Abstract
Некоторые классы химиотерапии могут оказывать острые сосудистые изменения, которые могут прогрессировать в долгосрочных условий, которые могут предрасполагают пациента с повышенным риском сосудистых заболеваний. Тем не менее, хотя монтажной клинических данных, есть недостаток четких исследований сосудистой токсичности и, следовательно, этиологии гетерогенной группе сердечно-сосудистых заболеваний сосудов / еще предстоит выяснить. Кроме того, механизм, который может лежать в основе сосудистой токсичности может полностью отличаться от принципов, вызванной химиотерапией кардиотоксичности, которая связана с прямым ущербом миоцитов. Мы создали в режиме реального времени, в естественных условиях платформы молекулярной визуализации для оценки потенциального острая сосудистая токсичность противоопухолевых препаратов.
Мы создали платформу в естественных условиях, молекулярной визуализации высокого разрешения у мышей, подходит для визуализации сосудистую сеть в труднодоступных органов и справочных БлоOD судах, находящихся в одних и тех же лиц в то время как каждый человек служить ее собственным контролем. Кровь стенки сосудов отмечались нарушения после введения доксорубицина, представляющая собой уникальный механизм сосудистой токсичности, которые могут быть ранним событием травмы органов-мишеней. При этом метод расслаивается конфокальной флуоресцентной микроскопии (FCFM) на основе визуализации описано, которая обеспечивает новаторский режим, чтобы понять физиологические явления на клеточном и субклеточном уровнях в субъектах животных.
Introduction
Клинические данные показывают, что несколько классов химиотерапии вызывают различные сосудистых патологий, проявляющихся в болезнь Рейно, гипертония, инфаркта миокарда, цереброваскулярные атаки, и печеночной вено-occlusivedisease 1,2. "« Случайных »антиангиогенные наркотики" является довольно новый термин, который описывает обычные химиотерапевтические средства, которые действуют в качестве возможных ингибиторов ангиогенеза, хотя они не первоначально разработана для этой цели 3-5, но предназначен для устранения опухолевых клеток путем введения всего "обеспечение ущерб "в нормальных клетках, как это возможно 3. Несколько химиотерапии были подразумеваемых, сосудисто-токсикантов, как отмечено в клинических исследованиях с использованием сыворотки биомаркеров. Среди них являются алкилирующие агенты (например, циклофосфамид), соединения платины (например, цисплатин) и антрациклинов 1,2,5-7.
Острые сердечно-сосудистые осложнения могут возникнуть в РЕЗУЛЬТАТОВт сосудистой токсичности, вызванной химиотерапией. Они могут прогрессировать в хронических заболеваний, как атеросклероз и учета повышенного риска поздних сосудистых осложнений. Тем не менее, несмотря на растущее клинических доказательств, есть нехватка назначенных исследований, подчеркивающих механизм сосудистой токсичности и поэтому далее в выяснение точного патогенезе они причиняют является оправданным.
Основная задача в выявлении механизма, вызванной химиотерапией сосудистой токсичности происходит от сложности исследования сосудистой функции в естественных условиях. Мы описываем здесь платформу с высоким разрешением в молекулярной визуализации естественных мышей, что позволяет захватить поток крови и характеристики судов. Эта платформа облегчает обнаружение прямых вызванных лечением сосудистых эффектов: в режиме реального времени, а также после них в течение периода времени в пределах одних и тех же лиц.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике: Все эксперименты были одобрены Комитетом по уходу и использованию Институциональная животного. Уход за животными было в соответствии с ведомственным руководящим принципам. ICR самок мышей (7 - 8 недель; 25 - 30 г) были размещены в кондиционерами, легких под контролем объектов животного в Sackler медицинского факультета в Тель-Авивском университете. В перспективе, животные были умерщвлены с анестезией передозировки.
1. расслоенных конфокальной флуоресцентной микроскопии (FCFM) Калибровка
- Включение и выключение устройства.
- Подключите микрозонд (mini0 / 30).
- Калибровка устройства в соответствии с инструкциями изготовителя.
2. Мыши Подготовка для работы с изображениями
- Обезболить путем подкожной инъекции, так Ketaset (100 мг / кг) и Xyl-M2 (6 мг / кг). Подтвердите надлежащего обезболивания по останову до пят-пинча.
- Надрезать кожу ниже паховой области с целью выявить бедренных артериальных сосудов. Держите место разреза влажная солевым раствором следующий разрез.
