Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

Summary

Descrito aqui é um procedimento para a obtenção de longos trechos de gravação atual de um canal iônico com a técnica de patch-clamp anexado à célula. Este método permite observar, em tempo real, o padrão de open-close conformações dos canais que estão na base do sinal biológico. Estes dados informar sobre as propriedades dos canais nas membranas biológicas não perturbadas.

Abstract

Proteínas de canais iônicos são dispositivos universais para comunicação rápida através das membranas biológicas. A assinatura temporal do fluxo iónico geram depende das propriedades intrínsecas de cada proteína de canal, bem como o mecanismo pelo qual é gerada e controlada e representa uma importante área de pesquisa actual. Informações sobre a dinâmica de funcionamento de proteínas de canais iónicos pode ser obtida observando longas extensões de corrente produzidos por uma única molécula. Descrito aqui é um protocolo para a obtenção de ligado de células de patch-clamp gravações actuais um canal para um canal de iões fechado ligando, o receptor de NMDA, expresso de forma heteróloga em células HEK293 ou nativamente em neurónios corticais. Também são fornecidos instruções sobre como adaptar o método para outros canais de íons de interesse, apresentando o exemplo do canal Piezo1 sensível ao mecano. Este método pode fornecer dados sobre as propriedades de condutância do canal ea seqüência temporal de opeconformações n fechados que compõem mecanismo de ativação do canal, ajudando a compreender as suas funções na saúde e na doença.

Introduction

Comunicação rápida através das membranas biológicas depende quase que exclusivamente em proteínas de membrana oligoméricas poros formando, comumente referido como canais. Estas proteínas são muito diferentes em sinais de ativação, mecanismos de propagação e as propriedades de condutância. Proteínas canal cujo poros são seletivos para os íons são classificados como canais iônicos; sua ativação produz correntes iônicas através da membrana, e suas respostas podem ser gravados com alta resolução em tempo real, usando técnicas eletrofisiológicas. Os sinais de ativação abrangem uma ampla gama de insumos químicos e físicos, incluindo gradientes de concentração, forças mecânicas e elétricas, e temperatura; Assim, a classificação mais canais iônicos em ligante fechado, mechanosensitive, tensão fechado, ou tipos sensíveis ao calor. Neste artigo, os protocolos estão descritos para registar a actividade de um canal de um canal fechado ligando, o receptor de NMDA, e um canal mechanosensitive, Piezo1, usando a técnica de patch-clamp.0;

Patch-clamp electrofisiologia é a primeira e mais largamente utilizado o método experimental suficientemente sensível para permitir a observação de moléculas individuais ^{1, 2.} Além dessa sensibilidade apurada, ele expandiu enormemente as preparações biológicas passíveis de registros eletrofisiológicos e também permitiu a observação de canais iônicos em membranas intactas. Em primeiro lugar, porque, tanto de fixação de tensão e corrente de gravação são realizadas com o mesmo eléctrodo, que pode ser utilizado para gravar sinais através de pequenas células ou membranas de remendos. A técnica revelou que canais iônicos não se restringem a membranas excitáveis ​​dos músculos do sapo, electroplaques enguia, ou axônios gigantes de lula ^{3, 4,} mas sim que eles representam luminárias onipresentes de transmembrana mecanismos de sinalização e são intrínsecos a todos os tipos de membranas celulares de uni ou organismos multicelulares, e também às membranas intracelulares. Importaçãoantly, a capacidade de gravar correntes transmembrana, basta anexar uma pipeta de vidro de uma célula intacta desde que a oportunidade sem precedentes para gravar a atividade de canais iônicos em suas membranas ininterrupto nativas. Assim, a célula ligada técnica de patch-clamp, que é descrito neste protocolo, permite monitorar a atividade dos canais iônicos continuamente por dezenas de minutos ou mais em seu ambiente nativo.

Sob flutuações térmicas normais, todas as proteínas, incluindo proteínas de canais iônicos, são submetidos a mudanças estruturais mais de uma escala de tempo largo, com os rearranjos mais rápidas e mais freqüentes representados provavelmente por movimentos de cadeia lateral e muito mais lentas mudanças, menos freqüentes representados pelo reposicionamento de toda domínios ou sub-unidades, ou em alguns casos por modificações pós translacionais ou interações proteína-proteína ^{5, 6.} Observando longos períodos de atividade geradas por uma molécula pode ajudar a compreender a funçãodinâmicas tradicionais de canais de íons nas membranas fisiológicas intactas e fornece informações valiosas sobre o mecanismo operacional da molécula observado.

Em contraste com a crescente compreensão da diversidade de canais iônicos em todo os tipos de células e estágios de desenvolvimento, o conhecimento sobre a composição molecular de canais iônicos em membranas nativas ainda é limitada. Todos os canais iônicos são proteínas multiméricas ea maioria dos canais iônicos nativas montar a partir de vários tipos de subunidades que produzem proteínas da diversidade molecular de largura, que é muitas vezes acompanhada com diversas condutância e gating propriedades. Por esta razão, os canais de iões da composição molecular definida são estudados por expressão em sistemas heterólogos. Em particular, as células HEK293, que são uma linha clonal de células embrionárias de rim humanas imortalizadas ^7, ganhou aceitação generalizada como o sistema preferido para a expressão heteróloga de canais de iões recombinantes. Entre o homemvantagens y que elevaram células HEK293 como o sistema de escolha para canal iônico eletrofisiologia são a facilidade e acessibilidade de cultivo e manutenção de culturas estáveis ​​de longa duração, a sua capacidade de realizar pós-translacional dobrar, processamento e tráfico de proteínas de mamíferos, e em muitos casos , o seu nível baixo ou até mesmo ausência de expressão endógena para o canal de interesse ^{7, 8.} Expressando os canais de iões recombinantes e estudar as suas propriedades funcionais em células HEK293 que continua a ser uma ferramenta valiosa para obter informações sobre as propriedades de estrutura-função de canais iónicos, assim como das propriedades específicas das isoformas dos canais de iões e os seus papéis no tecido nativo. Os protocolos descritos neste artigo pode ser aplicado igualmente bem para os canais de iões recombinantes expressos em células HEK293 e a canais de iões nativos.

