Die Analyse der epithelialen Schäden Produziert von Published: June 12, 2014 doi: 10.3791/51668

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Abigail Betanzos¹, Michael Schnoor², Rosario Javier-Reyna¹, Guillermina García-Rivera¹, Cecilia Bañuelos³, Jonnatan Pais-Morales¹, Esther Orozco¹

¹Department of Infectomics and Molecular Pathogenesis, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, ²Department of Molecular Biomedicine, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, ³Agency for Knowledge Commercialization, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute

Summary

Die Infektion des Menschen durch Entamoeba histolytica führt zu Amöbenruhr, eine Hauptursache für Durchfall in tropischen Ländern. Infektion durch Pathogen-Interaktionen mit Darmepithelzellen eingeleitet, provoziert die Öffnung der Zell-Zell-Kontakte und somit Durchfall, manchmal gefolgt von Leberinfektion. Dieser Artikel bietet ein Modell, um die frühen Wirt-Pathogen-Interaktionen zu bewerten, um unser Verständnis der Pathogenese Amöbenruhr zu verbessern.

Abstract

Entamoeba histolytica ist der Erreger der menschlichen Amöbenruhr, eine Hauptursache für Durchfall und Leber Abszess in tropischen Ländern. Infektion durch Wechselwirkung des Pathogens mit Darmepithelzellen eingeleitet. Diese Wechselwirkung führt zu einer Störung der interzellulären Strukturen wie tight junctions (TJ). TJ sicherzustellen Abdichtung der Epithelschicht auf das Wirtsgewebe von Darmlumen trennen. Neuere Studien belegen, dass eine Unterbrechung der TJ durch die parasitäre Protein EhCPADH112 ist eine Voraussetzung für E. histolytica Invasion, die von epithelialen Barrierestörung begleitet wird. Eine Analyse der molekularen Mechanismen in TJ Demontage während E. beteiligten histolytica Invasion ist von größter Bedeutung für unser Verständnis der Pathogenese Amöbenruhr zu verbessern. Dieser Artikel stellt eine einfache Modell, das die Beurteilung der ersten Wirt-Pathogen-Interaktionen und den Parasiten Invasionspotential ermöglicht. Parameter analysiert werden umfassen transepithelial elektrischen Widerstand, Interaktion von EhCPADH112 mit epithelialen Oberflächenrezeptoren, Veränderungen in der Expression und Lokalisation von epithelialen Marker junctional und Lokalisierung von Parasiten Moleküle innerhalb Epithelzellen.

Introduction

Entamoeba histolytica ist eine einzelne Zelle des menschlichen Protozoen verantwortlich Amöbenruhr, eine Darminfektion, die Entzündungen und Durchfall. E. histolytica infiziert, bis zu 50 Millionen Menschen jährlich, aber nur etwa 10% der Infizierten entwickeln die Symptome zu Amöbenruhr ¹ zugeordnet. Infektion bei Einnahme von kontaminierten Lebensmitteln oder Wasser mit E. auftritt histolytica Zysten. Im Darm, Zysten produzieren Live-Trophozoiten, die zu Dickdarm-Mucin haften und sich vermehren ^2. Trophozoiten bilden Zysten, die in der Regel über Stuhl ausgeschieden werden. In anderen Fällen und für noch unbekannten Gründen Trophozoiten brechen die Darm Epithelschicht und dringen in das darunter liegende Gewebe. Im schlimmsten Fall, den Blutkreislauf gelangen und sie auf andere Organe wie die Leber ^3.

Brechen der epithelialen Barriere erfordert Störung der epithelialen transmembranalen Strukturen, die Zellen miteinander verbunden zu halten. EpithelzellenKontakte nach apikal junctional Komplex, bestehend aus fest (TJ) gebildet werden und Adhärenzverbindungen (AJ) und Desmosomen ^4. Die apikal Gänge sind TJ, und deshalb sind sie die erste Barriere, die durch E. beleidigt histolytica und einige andere Krankheitserreger während der Host-Invasion. TJ aus transmembranären Adhäsionsrezeptoren wie Claudinen, Occludin und junctional Adhäsionsmoleküle (JAM), die Homo-oder heterophile Interaktion mit Rezeptoren der benachbarten Zelle in Eingriff besteht. Sie werden intrazellulär durch Gerüstmoleküle der Zonula occludens (ZO)-Familie, die die Haftung Rezeptoren an Aktin-Zytoskelett eine Verbindung zu weiteren mechanischen Festigkeit des Epithels bieten gebunden. TJ sind für die Abdichtung Darmgewebe von den Darmlumen, eine übermäßige Wasser-und Stoffleck verantwortlich. So, nach TJ sind durch den Parasiten gestört, Gewebe eingedrungen. E. histolytica sondert mehrere Moleküle, wie: (i) die in Adhäsion Amöben targ beteiligtenet Zellen ^5; (Ii) die Membran-aktiven Faktoren, die an Tötung von Wirtszellen durch Exocytose, beispielsweise die Ionenkanal-bildende Peptide bezeichnet Amoebapores ^6,7; und (iii) Proteasen, die extrazelluläre Matrixproteine ​​abbauen und vermitteln Gewebe Zerfall ^5,8,9.