- Нагрейте хвост с помощью мешка (или перчатки), наполненную теплой водой (не слишком жарко, чтобы коснуться) в течение примерно 30 сек. Подготовка внутривенного (IV) шунт для введения декстрана (FITC контрастного вещества) и физиологического раствора или химиотерапевтическим агентом, путем вставки иглы (30 г, 1/2 дюйма) в хвостовую вену и присоединение 1 мл шприц с ним , Убедитесь, вены работает по инъекционного введения физиологического раствора.
Примечание: ВВ введение декстрана (FITC высокой молекулярной массой; 100 мкл; 10 мг / мл; 2000 кДа) облегчает визуализации бедренной микроциркуляторного русла по FCFM. Доксорубицин (100 мкл; 8 мг / кг, адриамицин) или физиологический раствор также будет позже вводили внутривенно в предварительно нагретой хвостовую вену. - Наведите указатель мыши безвольно на сцене полистирола. Безопасный мыши на площадку и поддерживать положение с помощью хирургической клейкой лентой.
ПРИМЕЧАНИЕ: расслоенных конфокальной микроскопии используется в данном исследовании состоит из двух блоков: (1) микрозонде (mini0 / 30). (2) Узел лазерного сканирования (LSU-488; 488 нм длина волны).
- Выполните все временные кругов анализ с использованием длины волны нм лазер ЛГУ 488.
ПРИМЕЧАНИЕ: главная детектор обнаруживает отфильтрованный (500 - 650 нм), излучаемый флуоресценции. Полученные изображения восстанавливаются после этого и отображается со скоростью 12 кадров / сек. - Отключите тщательно шприц с иглы и закрепите новый шприц, содержащий FITC декстран. Администрирование (IV) 100 мкл FITC декстрана.
- Сдвиг микрозонда (mini0 / 30) для подходящего поля зрения и зафиксировать его, после корректировки оси, с тем чтобы получить соответствующее изображение. Подождите исходного сигнала, чтобы исчезнуть, пока четкой и целенаправленной сигнал не VisiBLE.
- Запись исходных кровоток в течение короткого периода стабилизации (~ 30 секунд). Затем подсоединить к игле другой шприц, содержащий либо доксорубицин или физиологический раствор. IV управлять 100 мкл доксорубицин или физиологический раствор.
- Монитор потока впрыскиваемого FITC-декстрана непрерывно в течение 20 мин. На программное обеспечение FCFM ассоциированный с помощью кнопки диаметр на верхней линейке, чтобы измерить кровеносные сосуды и классифицировать их как малые (<15 мкм) или большие (> 15 мкм).
- Эвтаназии животное с анестезией передозировки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В естественных условиях непрерывного отображения и в режиме реального времени
Устройство формирования изображения используется здесь, является высокой четкости, расслаивается конфокальный микроскоп, оснащенный зондом, который позволяет визуализировать сосудистую и его ответ на различные стимулы, как химиотерапии. Этот метод минимально инвазивной так, хотя это может облегчить визуализацию глубоких сосудов или органов, он требует небольшой разрез на зонде. Зонд пучки состоят из десятков тысяч волокон, оптики микроскопа и фирменным разъемом точности. Схематическое представление показано на фиг.1.
Визуализация бедренной микрососудов
Мы классифицировали сети бедренной сосудистой крови в соответствии с диаметром сосудов (малый <15 мкм; большой> 15 мкм) по FCFM у мышей, которым вводили FITC-декстрана. Быстрое сужение сосудов (2 - 5 мин) мелких сосудов индуцировали доксорубицином. Полная disappearanCE от FITC-декстрана люминесцентные, 8 мин после доксорубицин лечение (2А например, стрелки, Видео 1). В нескольких мышей, уменьшение флуоресцентного сигнала в кровеносном сосуде и повысить сигнал окружающие его наблюдали в периваскулярной области, через несколько секунд после введения доксорубицина (2В г, стрелки). Эти результаты показывают, что увеличение проницаемости сосудов и утечки с высокой молекулярной массой декстрана от кровеносного сосуда на окружающие ткани. Нет сигнал флуоресценции не было очевидным после введения доксорубицина у мышей, которые не были ранее вводили с FITC-декстрана. Паклитаксел обработанных мышей показали, аналогичную структуру кровеносных сосудов и скорости потока, чтобы тем, которые наблюдаются в физиологический раствор вводили мышам (не показаны), в течение периода измерения.
Рисунок 1. FCFM конфокальной микроскопии используется здесь состоит из двух блоков: микрозондовый (mini0 / 30) и блок лазерного сканирования (LSU-488; 488 нм длина волны)..