Em resumo, a técnica de patch-clamp, através da sua capacidade sem precedentes para resolver sinals de uma molécula permanece, até hoje, o método mais direto para observar o comportamento de moléculas individuais. Em seu modo conectado à célula, gravação de patch-clamp permite longos períodos de observação que, quando feito por uma molécula, pode proporcionar uma visão excepcional sobre o funcionamento de canais iônicos. Abaixo é apresentado um protocolo para a obtenção de alta resolução a partir de gravações atuais celulares manchas anexo contendo uma proteína de canal iônico.

Protocol

1. Cultura de células e Protein Expression

1. Manter células HEK293 (ATCC número CRL-1573) entre as passagens 22 e 40, que inclui passagens realizadas pela ATCC, em cultura em monocamada em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina a mistura de 5% de CO ₂ e 37 ° C. Entre as experiências, as células de passagem em frascos T25 em 5-20 diluições em um volume final de 10 ml. Nota: A utilização de células durante essas passagens garante a saúde das células favorável que permitirá a formação de selo ideal e estabilidade patch.
2. Para a transfecção, as células HEK293 prato em pratos de 35 mm a uma densidade de ~ 10 ⁵ células / prato, o que corresponde a ~ 0,5-0,6 ml de suspensão de células por prato e crescer células em 2 ml de meio por 18-24 horas.
3. Numa esterilizado de 1,5 mL do tubo de centrífuga, preparar a mistura de transfecção para quatro placas de 35 mm por adição (por esta ordem): (1) 1 ug de cada ADNc (GluN1, GluN2A, e GFP); (2) 315 ul deágua bidestilada (DDH ₂ O); (3) 350 ul de 42 mM de 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfónico ácido (HEPES), e (4) 35 ul de 2,5 M de _CaCl2 gota a gota, a qual é usada para formar o precipitado.
4. Tubo de vórtice durante 5 segundos e adicionar 175 ul de suspensão de transfecção de cada uma das quatro placas 35 milímetros plaqueadas no dia anterior, que agora contêm células de 50-60% de confluência, e incuba-se as células a 37 ° C durante 2 horas.
5. Aspirar fora o meio de transfecção, lavou-se com PBS e substituir com 2 ml de meio de crescimento suplementado com 2 mM de _MgCl2 para impedir o receptor de NMDA excitotoxicidade mediada ^9. Nota: As células podem ser utilizadas para registos electrofisiolicos 24-48 horas após a transfecção.

2. Eléctrodo Preparação

1. Gerar duas pipetas de gravação simétricas puxando tubos de vidro de borosilicato com um puxador vertical. Com base no tamanho e geometria da ponta resultante, mais pipetas formausando um polidor. Nota: O tamanho da ponta pode ser avaliado visualmente e eletricamente. Visualmente, o diâmetro exterior deve estar no intervalo de 1,4-5,6 mM. Electricamente, uma ponta de tamanho ideal, quando preenchidos com a solução extracelular, deve produzir resistências na gama mohms 12-24 (ver Figura 2B).
2. Use uma solução de pipeta, que para experimentos com células anexado representa o meio extracelular que irá produzir a atividade do canal máxima e altas amplitudes atuais. Nota: Para os receptores de NMDA, o que corresponde a uma solução contendo as concentrações saturantes de agonistas (glutamato e glicina), 1 mM de EDTA, que quela os inibidores bivalente catiónicos e bloqueadores, e tem concentrações fisiológicas de sódio (150 mM) como o único ião permeante ( em mM: glutamato 1, 0,1 glicina, NaCl 150, KCl 2,5, EDTA a 1, e 10 HEPBS, tamponada a pH 8,0 com NaOH 1 N).