Die Cysteinprotease EhCP112 und das Adhäsionsmolekül EhADH112, die zusammen den Komplex bilden EhCPADH112 zwei E. histolytica Virulenz Proteine, die bei der Demontage von TJ ¹⁰ eine wichtige Rolle spielen. Live-Trophozoiten, ihre Gesamtlysate und sezernierten Produkte induzieren molekularen Veränderungen in der TJ komplexe und funktionelle Störung der epithelialen Barriere. In dieser Studie wird gezeigt, dass EhCP112 und EhADH112 Interaktion mit Occludin und Claudin-1-Proteine, die zu der Internalisierung und Abbau von Zellproteinen und erleichtert E. histolytica Eingang durch den parazellulären Weg.

Unsere Daten und die of anderen Gruppen ^11-17 stark darauf hin, die Notwendigkeit von spezifischen Wirt-Pathogen-Interaktionen, die Parasiteninvasion zu ermöglichen. Die Aufklärung der molekularen Grundlagen dieser Wechselwirkungen ist von größter Bedeutung für ein besseres Verständnis der Pathogenese Amöbenruhr. Selektive Störung des TJ-Trophozoiten, gekennzeichnet durch erhöhte parazelluläre Permeabilität kann durch eine Abnahme der transepithelialen elektrischen Widerstands (TER) gemessen werden. Die Übertragung von parasitären Proteinen in Richtung Host Epithelien kann durch Immunfluoreszenzfärbung und konfokale Lasermikroskopie, einer Methode, die auch Co-Lokalisation von Amöben Virulenzfaktoren mit Epithel-Junction-Markierungen, die mögliche direkte Interaktionen zeigen, bestimmt werden kann. In diesem Artikel beschreiben wir ausführlich, wie Epithelzellen und Trophozoiten angebaut, geerntet und manipuliert, um Wirt-Pathogen-Interaktionen und ihre Folgen zu untersuchen.

Protocol

1. Errichtung und Wartung von E. histolytica Kulturen

1. Wachsen axenisch (völlig frei von allen anderen Organismen kontaminiert) 1 x 10 ⁵ Trophozoiten von Entamoeba histolytica Belastung HML: IMSS Klon A ¹⁸ in 16 x 125 mm Kulturröhrchen mit Teflon-Liner Schraubkappen (oder 1 x 10 ⁶ Trophozoiten in einem Einweg-T- 25-Kolben) und 15 ml (oder 50 ml in T-25-Kolben) von TYI-S-33-Medium (TYI Brühe mit 3% Diamant-Vitamin-Mischung, 10% hitzeinaktiviertem Serum von erwachsenen Rindern, 0,5 IE / ml Penicillin und 35 ug ergänzt / ml Streptomycin) ¹⁹ in einem Brutschrank bei 37 ° C.
2. Ernte Trophozoiten während der logarithmischen Wachstumsphase, in der Regel bei 48-96 h Abständen (Fig. 1) durch Kühlen der Kulturröhrchen für 5-10 min in einem Eis-Wasserbad auf Trophozoiten an die Glaskulturröhrchen befestigt lösen.
3. Übertragen Sie die Kultur in einem konischen Rohr und invertieren es mehrmals, um die cel zerstreuenls. Bestimmen der Zellzahl mit einer Zählkammer (Neubauer-Kammer), und übertragen ein Inokulum in ein Kulturröhrchen mit frischem TYI-S-33-Medium.
   1. Verwenden geringen Anzahl von Amöben längere Inkubationszeiten (~ 3 × 10 ⁵ Zellen für ungefähr 5 Tage) und einer höheren Zahl für kürzere Zeiträume (~ 1 × 10 ⁶ Zellen für ca. 1 Tag). Während gezählt Inokula sind wünschenswert, etablierte Kulturen vorhersehbar, so dass geschätzte Volumen der Inokula sind möglich.
   2. Daraufhin wird die Menge des Trophozoiten zu Zellzahlen für jedes Experiment zu optimieren.
   3. Achten Sie auf eine parallel doppelte Kultur, eine Back-up im Falle einer unbeabsichtigten Kontamination oder Rohrbruch haben.
4. Cap Rohre dicht und inkubieren sie bei 37 ° C in einem 5 ° geneigt horizontalen Winkel.
5. Überprüfen Kulturen durch visuelle Inspektion regelmäßig, da ein übermäßiges Wachstum der Kultur können viele lysierten Zellen enthalten.

