '도장 시험'에서 외부 명령 토글 스위치; ( '오프'로 이전에 설정 한) 양에 전압 유지 명령을 전환; 과 X100에 이득을 증가시킨다. 존재하는 경우, 이전에 평면 기준 (그림 2C) 광장에서 위쪽으로 편향으로 표시됩니다, 채널 활동에 대한 오실로스코프를 관찰합니다.
- 채널 활동이 오실로스코프에 표시되는 경우, '기록'버튼 뒤에 '플레이'버튼을 누르면, QUB에서 이전에 열린 디지털 파일로 데이터를 획득. 데이터 수집을 중단 QUB에서 정지 버튼을 눌러 쉽게 retriev을 QDF 파일을 저장하려면'파일'라는 제목의 드롭 다운 메뉴에서 '저장 데이터로를 ...'을 선택하여 컴퓨터 하드 드라이브의 수 없습니다.
4. 데이터 전처리 및 이상화
참고 : 중요 정보는 (가장 간단한 경우에, 폐쇄 또는 개방) 적절한 컨덕턴스 클래스에 각각의 데이터 포인트를 할당 통계 분석에 의해 단일 채널 녹음으로부터 추출 될 수있다. 이 프로세스는 데이터 이상화 및 분절 K 수단 (SKM) QUB있는 방법 (11)이 아래에 설명되어있는 데이터 이상화의 간단한 설명으로 언급된다.
- QUB의 데이터 파일을 열고, '레이아웃'에서 '사전'인터페이스에서 현재의 흔적을 볼 수 있습니다. 표시된 상자를 취소하여 (디지털 필터를 제거) 여과되지 않은 녹음 파일을 표시 '구단을.'
- 시각적으로 부정과 유물 (그림 4A)를 탐지하는 레코드를 검색합니다. 올바른 간단한 전류 스파이크 그 occuR 추적 내에서, 같은 전도성 클래스의 인접한 청정 지역을 선택이 지역을 강조, 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 선택하여 (그림 4A) '설정 지우기 버퍼를.' 각각의 샘플 포인트가 표시 될 때까지 스파이크 확대, 대체 할 수있는 지역을 선택 만이 지역을 강조하고 '삭제'를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 삭제합니다.
- 베이스 라인이 안정 레코드의 초기 부분을 선택하여 전체 레코드의 제로 전류 기준을 정의, 하이라이트, 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 '설정 기준'을 선택합니다. 정확하게 표시 가이드 라인 (그림 4B 보라색)의 기준 레벨을 나타내는 확인
- 원시 데이터의베이스 라인 설정 기준에서 눈에 띄게 벗어나는 레코드 점을 확인합니다. 일탈 영역 내에서 기준의 작은 부분을 선택하여이 문제를 해결, 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 '기본 노드를 추가'명령을 선택합니다.
- T의 영역을 식별그는 쉽게 (그림 4C) 해결할 수없는 과도한 소음이나 유물을 포함 녹음. 폐기 할 지역을 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 '삭제.' 참고 :이 경우 운동 정보가 손실됩니다 처리 된 기록이 단축되며 스플 라이스 시점 이후에 발생하는 지점은 프리 - 노이즈 영역과 연속으로 나타납니다.
- SKM 알고리즘 (11)를 이용하여 기록을 이상화하는 오픈 이벤트를 폐쇄 모두 포함하는 추적의 일부를 선택하고 아래의 'MOD'인터페이스 '을 입력 레이아웃.' "모델"패널에서 검은 사각형 (닫은 상태)를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 "잡아"를 선택, 파일 전체 기준의 대표적인 트레이스의 깨끗한 부분을 강조 표시합니다. 열린 전도를 강조 표시하여 채널의 오프닝을 위해 동일을 할, 바로 "모델"패널에서 빨간색 사각형을 클릭하고 "잡아"를 선택합니다.