3. Gravação patch-clamp anexado-Cell

1. Abrir softwa aquisição de dados QUBre (www.qub.buffalo.edu), e selecione a janela de aquisição em 'esquema'. Abra um novo arquivo de dados QUB (QDF), clicando em "New Data" sob o menu drop-down intitulado 'File' e digite os seguintes parâmetros iniciais: taxa de amostragem, 40 kHz; A escamação / D, 3000; canal de saída, 1; e tamanho de dados A / D, 2. Ajuste a escala de amplitude de 0,1 V / Pa, clicando com o botão direito no arquivo de dados, selecionando propriedades e clicando na guia 'dados'. Nota: Estes parâmetros podem ser refinados para cada configuração usando uma célula modelo no modo conectado à célula. Instrução adicional sobre a aquisição de dados com software QUB e propriedades QDF estão online no www.qub.buffalo.edu.
2. Seleccione um prato de 35 mm contendo canais de iões de células que expressam e substituir o meio de crescimento com 2 ml de PBS contendo cálcio e magnésio; montar o prato para o palco microscópio e foco no campo celular por microscopia de contraste de fase para avaliar que as células são saudáveis ​​e bem ligado ao pratoem monocamada de moda (Figura 1A). Mudar para detecção de fluorescência para verificar que a transfecção foi bem sucedida (Figura 1B). Nota: A escala de intensidade de fluorescência pode ser utilizado como uma medida da expressão da proteína em bruto.
3. Para a gravação de um único canal, ajuste o ganho do amplificador de saída para x10, configuração patch para β = 1, filtro analógico de 10 kHz, o modo de tensão-clamp e aplicada tensão para 100 mV. Com o comando de tensão de retenção na posição OFF, selecione o botão "teste de vedação.
4. Com base na fluorescência e saúde celular, escolher uma célula para corrigir. Verifique sob contraste de fase que a célula é bem ligado ao prato, tem uma grande porção da superfície da célula exposta para remendar, e caso contrário, parece saudável. Nota: Manter a iluminação de contraste de fase, para evitar o branqueamento do celular durante a abordagem e patch-fixação.
5. Preencha uma pipeta recém polida com apenas uma solução suficiente para que ele faz contato com a electrode e agitar suavemente para retirar as bolhas de ar que possam estar presas na ponta. Fixe a pipeta de gravação para o headstage amplificador, apertando o parafuso de vedação do titular da pipeta e certificando-se de que o fio de prata está imerso na solução de pipeta.
6. Usando um pequeno (5 cc) de seringa de plástico, o qual está ligado ao suporte da pipeta por tubagem, aplicar suavemente a pressão positiva para prevenir a entrada de impurezas e entupimento da ponta, durante a abordagem (Figura 2A).
7. Usando o micromanipulador, direcionar a pipeta para o banho e posicioná-lo diretamente sobre a célula selecionada para remendar (Figura 1C), fechando o circuito elétrico. Tome nota do osciloscópio, que deve indicar uma forma de onda retangular correspondente ao sinal de teste de vedação do amplificador (Figura 2B). Nota: Após a entrada para o banho, a resistência pipeta dentro da faixa ideal é de 12-24 mohms. Para um sinal de teste de 5 mV, a corrente medida range corresponde a ~ 20-40 pA.
8. Enquanto monitoriza a posição da pipeta visualmente através de um microscópio e pipeta resistência eléctrica no osciloscópio, continuar a abordagem em pequenos incrementos até que a pipeta colide suavemente sobre a célula, e o sinal de teste diminui ligeiramente para indicar o aumento da resistência (Figura 2B).
9. Para formar uma vedação, escolhe-se a seringa e aplicar uma ligeira pressão negativa através do tubo lateral, puxando o êmbolo da seringa, o que puxa a membrana celular para dentro da ponta da pipeta de gravação e inicia a formação de um selo de resistência GÊ ^10. Tome nota da forma de onda do sinal de teste no osciloscópio, em que a formação de selo é indicado por seu achatamento completo, com apenas transitórios capacitivos visíveis (Figura 2B). Nota: Se o sinal não achatar ou completamente a linha de base torna-se barulhento, isso indica um selo fraco com vazamento de corrente substancial em torno do selo. Isso vai evitar que resolving uma correntes de canal. Se este for o caso, retirar a pipeta a partir da célula e para fora do banho, removê-lo a partir da fase de cabeça e descartá-lo. Repita o processo com uma pipeta de recém polida até a obtenção de um selo na faixa adequada (≥ 1 GÊ).
10. No amplificador, mude o comando externo de alternância de 'test selo' para 'off'; mudar o comando de tensão segurando para positivo (que foi previamente definido como 'off'); e aumentar o ganho de x100. Observe o osciloscópio para a atividade do canal, que, se presente, será mostrado como desvios quadrados para cima da linha de base anteriormente plana (Figura 2C).
11. Se a atividade do canal é exibido no osciloscópio, adquirir dados no arquivo digital anteriormente aberto QUB, pressionando o botão 'play', seguido do botão "gravar". Para interromper a aquisição de dados, pressione o botão Parar no QUB, e salve o arquivo com um QDF facilmente retrievlocalização capaz no disco rígido do computador selecionando "Salvar dados como ..." no menu drop-down intitulado 'File'.

4. Dados pré-processamento e Idealização

Nota: Informações importantes podem ser extraídos a partir de gravações de canal único por análises estatísticas, que atribui a cada ponto de dados a uma classe condutância apropriado (no caso mais simples, fechadas ou abertas). Este processo é referido como idealização de dados e uma breve descrição da idealização de dados com os meios de k segmentares (SKM) método ¹¹ em qub se descritos abaixo.