Рисунок 2. Изображения FITC-декстрана сигнала флуоресценции в бедренной микрососудов. Сосуды дихотомически объявление несовершеннолетним (<15 мкм) или крупных (> 15 мкм) в соответствии с их калибра. Бедренной микрососудов из FITC декстрана (100 мкл; 10 мг / мл). Вводят мышам была отображена до и во время внутривенного введения либо доксорубицин или физиологическим раствором (А) Небольшие сосуды, отображаемого на FCFM, начали сосудосуживающего остро 2 мин после введения доксорубицина (е стрелка), показывая непрерывный сужение флуоресцентного сигнала до полного его исчезновения, без восстановления видимого выздоровления сигнала во время пвнутр восемь минут реального времени визуализации (G, стрелка). (Б) Внешний вид, в некоторых снимков, из "туманного" области вокруг кровеносных сосудов стенок химиотерапии вводили мышам (G стрелками) сразу же после инъекции, показывает потенциал утечки декстран-FITC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Видео 1. бедренной изображения микрососудов. Представитель фотографировали пленки FITC-декстрана флуоресцентного минор (<15 мкм в диаметре) кровеносных сосудов. Яичников и бедренной время микрососудов кругов фотографии: мышей, которым вводили 100 мкл FITC-декстрана (10 мг / мл) были обследованы и сфотографированы с момента внутривенного введения доксорубицина. 2 - 5 мин после инъекции доксорубицина, мелкие суда продемонстрировали резкое сужение сосудов с последующим полным упразднением флуоресцентного сигнала, уже 8 мин после ЛЕЧЕНИИт. (AVI) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Оценка вызванной химиотерапией сосудистой токсичности является сложной задачей из-за трудности в визуализации динамики сосудистой в ответ на раздражители в режиме реального времени. Многочисленные клинические исследования указывают на, что несколько химиотерапии привести к прямому повреждения сосудов, но механизм и характеристики этого токсичности еще предстоит выяснить. Мы установили в режиме реального времени, в естественных платформы молекулярной визуализации для оценки потенциальной токсичности сосудов химиотерапии у мышей, содержащих расслоенных конфокальной флуоресцентной микроскопии, как описано здесь 8-10. Это молекулярная визуализация с высоким разрешением мышей подходит для визуализации артериального потока крови и архитектуры судов. Это позволяет обнаруживать в реальном времени осложнений вызванных лечением в того же животного в течение длительного периода времени. Мы оценивали два класса: доксорубицин химиотерапии, которые, как известно, являются токсичными для эндотелиальных клеток в пробирке, а также в тканиы получают от животных, получавших доксорубицин 10-15, и паклитаксела в качестве контрольной химиотерапии, для которых первые свидетельства какой-либо сосудистого эффекта очень ограничено.
Лазерное сканирование конфокальной технология FCFM облегчает отслеживание флуоресценции окрашенных глубоких тканей на реальном времени и дает покадровой видео изображения кровеносных сосудов в естественных условиях 9. В нашем исследовании FCFM был использован для наблюдения острая сосудистая эффект доксорубицина, в качестве прототипа vasculotoxic агента. Этот эффект, который начался вскоре после введения доксорубицина, зависит от размера кровеносных сосудов: меньший диаметр судами, более известный ущерб. Флуоресценции сигнал малого диаметра (<15 мкм) сосуды уменьшается постепенно в результате постоянного сосудов, вызванного сужением доксорубицина. Нет очевидно восстановления не было обнаружено в ходе следующего 8 мин визуализации в реальном времени. Большой диаметр (> 15 мкм) судов были менее повреждены; Целостностьих стены были скомпрометированы, демонстрируя неровную поверхность. Эти эффекты были уникальными для доксорубицина и не были очевидны, когда была использована паклитаксел, указывающий, что эта методика очерчивает тщательно конкретный эффект препарата.
Изменения и устранение неисправностей
В течение протокола, мощность лазера может быть изменена во время записи исходных того, чтобы проиллюстрировать сосуды. Тем не менее, мощность лазера не может быть изменена в ходе эксперимента. Кроме того, высокая мощность лазера может отбелить флуоресценции агента во времени. Кроме того, после завершения записи, можно изменить контрастность фильма и редактировать его длину и скорость. Измерения сосудов может быть сделано, и изменения, которые происходят может следовать.