- idealiza를 수행아래의 '파일'버튼을 선택하여 전체 레코드에 대한 기 '데이터 원본.' 분석을 위해 원하는 매개 변수가 올바른지 확인하고 다음을 클릭합니다 '모델링'섹션 아래의 '이상화'탭을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 '실행.' 이상화의 결과는, 전체 파일의 진폭 히스토그램과 함께 이상화의 육안 검사 (도 5)을 허용하는 데이터와 중첩된다. 주 : 부적절한 이상화는 QUB 채널의 오프닝 실제로 발생하지 않는 폐쇄를 감지하는 '거짓 사건'의 생성으로 이어질 수 있습니다. 증폭기의 아날로그 필터 및 샘플링 레이트에 의해 설정되어, 기록 해상도, 내 SKM 열고 닫히는 이벤트가 검출되는 해상도는 분석을위한 데드 타임을 설정하여 제어 할 수있다. 최적의 데드 타임이 시행 착오를 선택해야합니다 및 샘플링 속도에 따라 달라집니다,하지만, 엄지 손가락의 좋은 규칙은2-3 샘플 12 데드 타임 (dead time)을 선택합니다.
- 이상화 정확하게 원시 데이터를 나타낸다는 것을 확인하려면, 수동으로 이상화 추적을 검사합니다. 이상화의 오류를 식별하면, 거짓 이벤트를 통해 추적을 선택, 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 'IDL에 가입하세요.' 주 : 추가 옵션 및 QUB있는 다양한 명령 및 기능에 대한 자세한 설명은, QUB 설명서 온라인 (www.qub.buffalo.edu)를 참조하십시오.
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Representative Results
재조합 NMDA 수용체
NMDA 수용체 결합과 두 개의 공동 작용제의 수반하는 작업에 응답 글루타민산과 글리신. 그들은 GluN1 서브 유닛과 GluN2 서브 유닛을 바인딩 두 글루타민산 바인딩 두 글리신 heterotetramers로 조립합니다. GluN2 서브 유닛은 뇌에서 가장 널리 전사 형태의 청소년 동물 성인 GluN2B에 GluN2A 4 개의 유전자 (AD)에 의해 이들의 인코딩된다. 때문에 (도 1a) 서브 유닛 조성의 제어뿐만 아니라, 미세하게 연마 된 유리 피펫 (도 1C)를 사용하여 채널에서의 전류를 기록하는 기능을 허용 HEK293 세포 수용체를 발현하는 천연 제제에서 NMDA 수용체 아형의 다양성.
피펫 셀 닿아 일단 테스트 펄스 파형의 진폭의 감소는 클리어 시일을 형성 할 수있는 능력을 나타낸다 (도 2B)를 발생한다. 하나를 포함하는 적절한 실채널은 정의 전압 (도 2c)의인가시 잡음비 좋은 신호와, 기준선에서 하방으로 편향으로 표시 클리어 채널 활동을 생성한다. 두 작용제는 고농도로 존재하는 경우 야생형 재조합 NMDA 수용체에 대한 최대 채널 활동을 도모 할 수 있으며, 억제제 및 채널 차단제가 존재하는 경우. 패치는 하나 이상의 채널을 포함하는 경우, 동시 개구 즉시 명백하다 (13) (도 3b)이되도록, 이상적이다. 채널 오픈 확률이 알려진 14 개를 근사 할 수있는 경우 매우 낮은 활동 수준으로 단백질, 상위 개구의 스트레치가 단지 하나의 채널에서 발생한 확률을 산출 할 수있다. 이 때문에, 더 긴 관찰 기간이 필요할 수있다.
이러한 조건에서, 그리고 (-120 값의 대략 막 전위에 이르는) +100 측정 값의 피펫 보유 잠재력을 적용시ngle 재조합 GluN1/GluN2A 및 GluN1/GluN2B 하나 상대적으로 높은 전도성 레벨 (> 50 PS) (도 3a 및도 5B) 15-17 높은 확률 (P O를, 0.3 ~ 0.5)와 함께 열려 있습니다. 녹음 할 때, 현재의 노이즈 스파이크, 기준 감도, 또는 과도한 소음의 기간은 짧고 작은 경우 이러한 보정 될 수있다, 그러나 언급 한대로, (그림 4A-C)를 나타낼 수있다. 이 채널 활동이 채널 동작의 전체 너비가 캡처 것을 보장하기 위해 충분한 양의 시간 (≥ 10 분간, 10,000)에 대해 중단없이 기록되어 있다는 것은 중요하다.