1. Abra o arquivo de dados em QUB, e ver os traços atuais na interface 'pré' em 'esquema'. Mostrar o arquivo gravado não filtrada (remover filtro digital), desmarcando a caixa "Fc.
2. Visualmente a varredura do registro para detectar irregularidades e artefatos (Figura 4A). Breves picos de corrente correto que ocur dentro do traço (Figura 4A), selecionando uma região limpa ao lado da mesma classe condutância, com destaque para a região, clicar botão direito e selecionando "tampão erase definido. ' Zoom sobre o pico até pontos de amostragem individuais são visíveis, selecione a região a ser substituído e apagar destacando apenas nesta região e, em seguida, clique com o botão direito "apagar".
3. Definir a linha de base atual de zero para todo o registro selecionando uma parte inicial do registro, onde a linha de base é estável, destaque, clique com o botão direito e selecione "linha de base definida. Verifique se a diretriz que aparece com precisão representa o nível basal (roxo na Figura 4B)
4. Identificar pontos no registro onde a linha de base de dados brutos desvia visivelmente a partir da linha de base set. Corrija isso selecionando uma pequena seção da linha de base na região desviar, clique com o botão direito e selecione a opção 'adicionar um nó de base "de comando.
5. Identificar regiões de tele gravação contendo excesso de ruído ou artefatos que não pode ser facilmente corrigido (Figura 4C). Destaque a região a ser descartado, clique com o botão direito e selecione "excluir". Nota: Neste caso, a informação cinética será perdido: a Importação será menor e os pontos que ocorrem após o ponto de emenda aparecerá para ser contínuo com a região do pré-ruído.
6. Para idealizar registros usando o algoritmo SKM ^11, destacar uma parte do rastreamento contendo tanto aberta e eventos fechados e entrar na interface de "Mod" em "Layout. ' No painel "modelo", destacar uma parte limpa do traço que é representante da linha de base em todo o arquivo, clique com o botão direito no quadrado preto (estado fechado) e selecione "agarrar". Faça o mesmo para as aberturas de canal, destacando a condutância aberto, clique o botão direito no quadrado vermelho no painel "modelo" e selecione "agarrar".
7. Realize a idealizaçãoção para todo o registro, selecionando o botão "Arquivo" em "fonte de dados". Clique com o botão direito do mouse na guia "idealizar" debaixo da seção 'Modelagem' para verificar se os parâmetros desejados para análise estão corretos e, em seguida, clique em "Executar". O resultado da idealização, juntamente com o histograma de amplitude para o arquivo inteiro, é sobreposto com os dados para permitir a inspeção visual da idealização (Figura 5). Nota: idealização inadequada pode levar à geração de "eventos falsos, 'em que QUB detecta aberturas e fechamentos de canais que realmente não ocorrer. Dentro da resolução de gravação, o qual é definido pelo filtro analógico do amplificador e da taxa de amostragem, a resolução com as quais SKM detecta eventos de abertura e fecho podem ser controlados pela fixação de um tempo morto para as análises. Tempos mortos ideais devem ser selecionados por tentativa e erro e dependerá de taxa de amostragem, no entanto, uma boa regra de ouro épara selecionar um tempo morto que é de 2-3 amostras de ^12.
8. Para verificar se a idealização representa com precisão os dados brutos, procurar manualmente o traço idealizado. Após a identificação de erros na idealização, realce o traço sobre o falso evento, clique direito e selecione "Join Idl. Nota: Para as opções adicionais e uma explicação detalhada de vários comandos e funções em QUB, consulte o manual on-line QUB (www.qub.buffalo.edu).

Representative Results

Recombinante receptores NMDA

Receptores NMDA ligar e responder à ação concomitante de dois co-agonistas: glutamato e glicina. Eles montam como heterotetrâmeros de duas subunidades glicina GluN1 e duas subunidades GluN2 ligação do glutamato de ligação. GluN2 subunidades são codificadas por quatro genes (AD) e de estas formas mais amplamente transcritos no cérebro são GluN2A no adulto e GluN2B em animais jovens. Devido à diversidade de subtipos de receptores de NMDA em preparações nativas, que expressam os receptores em células HEK293 (Figura 1A) permite o controlo da composição de subunidades, bem como a capacidade de gravar a partir de canais de corrente, utilizando uma pipeta de vidro finamente polido (Figura 1C).

Uma vez que a pipeta toca na célula, uma clara redução de amplitude da forma de onda de impulso de teste ocorre (Figura 2B), indicando que a capacidade para formar uma vedação. Um selo adequado contendo umcanal produz atividade canal claro, exibido como desvios para baixo da linha de base, com uma boa relação sinal-ruído mediante aplicação de uma tensão positiva (Figura 2C). A actividade do canal máximo de tipo selvagem recombinante receptores NMDA pode ser atingida quando ambos os agonistas estão presentes em concentrações elevadas, e quando os inibidores e bloqueadores dos canais estão ausentes. Isto é ideal, de modo que, quando um adesivo contém mais do que um canal, aberturas simultâneas são imediatamente aparentes ¹³ (Figura 3B). Para as proteínas com os níveis de actividade muito baixos, a probabilidade de que um troço de uma aberturas nível provém de um único canal pode ser calculado, se a probabilidade de abertura do canal é conhecido ou pode ser aproximada ^{de 14.} Devido a isso, os períodos de observação mais longos podem ser necessários.

Sob estas condições, e quando se aplica um potencial de retenção de pipeta de 100 mV (levando a um potencial de membrana de aproximadamente -120 mV), SiGluN1/GluN2A recombinante ngle e GluN1/GluN2B estão abertas, com elevada probabilidade (P _o, 0,3-0,5) para um nível relativamente elevado de condutância (> 50 pS) (Figuras 3A e 5B) ^15-17. Durante a gravação, picos de corrente de ruído, desvios da linha de base, ou períodos de ruído excessivo pode manifestar (Figuras 4A-C), no entanto, como mencionado, estes podem ser corrigidos se breve e menor. É importante, no entanto, que a atividade do canal é gravado ininterrupta por um período de tempo suficiente (≥ 10 min, 10.000 eventos) para garantir que toda a gama de comportamentos de canal é capturado.