Ограничения техники и критических шагов
Устройство FCMF имеет несколько ограничений. Область интереса (ROI) может меняться в течениеВремя визуализации. Кроме того, в образ область может высохнуть; следует иметь площадь увлажненной. Флуоресценции агент может отбелить и сигнал будет потерян. Один важный шаг следует обратить внимание, это держать животное и датчик хорошо закреплены, чтобы избежать изменения рентабельности инвестиций.
Значение и будущие приложения
Создана экспериментальная платформа может служить в качестве теста на непосредственной реакции на химиотерапию или, альтернативно, в качестве потенциального биологического маркера, чтобы охарактеризовать профиль потенциала сосудистой токсичности. На основании изученного механизма сосудистой нарушений, этот способ также может быть полезным в будущем для оценки потенциальных агентов для снижения указано сосудистой токсичности, вызванной химиотерапией. Потребность в снижении потенциальных долгосрочных сосудистых осложнений у выживших рака заставляет нас исследовать механизм за вызванной химиотерапией сосудистой токсичности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| general anesthesia | Fort Dodge Animal Health, IA, USA and Biove Laboratories, France | 100 mg/kg ketaset and 6 mg/kg XYL-M2 | |
| depilatory cream (Veet) | ReckittBenckiser, Bristol, UK | ||
| 30 G, 1/2 inch needle attached to 1 ml syringe | |||
| FITC dextran (10 mg/ml; MW 2,000 kDa) | Sigma | FD2000S | 100 μl volume |
| Doxorubicin | Teva, Israel | 8 mg/kg, Adriamycin | |
| paclitaxel | Taro, Israel | 1.2 mg/kg, Medexel | |
| saline |
References
- Chow, A. Y., et al. Anthracyclines cause endothelial injury in pediatric cancer patients: a pilot study. J Clin Oncol. 24 (6), 925-928 (2006).
- Nuver, J., et al. Acute chemotherapy-induced cardiovascular changes in patients with testicular cancer. J Clin Oncol. 23 (36), 9130-9137 (2005).
- Vos, F. Y., et al. Endothelial cell effects of cytotoxics: balance between desired and unwanted effects. Cancer Treat Rev. 30 (6), 495-513 (2004).
- Kerbel, R. S., et al. 'Accidental' anti-angiogenic drugs. anti-oncogene directed signal transduction inhibitors and conventional chemotherapeutic agents as examples.Eur. J Cancer. 36 (10), 1248-1257 (2000).
- Soultati, A., et al. Endothelial vascular toxicity from chemotherapeutic agents: preclinical evidence and clinical implications. Cancer Treat Rev. 38 (5), 473-483 (2012).
- Tempelhoff, G. F., et al. Blood coagulation during adjuvant epirubicin/cyclophosphamide chemotherapy in patients with primary operable breast cancer. J Clin Oncol. 14 (9), 2560-2568 (1996).
- Ben Aharon, I., et al. Doxorubicin-induced vascular toxicity--targeting potential pathways may reduce procoagulant activity. PLoS One. 8 (9), e7515 (2013).
- Laemmel, E., et al. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
- Al-Gubory, K. H., Houdebine, L. M. In vivo imaging of green fluorescent protein-expressing cells in transgenic animals using fibred confocal fluorescence microscopy. Eur J Cell Biol. 85 (8), 837-845 (2006).
- Bar-Joseph, H., et al. In vivo bioimaging as a novel strategy to detect doxorubicin-induced damage to gonadal blood vessels. PLoS One. 6 (9), e23492 (2011).
- Kaushal, V., Kaushal, G. P., Mehta, P. Differential toxicity of anthracyclines on cultured endothelial cells. Endothelium. 11 (5-6), 253-258 (2004).
- Kim, E. J., et al. Doxorubicin-induced platelet cytotoxicity: a new contributory factor for doxorubicin-mediated thrombocytopenia. J Thromb Haemost. 7 (7), 1172-1183 (2009).
- Walsh, J., Wheeler, H. R., Geczy, C. L. Modulation of tissue factor on human monocytes by cisplatin and adriamycin. Br J Haematol. 81 (4), 480-488 (1992).
- Kotamraju, S., et al. Doxorubicin-induced apoptosis in endothelial cells and cardiomyocytes is ameliorated by nitrone spin traps and ebselen. Role of reactive oxygen and nitrogen species. J Biol Chem. 275 (43), 33585-33592 (2000).
- Vasquez-Vivar, J., et al. Endothelial nitric oxide synthase-dependent superoxide generation from adriamycin. Biochemistry. 36 (38), 11293-11297 (1997).