그러한 기록으로부터 얻어지는 데이터는 채널 속도론 및 투과 특성 모두에서 정보를 제공 할 수있다. 여기, 우리는하지만 데이터 이상화는 같은 pClamp 같은 다른 소프트웨어 프로그램을 사용하여 수행 또는 12를 스캔 할 수있다, SKM 알고리즘 (그림 5A)를 사용하여 QUB 수행 이상화을 보여ND는 자신의 장점과 단점을 포함하는 각각의 옵션으로, 서로 다른 알고리즘이나 반 문턱 방법으로 기준을 사용하여 수행 될 수있다. 동역학 모델에 대한 이들 데이터의 적합은 이온 채널의 동작에 대한 통찰력을 얻기 위해 수행 될 수있다. 최우 피트는 각 프로그램에 의해 구현 된 알고리즘은 자신의 장점을 가지고있는, 그러한 QUB 같은 소프트웨어 또는 HJCFIT 18로 수행 될 수있다. 그림 5에서 보여 이상화는 이온 채널에 대한 완벽한 운동 모델을 피팅을 수행 할 수있는 하나의 닫힌 상태의 간단한 가능한 모델과 오픈 상태를 필요로하는 동안 일정한 기준에 도달 할 때까지 순차적으로 추가 폐쇄 및 개방 상태를 필요로합니다. 이 과정은 야생형 GluN1/GluN2A 수용체 다섯 역학적으로 별개의 닫힌 상태와 2-4 역학적으로 별개의 개방 상태 (그림 5C)를 가지고 19을 과시하고있는이게이팅 특성 시냅스 신호 (20), (21)을 매개 NMDA 수용체의 형상을 결정하는 중요하다. 분석이 스타일은 자신 만의 독특한 게이팅 메커니즘 22,23,24에 대한 통찰력을 얻기 위해, 같은 AMPA 수용체와 같은 작은 전도의 다른 이온 채널로 확장 할 수 있습니다. AMPA 수용체 QUB를 사용하여 성공적으로 이상화 추가 상태가 미리 만들어진 모델에 통합이 필요할 수 있습니다 여러 전도성 수준을 가지고 있기 때문에 한 가지주의 할 점은, 그러나,이다.
이러한 방법은 이온 투과 조성물 및 / 또는 농도를 변경하여 이온 채널 투과 컨덕턴스에 대한 정보를 얻기 위해 확장 될 수있다. 여기에 설명 된 방법을 사용하여 단일 GluN1/GluN2A 수용체를 통해 활성을 기록하지만, 기록 피펫의 75 mM의 염화칼슘과 150mM의 염화나트륨을 교체하면, (10 ~ PS) 전도도의 20 % ~과 전류를 산출한다. 이것은 보여줍니다 칼슘 안녕에 NMDA 수용체에 침투하면서생리적 조건에서의 GH 수준은, 실제로 투과 통로 내에 전위 칼슘 결합 부위가있을 수 있다는 것을 나타내는, 더 느리게 나트륨 이온보다 채널을 순회. 또한이 작은 컨덕턴스에도 불구하고, 기록은 적절 메인 전도 레벨의 전류 진폭 (도 6A 및 B)에 대한 50 %의 중간 준위 컨덕턴스의 존재를 공개하고, QUB에 SKM 알고리즘을 사용 이상화된다. 추가 컨덕턴스 클래스가 초기 동역학 모델에 포함될 때 이러한 준위 개구는, 그러나, 오직 QUB에서 이상화된다. 또한 운동 분석은 이러한 조건에서, 수용체는 여전히 그러나 이러한 상태는 채널은 나트륨 이온 (그림 6C)를 통과 할 때에 비해 매우 다른 시간 상수와 점유가 다섯 역학적으로 별개의 폐쇄 상태를 전시, 것으로 나타났다. 또한, 두 개의 열린 상태는 u에게 관찰개 nder 것을 보여주는 이러한 조건은, 채널 컨덕턴스에 영향을 미치는 이외에, 칼슘 이온 수용체 게이팅을 변조 할 수있다.
하나의 채널 만 패치를 획득하는 특정 방법이 없습니다. 대신, 몇 가지 실험 조작은 성공의 가능성을 증가에 기여할 수있다. 첫째, 형질 세포 (그림 1B)의 형광 강도를 평가하여 채널 표현의 낮은 수준을 목표로하고 있습니다. ; 형질 또는 GluN1이기 때문에, 필요한 서브 유닛에의 cDNA의 양을 감소하는 데 사용하는 cDNA의 총 양을 감소 : 성공적인 접근 방법 일 수 있습니다 DNA / 칼슘 포스페이트 침전물과 배양 시간을 단축하는 단계; 그리고 시야에서만 희미 형광 세포에 패치를 선택합니다. 얻어진 패치가 자주 여러 채널을 포함하는 경우 이러한 접근 방법을 추구해야한다. 또한, 피펫 팁의 크기를 감소시키는 것은 또한 덧대 어 깁기 Diy 오직 한 채널을 포착에 기여아. 궁극적으로하지만, 하나는 체계적으로 명확하게 하나 이상의 채널을 포함 패치에서 오랜 기간 동안 기록 자제하여 하나의 채널 패치를 얻는 성공이됩니다.