Os dados obtidos a partir de tais gravações podem fornecer informações sobre os dois cinética do canal e as propriedades de permeação. Aqui, demonstramos idealização realizada por Qub usando o algoritmo SKM (Figura 5A), no entanto idealização de dados pode ser executada utilizando outros programas de software, tais como pClamp ou SCAN ^12, umand pode ser realizada utilizando diferentes algoritmos ou critérios, tais como o método de meio limiar, com cada uma destas opções, contendo as suas próprias vantagens e desvantagens. Montagem desses dados para modelos cinéticos podem ser realizados, a fim de obter mais conhecimentos sobre os comportamentos do canal iônico. Encaixe de probabilidade máxima pode ser realizada com o software tal como Qub HJCFIT ou ^18, em que os algoritmos realizadas por cada programa tem as suas próprias vantagens. Enquanto a idealização demonstrado na Figura 5 requer apenas o modelo mais simples possível de um estado fechado e um estado aberto para ser realizado, ajustando um modelo cinético total para um canal de iões requer adicionando sequencialmente fechados e estados aberto até um certo critério é atingido. Este processo foi demonstrado que os receptores de tipo selvagem GluN1/GluN2A tem cinco estados fechado cineticamente distintos e 2-4 estados aberto cineticamente distintos (Figura 5C) ^19, em que estescaracterísticas de propagação são cruciais para determinar a forma do receptor de NMDA mediada sinal sináptica ^{20, 21.} Este modelo de análise pode ser estendida a outros canais de iões de menor condutividade, tais como os receptores de AMPA, para obter uma visão para os seus próprios mecanismos de propagação distintos ^22,23,24. Uma ressalva, no entanto, uma vez que os receptores AMPA ter vários níveis de condutância, idealização de sucesso usando QUB podem exigir estados adicionais estão incorporados em um modelo pré-construídos.

Estes métodos também podem ser estendidos para obter informação sobre a permeação de canal iónico e condutância pela alteração da composição e / ou a concentração de iões de permear. Gravação de actividade através de receptores GluN1/GluN2A simples utilizando os métodos descritos aqui, mas substituindo 150 mM de NaCl com 75 mM de _CaCl2 na pipeta de gravação, produz correntes com ~ 20% da condutância (10 pS ~). Isso demonstra que, enquanto o cálcio penetra receptores NMDA no oiOs níveis de GH em condições fisiológicas, isto, na verdade, atravessa o canal de forma mais lenta do que os iões de sódio, o que indica que pode haver um potencial local de ligação ao cálcio no interior da via de permeação. Além disso, apesar deste pequeno condutância, as gravações podem ser adequadamente idealizado usando o algoritmo SKM em QUB, revelando a existência de uma condutância subnível intermediário, que é cerca de 50% a amplitude atual do nível principal condutância (Figuras 6A e B). Estas aberturas subnível, no entanto, só pode ser idealizado em qub quando uma classe de condutividade adicionais são incorporados no modelo cinético inicial. Outras análises cinéticas revelou que, sob estas condições, os receptores ainda exibem cinco estados fechados cineticamente distintas, no entanto estes estados têm extremamente diferentes constantes de tempo e de ocupação em relação a quando o canal passa apenas íons de sódio (Figura 6C). Além disso, apenas dois estados abertos são observados under estas condições que demonstram que, para além de influenciar a condutância do canal, os iões de cálcio são capazes de modular a propagação do receptor.

Não há maneira certa de obter apenas um canal de manchas. Em vez disso, várias manipulações experimentais podem contribuir para aumentar a probabilidade de sucesso. Em primeiro lugar, o objectivo para baixo nível de expressão do canal por meio da avaliação da intensidade de fluorescência das células transfectadas (Figura 1B). Abordagens mais bem sucedidas pode ser: diminuir a quantidade total de ADNc utilizado para a transfecção ou para diminuir a quantidade de ADNc de uma subunidade necessária, como é GluN1; para diminuir o tempo de incubação com o precipitado de fosfato de DNA / cálcio; e para selecionar para remendar apenas células fluorescentes vagamente do campo de visão. Essas abordagens devem ser prosseguidos se os patches obtidos freqüentemente contêm vários canais. Além disso, diminuindo o tamanho da ponta da pipeta, também podem contribuir para a captura de apenas um canal no PATCh. Em última análise, no entanto, torna-se bem sucedido na obtenção de parcelas de um canal, abstendo-se sistematicamente de gravar por longos períodos de patches que contêm claramente mais do que um canal.

Canais Piezo1 recombinantes

Os métodos descritos no presente protocolo pode ser facilmente aplicado a qualquer canal de iões fechado ligando, e na verdade pode ser adaptado para gravar uma actividade de canal de um canal de iões, se activada por substâncias químicas, tensão, força, temperatura, ou outros meios. Um exemplo de como este protocolo pode ser adaptado para gravar um correntes de canal de outros canais de iões, especificamente rato Piezo1, um canal de iões mechanosensitive, é apresentada a seguir (Figura 7) ^{25, 26.}

Tal como acontece com os canais receptores de NMDA, Piezo1 e GFP são expressos em células HEK293 por fosfato de cálcio e a transfecção mediada por células são utilizadas 24-48 horas pós transfecção quantodescrito na seção 1.2. Porque Piezo1 é activado por estiramento da membrana, deve ser tomado cuidado para manipular a membrana suavemente durante a formação do remendo e dispositivos adequados para a entrega e de controlo da força mecânica aplicada deve estar disponível. Estas condições podem ser alcançadas fazendo pipetas de gravação maiores, com uma resistência na faixa mohms 2-3 e utilizando um dispositivo de aperto de pressão de alta velocidade (HSPC) ligado à pipeta de gravação através dos suportes de pipeta no andar de entrada do amplificador. As configurações de amplificação são semelhantes aos descritos para os receptores de NMDA na secção 3.3, excepto para ligar o botão de comando 'externo' para que o amplificador pode ser controlado por meio do software de aquisição.

Para registar a actividade de Piezo1, utilizar uma pipeta de registo preenchida com (em mM): 130 NaCl, 5 KCl, 10 HEPES, 1 _CaCl2, 1 _MgCl2, 10 TEA-Cl, pH 7,3 com NaOH. Sob estas condições, as aberturas podem ser monitorados como icorrentes de sódio nward, que aparecerão no osciloscópio como desvios para baixo em uma linha de base atual de zero. Colocar a pipeta de gravação no palco cabeça amplificador e verifique se o botão do HSPC está em zero. Antes de entrar no banho, aplicar 3-5 mmHg de pressão positiva. Usando o micromanipulador, abaixe a pipeta para o banho, verifique se há resistência pipeta desejado, e trazer a pipeta em estreita proximidade com a célula selecionada como descrito na seção 3.6. Toque suavemente a célula sob a orientação microscópio e monitorando o osciloscópio, observe uma ligeira redução na amplitude da forma de onda de teste de vedação de forma semelhante como é feito com os receptores NMDA (seção 3.7). Liberar rapidamente a pressão positiva aplicada através da pipeta, alterando o nível de retenção da pressão 3-5 a 0 mmHg. Aguarde um selo GÊ para formar através do monitoramento da forma de onda de teste de vedação. Neste caso, não é aplicada a pressão negativa de modo a formar uma vedação. Uma vez que uma vedação ideal é obtida a imprensa e# 8216;. Botão de gravação "em QUB para iniciar a aquisição de dados Figura 7 mostra um traço representativo de mPIEZO1 correntes de canal único ativados com aplicação -20 mmHg de pressão para a pipeta de patch. Estas correntes foram low pass filtrado a 2 kHz e amostrados a 20 kHz.

Em contraste com o ligando de canais fechados com domínios de ligação de ligandos extracelulares, o estímulo de activação canais mechanosensitive pode ser variada sob dois protocolos. O primeiro é o "livre-gap ', onde uma pressão negativa constante é aplicada a correção para toda a duração da gravação. Este protocolo é útil na obtenção de gravações minutos longos e é mais bem sucedida com estímulos menores de pressão (0 a 20 mm Hg), que preservam a integridade da membrana. Actividade produzido por alta pressão, que é susceptível de se romper a membrana, é melhor obtido com gravações 'episódicas', onde os impulsos de pressões diferentes podem ser aplicadas ao penso por períodos de tempo mais curtos (<forte> Figura 7). Tal como acontece com os canais ligante fechado, gravações de célula anexa uma manchas de canal oferecem uma riqueza de informações sobre ambos a condutância e as propriedades de propagação do canal sob investigação.

Neuronal receptores NMDA

O método aqui descrito para a gravação de um canal, ligado à célula pode ser usada para obter informação sobre a condutância e propriedades de propagação de canais endógena para um tipo particular de célula e / ou fase de desenvolvimento. Como é o caso com muitos outros canais heteroméricos, a composição molecular exacto dos receptores NMDA nativos não é conhecido. Ao comparar os resultados obtidos a partir de receptores recombinantes, de composição conhecida com os obtidos a partir de preparações nativas, as hipóteses sobre a composição da subunidade e da função dos canais do seu ambiente nativo, ou pode ser formulado testado ^17.

Os neurónios foram isolados a partir de pré-frontalcórtices de embriões de rato e cultivadas em cultura durante até 6 semanas ^17. Em adição aos componentes descritos para as gravações de receptores NMDA recombinantes na secção 2.2, a solução da pipeta continha também CNQX (20 uM) e bicuculina (10 fiM) para inibir os receptores de AMPA e GABA nativo, respectivamente. Dependendo da idade da cultura, os registos obtidos a partir dos receptores NMDA nativos revelaram cinética que eram bastante diferentes. Gravações de início (Figura 8A, 5 dias em vitro) cultura mais se assemelham a cinética descritos para receptores e gravações GluN1/GluN2B da tarde (Figura 8B, 27 dias em vitro) culturas mais se assemelham a cinética descritos para receptores GluN1/GluN2A (Figuras 3A e 5A). Esta observação é consistente com os padrões de expressão do receptor NMDA isoformas e com caracterizações cuidadosos de correntes gravados a partir de células anexado parcelas de um canal no quadrilculturas pocampal ^16.

Figura 1. Seleccionar uma célula HEK293 para gravação ligado celular. UM) HEK293 células cultivadas em um prato de 35 mm são colocadas sobre a fase de microscópio e visualizada com contraste de fase com 40X de ampliação. B) fluorescência da GFP a partir do mesmo campo visual como no painel A identifica as células transfectadas. A seta indica uma célula que expressa GFP, parece saudável, e está em uma posição favorável para acesso pipeta. C) A pipeta de gravação é trazido em estreita proximidade com a célula selecionada usando um manipulador de movimento fino sob a orientação visual. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Celular ligada de formação de selo. A) Uma pequena seringa ligada ao lado do suporte da pipeta permite um controlo manual da pressão no interior da pipeta. B) A corrente que passa através da pipeta imerso na solução de banho que, em resposta ao ensaio de amplificador, que em 5 mV (0,5 kHz) está 18 pA, e corresponde a um tamanho de pipeta de 28 mohms. Ao tocar a célula (seta para a esquerda), o nível de corrente diminui observados, indicativo de um aumento da resistência da pipeta. Aplicando uma pressão negativa através da pipeta (seta para a direita) inicia a formação de vedação e reduz o sinal produzido pelo pulso de teste de transientes apenas capacitivas. C) ausente um pulso de teste, e se nenhuma tensão é aplicada através da pipeta (0 V), a linha de base é estável (à esquerda da seta). Aplicando uma tensão positiva (seta, 100 mV) pr oduces correntes unitárias estocásticos que indicam as aberturas de canal. Linha pontilhada vermelha indica a linha de base atual zero.