재조합 PIEZO1 채널
이 프로토콜에 기재된 방법으로 용이하게 임의의 리간드 문 이온 채널에 적용 할 수 있고, 실제로 화학, 전압, 힘, 온도, 또는 다른 수단에 의해 활성화 여부, 임의의 이온 채널로부터 하나의 채널 활동을 기록하도록 구성 될 수있다. 이 프로토콜은 다른 이온 채널로부터 하나의 채널 전류를 기록하도록 구성 될 수있는 방법의 한 예는, 구체적으로 마우스 PIEZO1, mechanosensitive 이온 채널은 (도 7) (25, 26) 아래에 제시된다.
NMDA 수용체 채널로, PIEZO1 및 GFP는 인산 칼슘 매개 형질 전환에 의해 HEK293 세포에서 발현되고 세포로 24-48 시간 포스트 형질을 사용하는1.2 절에 설명. PIEZO1이 막 스트레칭으로 활성화되어 있기 때문에 사용할 수 있어야합니다, 치료 패치 형성과 적용되는 기계적인 힘의 전달 및 제어를위한 적절한 장치를하는 동안 부드럽게 막을 조작주의해야한다. 이러한 조건은 2-3 MΩ의 범위에서 저항이 크고, 기록 피펫을 만들고 증폭기 headstage에 피펫 홀더를 통해 기록 피펫에 연결된 고속 압력 클램프 장치 (HSPC)을 사용함으로써 달성 될 수있다. 증폭기 설정 증폭기 수집 소프트웨어를 통해 제어 될 수 있도록 '외부'명령 노브에 스위칭 제외한 섹션 3.3에서 NMDA 수용체에 대해 기재된 것과 유사하다.
, PIEZO1에서 활동을 기록 (mm 단위)로 가득 찬 기록 피펫 사용하려면 130의 NaCl, 5 KCl을, 10 HEPES, 1 염화칼슘, 1 MgCl2를, 10 TEA로-C1, NaOH로 pH를 7.3. 이러한 조건에서, 개구 내가로 모니터링 할 수있다제로 전류 기준에서 아래쪽으로 편향으로 오실로스코프에 표시됩니다 nward 나트륨 전류,. 앰프 헤드 무대에 기록 피펫을 놓고 HSPC에 다이얼이 0에 있는지 확인합니다. 목욕을 시작하기 전에 긍정적 인 압력의 3-5 mmHg로 적용 할 수 있습니다. 미세 조작기를 사용하여, 욕조에 피펫을 낮출 원하는 피펫 저항을 확인하고 3.6 절에 설명 된대로 선택한 셀에 근접 피펫을 가져옵니다. 조심스럽게 현미경의지도하에 셀을 터치하고 NMDA 수용체 (3.7 절)에 대해 수행으로 오실로스코프를 모니터링하여, 유사한 방식으로 밀봉 시험 파형의 진폭에 약간의 감소를 관찰합니다. 신속 3-5 0 mmHg로에서 압력 유지 수준을 변경하여 피펫을 통해 적용 양의 압력을 풀어. 씰 테스트 파형을 모니터링하여 형성 GΩ 인감 기다립니다. 이 경우, 부압은 시일을 형성하기 위해 적용되지 않는다. 최적의 밀봉 및 보도를 취득하면# 8216;. 데이터를 수집 시작 QUB의 기록 '버튼을 7 패치 피펫에 압력 -20 mmHg로 적용하여 활성화 mPIEZO1 단일 채널 전류의 대표 흔적을 보여줍니다. 이 전류는 2 kHz에서 여과하고 20 kHz로 샘플링 된 저역 통과했다.
세포 외 리간드 결합 도메인과 리간드 게이트 채널과는 대조적으로, mechanosensitive 채널을 활성화 자극이 프로토콜에 따라 변경 될 수 있습니다. 첫째는 '갭이없는,'일정한 부압 전체 녹화 시간에 대한 패치에 적용이다. 이 프로토콜은 분에게 긴 기록을 얻기에 유용하고 막 무결성을 유지 작은 압력의 자극 (0-20 mmHg로), 가장 성공적이다. 막을 파열 가능성이 높은 압력에 의해 생성 된 활성은, 유용한 다양한 압력 펄스는 짧은 시간 기간들에 대한 패치에 적용 할 수있는 '에피소드'녹화 (<얻어진다강한> 그림 7). 리간드 게이트 채널로, 세포의 기록은 하나의 채널 패치가 전도 및 조사중인 채널의 게이트 속성을 모두에 대한 풍부한 정보를 제공 부착.
신경 세포의 NMDA 수용체
세포 부착 한 채널 녹음 여기 기재된 방법은 특정 세포 형 및 / 또는 개발 단계에 컨덕턴스 및 채널 게이팅 내생의 속성에 대한 정보를 얻기 위해 사용될 수있다. 많은 다른 이종 체 채널의 경우와 같이, 네이티브 NMDA 수용체의 정확한 분자 조성물은 알려져 있지 않다. 기본 준비에서 얻은 알려진 성분의 재조합 수용체에서 얻은 결과를 비교하여, 서브 유닛의 구성과 그 나라의 환경에서 채널의 기능을 공식화 또는 17을 테스트 할 수 있습니다에 대한 가설.
뉴런은 전두엽에서 분리되었다쥐 배아의 피질과 최대 육주 17 일 문화에서 성장. 섹션 2.2에서 재조합 NMDA 수용체 레코딩에 대해 기재된 성분 이외에, 피펫 솔루션은 각각 고유 AMPA 및 GABA 수용체를 억제하는 CNQX (20 μM) 및 bicuculline (10 μM)을 함유 하였다. 문화의 연령에 따라 기본 NMDA 수용체에서 얻은 기록은 아주 달랐다 속도론을 공개했다. 초기 (그림 8A, 체외에서 5 일간)에서의 녹음은 문화 더 자세히 말 (그림 (b), 관내에있는 27 일간) 문화가 더 밀접하게 GluN1/GluN2A 수용체에 대한 설명 역학과 유사 (그림은 3A에서 GluN1/GluN2B 수용체 및 녹음에 대한 설명 역학과 유사 및 5A). 이 관찰은 NMDA 수용체 발현 이소 형의 패턴과 엉덩이에있는 세포 부착 한 채널 패치에서 기록 전류의주의 특성화와 일치pocampal 문화 16.
그림 1. 세포 부착 기록하는 HEK293 세포를 선택.) 35mm 접시에서 배양 HEK293 세포는 현미경 스테이지에 배치하고 패널과 동일한 시야에서 40 배 확대. B) GFP의 형광의 위상 콘트라스트로 볼 수 있습니다 형질 전환 세포를 식별합니다. 화살표, GFP를 발현하는 세포를 나타냅니다 건강한 나타나고 기록 피펫는 시각적 인지도 아래 미동 조작을 사용하여 선택한 셀에 가까운 주변에 데려 피펫 액세스 할 수 있습니다. C)에 대한 의무 위치에 있습니다. 를 보려면 여기를 클릭하세요 이 그림의 더 큰 버전.
그림 2. 셀 씰 형성을 부착. A) 피펫 홀더의 측면에 연결된 작은 주사기 5 MV (0.5 kHz로)에 위치한 인 증폭기 테스트에 응답 욕 용액에 침지 피펫 통하여 피펫. B) 흐르는 전류 사이의 압력의 수동 제어를 허용 18 PA, 28 MΩ의 피펫의 크기에 해당합니다. 셀 (왼쪽 화살표) 증가 피펫 저항을 나타내는 관찰 현재 감소의 수준에 접촉시. 피펫 (오른쪽 화살표)를 통해 부압을인가하는 시일 형성을 개시하고. C) 테스트 펄스 결석에만 용량 과도 테스트 펄스에 의해 생성 된 신호를 감소시키고, 어떠한 전압 (0 V), 기준선 피펫을 통해인가되지 않으면 (화살표 왼쪽) 안정되어있다. 양의 전압 (화살표, +100 MV) 홍보를 적용 채널 개구를 나타내는 확률 단일 전류를 oduces. 빨간 점선은 제로 전류 기준을 나타냅니다.