. Figura 3 celulares correntes ligadas gravados a partir de receptores GluN1/GluN2A A) de correção de um canal:. Um segmento de 50 segundos de gravação contínua ilustra aberturas de canal para uma única amplitude uniforme B) patch-canal múltipla:. Um segmento de 50 segundos de gravação contínua ilustra aberturas de canal a dois níveis de amplitude, indicando que o patch contém pelo menos dois canais ativos. Linha pontilhada vermelha indica a zero da linha de base atual. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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A) Correção de processamento de dados Figura 4.. Durante picos de ruído. Exibir dados não filtrado e manualmente substituir a sinais estranhos (vermelho) com o sinal de linha de base. Vista expandida ilustra um pico antes (no meio) e após (em baixo) da espiga (vermelho) foi substituído com o sinal da linha de base. B) Correcção de desvio da linha de base. Logo no início do registro, selecione um pequeno segmento da linha de base e defini-lo como o atual nível zero para o registro inteiro (linha roxa). Corrigir os desvios da linha de base, selecionando uma pequena porção de deriva basal (seta) e adicionar um nó de referência (círculo roxo). C) Períodos mais longos de registro com base barulhento (vermelho) que são difíceis de corrigir pode ser excluído. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Idealização de Dados. A) os traços atuais (preto) foram registrados a partir de um receptor GluN1/GluN2A passando apenas íons de sódio com a técnica de patch-clamp anexado à célula. Os pontos de dados idealizados (vermelhas) são ilustrados por um segmento de canal de 30 seg. Estes sobrepor bem, indicando que a idealização é preciso. B) Histograma de amplitudes de corrente ilustram uma distribuição que está bem descrito por apenas duas funções de Gauss, com um pico a zero (0,02 ± 0,8 Pa), indicativo de eventos de canais fechados e em 10,3 ± 1,3 pA indicativo de apenas um tipo de eventos de canal aberto para toda a duração da gravação (130 min). C) Fechado (à esquerda) e aberta (à direita) habitar histogramas de tempo para a gravação inteira mostrado em (A). A probabilidafunção densidade dade para os histogramas (linhas grossas) e componentes cinéticas individuais (linhas finas) estão sobrepostas e foram calculados por adaptação dos dados a um modelo contendo cinco estados fechado e aberto de três estados. As inserções fornecer a constante de tempo (τ) e área relativa (a) para cada um dos componentes individuais cinéticos.

Correntes Figura 6. Cálcio através dos receptores NMDA individuais. A) traços atuais (preto) foram registrados a partir de um receptor GluN1/GluN2A passando apenas íons de cálcio com a técnica de patch-clamp anexado à célula. Pontos de dados idealizados (vermelhas) são ilustrados por 30 segmento seg. B) Histograma de amplitudes atuais ilustram uma distribuição que é bem descrita por três funções de Gauss, com picos em zero (0 ± 0,3 pA), indicativo de pertoeventos d canal, 1,3 ± 0,4 pA indicativo de eventos de canal aberto para a condutância subnível, e 2,1 ± 0,3, indicativo de eventos de canal aberto para o principal nível de condutância. C) Fechado (à esquerda), o nível de condutância principal estado aberto (meio) e subnível condutância estado aberto (à direita) habitar histogramas de tempo para a gravação inteira mostrado em (A). A função densidade de probabilidade para os histogramas (linhas grossas) e componentes cinéticos individuais (linhas finas) são sobrepostos e foram calculados pelo ajuste dos dados a um modelo contendo cinco estados fechados, dois principais níveis de condutância estados aberto e uma condutância estado aberto subnível. As inserções fornecer a constante de tempo (τ) e área relativa (a) para cada um dos componentes individuais cinéticos.

Figura 7. Celular ligado um canal de gravaçãode mPIEZO1 expressos em células HEK293. actividade é induzida pela aplicação de -20 mmHg, com um dispositivo de HSPC através da pipeta de adesivo, durante a aplicação de tensão constante (80 mV). Linha pontilhada vermelha indica o nível atual zero.

Figura 8. Celular anexado um registo de canal a partir dos canais nativas. A pipeta foi ligada a soma de um neurónio que foi dissociado do córtex pré-frontal de um embrião de rato e foi mantida em cultura durante 5 dias (a) ou 27 dias (B) . A actividade do receptor de NMDA foi gravado contínuo com soluções de pipeta contendo glutamato (1 mM) e glicina (0,1 mM), e também CNQX (20 uM) e bicuculina (10 fiM) para inibir os receptores de AMPA e GABA nativo, respectivamente. A actividade foi provocada através da aplicação de 100 mV ttravés da pipeta de gravação. Linha pontilhada vermelha indica o nível atual zero.