. 그림 3 GluN1/GluN2A 수용체에서 기록 된 세포 부착 전류 A) 1 채널 패치 :.. 연속 기록 50 초 세그먼트는 하나의 균일 한 진폭 B에 채널 개구를 보여줍니다) 다중 채널 패치 : 연속 녹화의 50 초 세그먼트 패치가 적어도 2 활성 채널이 포함되어 있음을 나타내는 두 개의 진폭 레벨 채널 개구를 보여줍니다. 빨간 점선은 제로 전류 기준을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
노이즈 스파이크 그림 4. 데이터 처리.) 수정. 수동으로 데이터를 표시 필터링되지 않은 및 기준 신호와 외부 신호 (적색)를 대체합니다. 확장 된 뷰 (가운데) 전에 (아래) 후 스파이크를 보여 스파이크 (빨간색)은베이스 라인 드리프트 기준 신호. B) 수정으로 대체되었다. 초기 기록에서,베이스 라인의 작은 세그먼트를 선택하고 전체 레코드 (퍼플 라인)의 제로 전류 레벨로 설정합니다. 의 작은 부분을 선택하여 올바른 기준 드리프트 기준 (화살표)를 표류하고 기본 노드 (자주색 원) 삭제 될 수 있습니다 해결하기 어려운 소음 기준 (빨간색)와 기록. C) 긴 기간을 추가. 보려면 여기를 클릭하세요 이 그림의 확대.
그림 5. 데이터 이상화.) 현재 트레이스 (블랙)는 세포 부착 된 패치 클램프 기술 만 나트륨 이온을 통과 한 GluN1/GluN2A 수용체에서 기록되었다. 이상적인 데이터 포인트 (빨간색)은 30 초 하나의 채널 세그먼트에 대한 설명된다. 다음은 이상화가 정확하다는 것을 나타내는 잘 겹칩니다. B) 현재의 진폭의 히스토그램이 잘 제로에서 피크가 두 가우스 함수 (0.02 ± 0.8 PA), 닫힌 채널 이벤트를 나타내는 및 10.3 ± 1.3에 의해 설명 분포를 보여 전체 녹화 시간 (130 분) 오픈 채널 이벤트의 한 종류. C 나타내는 펜실베이니아) 폐쇄 (왼쪽)과 개방 (오른쪽) (A)에 도시 전체 녹화 시간 히스토그램을 거. 발생 가능성히스토그램 (굵은 선)과 개별 운동 성분 (가는 선)를위한 ITY 밀도 함수가 중첩되어 오 닫힌 상태와 열린 상태를 세 함유 모델에 데이터를 피팅함으로써 계산 하였다. 인 세트는 시간 상수 (τ)와 개별 구성 요소의 각 운동에 대한 상대적인 영역 (a)를 제공한다.
하나의 NMDA 수용체.) 현재 트레이스 (검정)를 통해 그림 6. 칼슘 전류는 세포 부착 된 패치 클램프 기술 만 칼슘 이온을 통과 한 GluN1/GluN2A 수용체에서 기록되었다. 현재 진폭의 이상적인 데이터 포인트 (빨간색)가 30 초 세그먼트에 대해 설명된다. B) 히스토그램은 물론, (0 ± 0.3 PA) 0에서 피크 세 가우스 함수 주변을 나타내는 설명 분포를 보여D 채널 이벤트, 1.3 ± 0.4 펜실바니아 하위 수준 전도성 오픈 채널 이벤트를 나타내는, 2.1 ± 0.3 주 전도성 수준으로 개방 채널 이벤트 나타낸다. C) 폐쇄 (왼쪽), 주요 전도성 수준의 개방 상태 (가운데) 및 하위 수준 전도성 열린 상태 (오른쪽) (A)에 도시 전체 녹화 시간 히스토그램을 거. 히스토그램 (굵은 선)과 개별 운동 성분 (가는 선)에 대한 확률 밀도 함수가 중첩되어 오 닫힌 상태, 두 가지 주요 컨덕턴스 레벨 열린 상태와 한 준위 컨덕턴스 개방 상태를 포함하는 모델에 데이터를 피팅함으로써 계산 하였다. 인 세트는 시간 상수 (τ)와 개별 구성 요소의 각 운동에 대한 상대적인 영역 (a)를 제공한다.
그림 7. 셀은 하나의 채널 녹화를 부착mPIEZO1는 HEK293 세포에서 발현부터. 활성은 전압의 일정한 애플리케이션 (+80 MV) 중에 패치 피펫을 통해 HSPC 장치 -20 mmHg로 압력을인가함으로써 유도된다. 빨간 점선은 제로 현재 수준을 나타냅니다.
그림 8. 셀 기본 채널에서 하나의 채널 녹음을 첨부. 피펫이 5 일 (A) 27 일 (B)의 쥐 배아의 전두엽 피질에서 해리하고, 문화를 유지 신경 세포의 세포체에 부착 된 . 연속 NMDA 수용체의 활성은 각각 고유 AMPA 및 GABA 수용체를 억제하는 글루타민산 염 (1 ㎜)과 글리신 (0.1 ㎜), 또한 CNQX (20 μM) 및 bicuculline (10 μM)를 포함 피펫 솔루션을 기록했다. 활동 +100 MV t을 적용하여 유도 하였다기록 피펫의 hrough. 빨간 점선은 제로 현재 수준을 나타냅니다.
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Discussion
이온 채널 필드에 연구의 중요한 영역을 열거 나 채널의 게이트 메커니즘을 채널로 연결 이벤트의 순서를 이해하기 위해 최선을 다하고 있습니다. 대부분 채널의 경우,이 프로세스는 복잡하고, 거시적 멀티 채널 신호로부터 도출 될 수없는 여러 운동 단계를 포함한다. 대조적으로, 실험은 단일 채널 레코드의 개방 / 폐쇄 이벤트의 시퀀스를 관찰하는 게이팅 메커니즘에 대한 더 상세한 정보를 생성 할 수있는 설계 될 수있다. 최소 침습 패치 클램프 녹음이 일정 조건에서 수행 될 수 있도록 여기에 설명 된 방법에서, NMDA 수용체에 의해 소유 외부에있는 리간드 결합 도메인이 있습니다. 이 프로토콜은 리간드와 수용체의 속성을 모두에 따라 다른 리간드 게이트 이온 채널을 연구에 적합하기 위해 적응해야 할 수도 있습니다.
단일 채널 활동 기록은 가치있는 두 가지 유형의 정보를 제공한다. 첫째,단일 전류 진폭을 직접 측정 할 수 있으므로, 실험은 채널 컨덕턴스, 투과도 및 선택과 같은 세공 속성에 대한 정보를 얻기 위해 설계 될 수있다. 개방 및 폐쇄 이벤트의 지속 기간은 또한 레코드에서 직접 측정 할 수 있기 때문에 둘째, 실험은 게이팅에 대해 운동 정보를 얻을 수 있으며, 따라서, 채널의 작동 메카니즘을 추론하기 위해 설계 될 수있다. 실험의 두 가지 유형, 의미있는 통계 분석은 특정 전도성 클래스에 현재 추적에서 각각의 점을 비닝이 필요합니다. 분절 K-수단 (SKM) 11 알고리즘을 사용하여이 작업을 수행하는 하나의 방법이었다 여기에 제시하지만,이 반 임계 값, 12 스캔 등 여러 가지 더 또는 덜 복잡한 알고리즘에 의해 달성 될 수있다, 바움 - 웰치, 비터, 등등
세포 부착 된 구성을 사용하여 녹음이 그 이온 채널의 강력한 생물학적 보존된다교란 세포 milieus으로 막. 1) 실험 연속성 및 2)) 기준선 잡음 <2 펜실바니아과 피크 유리한 신호 대 잡음비 (피크 유지 :이 때문에 막 밀봉이 충분히 형성 및 기록 걸쳐 보존이 목적으로 중요하다. 생성 된 피펫 팁의 크기와 형상은 정확히 하나의 채널을 포함하는 성공적인 막 시일의 확률을 결정한다. 평평한 팁 피펫 셀 접근 때 셀에 균일하게 밀봉하도록 돕고, 한번에 전체 팁 표면과 세포막에 터치 키 것이라는 점을 보증한다. 너무 넓 팁 피펫 1 채널 패치가 발생할 가능성이 적습니다 것이다; 반면에, 너무 좁 팁 피펫을 당기에 바닥에 밀봉 피펫 (10)을 방해 할 수있는 오메가 모양의 막 루프가 발생합니다.