Discussion

No campo canal iônico, uma importante área de pesquisa é dedicado à compreensão da seqüência de eventos que leva ao canal de abertura ou mecanismo de propagação do canal. Para a maioria dos canais, este processo é complexo e envolve várias etapas cinéticas, que não pode ser deduzida a partir de um sinal multicanal macroscópica. Em contraste, os experimentos podem ser projetados em observar a seqüência de eventos aberto / fechado no registro de canal único pode produzir informações mais detalhadas sobre gating mecanismos. Nos métodos descritos aqui, o domínio de ligação ao ligando, localizados externamente possuída pelos receptores NMDA permite gravações de patch-clamp minimamente invasivas para ser realizada sob condições constantes. Este protocolo pode ter de ser adaptado, a fim de ser adequado para a investigação de outros canais iônicos ligante dependendo tanto de ligação e propriedades receptoras.

Registros de atividade do canal único fornecer dois tipos de informações valiosas. Primeiro,porque a amplitude da corrente unitária pode ser medido diretamente, os experimentos podem ser projetados para obter informações sobre as propriedades dos poros, como canal de condutância, permeabilidade e seletividade. Em segundo lugar, porque a duração dos eventos abertos e fechados também pode ser medido diretamente a partir do registro, os experimentos podem ser projetados para obter informações sobre a cinética de propagação e, assim, fazer inferências sobre o mecanismo de funcionamento do canal. Para ambos os tipos de experimentos, análise estatística significativa requer binning cada ponto individual do rastreamento atual a uma classe condutância específica. Apresentado aqui foi um tal método de fazer isto, utilizando os k-segmentares meios (SKM) ¹¹ algoritmo, no entanto, esta pode ser realizada por vários algoritmos mais ou menos sofisticadas, incluindo semi-limiar, SCAN ^12, Baum-Welch, Viterbi, etc

Gravações usando a configuração anexado células são poderosos em que os canais iônicos são preservados em biológicomembranas com ambientes intracelulares não perturbados. Devido a isto, é essencial que opérculos são adequadamente formado e mantido ao longo do registo com duas finalidades: 1) de continuidade experimental e 2) manter uma relação favorável de sinal-para-ruído (pico a pico do ruído de linha de base <2 pA). O tamanho e forma da ponta da pipeta geradas determina a probabilidade de um selo de membrana bem sucedida contendo exactamente um canal. A ponta plana garante que quando a pipeta se aproxima da célula que vai tocar e pressionar para a membrana celular com toda a superfície da ponta de uma só vez, ajudando a selar de maneira uniforme sobre a célula. A pipeta com uma dica que é muito grande vai ser menos propensos a resultar em manchas de um canal; em contraste, após puxar uma pipeta com uma ponta que é demasiado estreita irá resultar num ciclo de membrana em forma de ómega, que pode vedar na base e entupir a pipeta ^10.

Um sinal favorável à relação de ruído pode ser gerenciado por minimizar fontes de elétricaruído. O recurso de refrigeração headstage no Axopatch 200B tem permitido para a resolução de sinal ótimo; no entanto o ruído pode ainda ser produzido por qualquer dos instrumentos envolvidos na electrofisiologia configurar, bem como fontes externas, tais como a luz e electrónica independentes. Felizmente, várias estratégias podem ser implementadas para minimizar o ruído a um nível desejado ^{2, 27.} Resumidamente, certifique-se que as peças de equipamentos que são capazes de produzir ruído são fundamentadas em um único ponto dentro do setup. Ao fazer isso, é importante para evitar a formação de circuitos de terra que vai causar um ruído significativo. Além disso, se 60 ruído ciclo está presente, não se esqueça de desligar todas as luzes que possam estar interferindo com o sinal de gravação. Finalmente, colocando uma gaiola de Faraday em torno do aparelho de gravação irá impedir obstáculos próximas de causar ruído elétrico.

Observando um canal para um longo período de tempo demonstrou que gatingalterações conformacionais pode ocorrer ao longo de uma ampla gama de escalas de tempo. Temporalmente, os dados de patch-clamp são limitadas na extremidade 'curto' pela largura de banda do amplificador e a taxa a que o sinal amplificado é digitalizado e no final "longa" pela janela de observação. Para mudanças de conformação que são mais rápidos do que o limite baixo, as gravações de patch-clamp só pode oferecer informações quando combinada com abordagens experimentais complementares. Para mudanças conformacionais que ocorrem com taxas muito lentas, e, portanto, são amostrados com pouca freqüência, pode-se aumentar o número de observações ou aumentar a duração do registro, no entanto, isso pode não ser sempre possível.

Apesar destas limitações, os dados de patch-clamp, particularmente quando obtidos a partir de um canal individual, muitas vezes contêm mais informações do que imediatamente extraível com metodologias computacionais atuais. Assim, a expectativa é que os futuros aumentos de capacidade computacional e da Sophistication de algoritmos de análise vai fazer possíveis aplicações adicionais. Após o advento de tais avanços, é previsível que as gravações de patch-clamp de canais individuais podem ser capazes de ocorrer em simultâneo com as medições se preocupe, imagens de cálcio ou mesmo em preparações in vivo para fornecer mais informações sobre a estrutura, funcionamento e dinâmica dos canais iônicos em ambos os ambientes nativos e controladas.

Como a diversidade de canais iônicos investigado aumenta, compreensão detalhada dos seus mecanismos de propagação e, finalmente, a compreensão de como a sua operação contribui para as suas funções biológicas únicas serão beneficiados a partir de observações de moléculas individuais. Em particular, os dados obtidos com a promessa de patch-clamp de um canal para informar sobre as propriedades de condutância unitários e seqüências de propagação para canais recombinantes e nativos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1x51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1