잡음비 양호한 전기 신호의 소스를 최소화하여 관리 할 수있다소음. Axopatch 200B의 headstage 냉각 기능은 최적의 신호 확인을 위해 사용할 수있다; 그러나 잡음이 여전히 전기 생리학에 관련된 장비의 설정뿐만 아니라, 빛과 관련이없는 전자 제품과 같은 외부 소스에서 생성 할 수 있습니다. 다행히도, 몇 가지 전략은 원하는 수준 2 (27)에 노이즈를 최소화하도록 구현 될 수있다. 간단히, 소음을 생산 할 수있는 장비의 조각이 설정 내에서 하나의 점에 접지되어 있는지 확인하십시오. 이렇게하면, 상당한 노이즈를 발생할 접지 루프의 형성을 방지하는 것이 중요하다. 60주기 소음이있는 경우 또한, 기록 신호를 방해 할 수있는 모든 불을 끄십시오. 마지막으로, 기록 장치의 주위 패러데이 케이지를 배치하면 전기 노이즈를 일으키는 부근 방해물을 방지 할 것이다.
오랜 기간 동안 하나의 채널을 관찰하면 그 게이팅을 보여 주었다구조적 변화는 시간 규모의 넓은 범위에 걸쳐 발생할 수 있습니다. 시간적으로, 패치 - 클램프 데이터는 증폭기의 대역폭 및 증폭 된 신호가 디지털화되고 관찰 창에 의해 '긴'끝에되는 속도에 의해 누전 '단부에 제한된다. 보완 실험 방법과 함께 사용할 경우 낮은 한계보다 더 빨리 구조적 변경, 패치 클램프 녹음은 정보를 제공 할 수 있습니다. 따라서 매우 느린 속도로 발생하고, 형태 적 변화가 자주 샘플링의 경우, 하나의 관측의 개수를 증가 또는 레코드의 지속 기간을 증가시킬 수 있지만, 이것이 항상 가능하지 않을 수도있다.
이러한 한계에도 불구하고, 개별 채널에서 얻은 특히 패치 클램프 데이터는 종종 현재의 계산 방법 즉시 추출보다 더 많은 정보가 포함되어 있습니다. 따라서, 기대는 그 계산 능력과 SOPH 향후 증가분석 알고리즘의 istication 가능한 추가 응용 프로그램을 만들 것입니다. 이러한 진보의 출현에 따라, 그것은 하나의 채널에서 패치 클램프 녹음은 구조, 기능 및있는 이온 채널의 역학에 대해 더 많은 정보를 제공하는 FRET 측정, 칼슘 이미징 또는 생체 준비에과 동시에 발생할 수 있다는 것을 예측할 수있다 네이티브 및 제어 환경 모두.
이온 채널의 다양성이 증가, 자신의 게이팅 메커니즘에 대한 자세한 이해를 조사하고, 궁극적으로 자신의 작업이 자신의 고유 한 생물학적 기능에 기여하는 방법을 이해하는 바와 같이 단일 분자 관측에서 도움이 될 것입니다. 특히, 재조합 및 기본 채널에 대해 하나의 전도 특성 및 게이팅 시퀀스에 대해 알리기 위해 1 채널 패치 클램프 약속 한 데이터.
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Disclosures
이 논문의 저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 F31NS086765 (KAC)에 의해 지원되었다, F31NS076235 (MAP), 및 R01 NS052669 (GKP) 및 EIA9100012. 저자는 전문 지식과 분자 생물학 및 조직 문화에 대한 지원은 아일린 Kasperek 감사합니다; 제이슨 마이어스 초기 전두엽 대뇌 피질의 신경 세포에서 얻은 데이터를 공유.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | Sigma | Various | |
| Borosillicate Glass | Sutter | BF-150-86-10 | |
| Bright field inverted microscope | Olympus | 1x51 | Nikon also has similar microscopes |
| Fluroescent box | X-cite | Series 120 | |
| Liquid Light Guide | X-cite | OEX-LG15 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-225 | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS1001 | |
| Amplifier | Molecular Devices | Axon Axopatch 200B | |
| Table | TMC | 63561 | |
| NIDAQ card | National Instruments | 776844-01 | |
| Puller | Narishige | PC-10 | |
| Polisher | Narishige | Microforge MF-830 | |
| Faraday Cage | TMC | 8133306 | |
| High Speed Pressure Clamp | ALA Scientific Instruments | ALA HSPC | |
| Pressue/Vaccuum Pump | ALA Scientific Instruments | ALA PV-PUMP | For HSPC-1 |
References
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