2. Errichtung und Wartung von MDCK Kultur </ P>

1. Wachsen MDCK (Madin-Darby Canine Kidney)-Zellen vom Typ I (hoher Widerstand) in Einweg-T-75-Flaschen mit 10 ml DMEM-Medium mit Penicillin (100 IU / ml), Streptomycin (100 mg / ml) ergänzt, Insulin (0,08 U / ml) und 10% Neugeborenenkälberserum, in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO ₂ und 95% Luft bei 37 ° C.
2. Um die Zellen aufgeteilt, überprüfen Sie sie auf einem inversen Mikroskop. Split-Zellen, wenn sie ~ 85-100% konfluent.
3. Verwenden Sie eine Vakuumsauger in einer sterilen Haube und einer sterilen Pasteur-Glaspipette Medien aus der Kultur zu entfernen. Um Kratzen Zellen zu vermeiden, schalten Sie den Kolben auf den Kopf und saugen Medien aus der unteren Ecke.
4. Verzichten 10 ml vorgewärmtem PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 1,8 mM KH ₂ PO _4, pH 7,4) in eine T-75-Kolben (5 ml im Falle eines T-25-Kolben ) und vorsichtig die Flasche Rock, um die Zellen zu waschen. Entfernen PBS durch Vakuum Aspiration. Ausgiebigem Waschen erforderlich ist, da Serum inhibiert Trypsin.
5. Streifen 1,5 ml 0,05% Trypsin in eine T-75-Kolben (für T-25-Kolben verwenden, 0,5 ml) und schaukeln die Flasche, um die Zellschicht mit Trypsin zu decken.
6. Inkubation für 5-10 min in den Inkubator (genaue Zeit hängt von Trypsin-Aktivität).
7. Check für Zellablösung von Holdingflasche gegen das Licht und suchen fließt Zellen. Zellablösung (abgerundete Zellen) kann auch unter Verwendung eines Mikroskops überprüft werden. Oft Zellen schneller lösen mit einer schnellen, sanften Klaps auf die Seite des Kolbens.
8. 15 ml DMEM, ergänzt mit einem T-75-Kolben (5 ml für eine T-25-Kolben). Die Zellen durch Auf-und Abpipettieren 4 oder 5 mal.
9. Um Zellen zu propagieren, verdünnte Zellsuspension 1:5 mit frischem DMEM ergänzten. Cells Nummer kann auch an dieser Stelle mit einer Zählkammer bestimmt werden, aber dies ist in der Regel nur notwendig, wenn die Spaltung Zellen in speziellen Formaten für bestimmte Tests.

3. Vorbereitung der Trophozoiten Gesamt Lysate

1. Nehmen Trophozoiten von culture Rohre durch Abkühlen des Rohres für 5-10 min in einem Eis-Wasser-Bad. Übertragung der Kultur aseptisch in einem konischen Röhrchen und Zentrifugieren bei 360 × g für 10 min bei 4 ° C. Vorsichtig den Überstand verwerfen durch Dekantieren, fügen eiskaltem PBS zu dem Pellet, das Röhrchen mehrmals, um die Zellen wieder und Zentrifuge bei 360 g für 10 min zu zerstreuen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, um alle Spuren von TYI-S-33-Medium zu entfernen.
2. Bestimmen Sie Trophozoiten Zahl mit einer Zählkammer.
3. Lyse Trophozoiten durch Frost-Tau-Zyklen. Snap-einfrieren eine gemessene Inokulum von Trophozoiten (600.000 Trophozoiten / ml) in eiskaltem PBS verdünnt, in flüssigem Stickstoff für 1 min. Unfreeze die Probe bei 4 ° C und kräftig vortexen. Wiederholen Einfrieren und Auftauen 3 mal zu Zell-Lyse zu vervollständigen.
4. Aktivieren Sie in den Lysaten mit 0,02% β-Mercaptoethanol vorhandenen Proteasen.

4. Vorbereitung der Trophozoiten Secreted Produkte

1. Führen Sie die Schritte 3.1 und 3.2.
2. BestimmenAnzahl Zellen und Lebensfähigkeit an dieser Stelle mit einer Zählkammer und Anlegen einer Trypanblau-Ausschluss-Test ^20:
   1. Verdünnen 9 x ¹⁰ &sup6; Trophozoiten in 3 ml eiskaltem PBS und Transfer-Zellen in einem 50 ml konischen Röhrchen. Nehmen Sie sich 10 ul dieser Suspension und fügen 1 ul von 0,4% Trypanblau-Stammlösung pH 7,2.
   2. Verwenden Sie eine Neubauer-Kammer, um Zellen bei geringer Vergrößerung zu zählen.
   3. Zählen Sie alle Zellen und trennen Sie die Anzahl der blauen Zellen, da blauen Zellen haben den Farbstoff genommen und muss als tot betrachtet werden.
   4. Berechnen des Prozentsatzes von lebensfähigen Zellen, indem die Anzahl der lebensfähigen Zellen von der Gesamtzahl der Zellen und mit 100 multipliziert.
3. Übertragung der konischen Röhrchen, die Trophozoiten Suspension in den Inkubator bei 37 ° C für 2 h in einem 5 ° geneigt horizontalen Winkel.
4. Um die Produkte abgesondert, Zentrifugenröhrchen bei 360 g für 10 min zu sammeln. Verwenden Sie eine Einweg-und sterile Spritze und sorgfältig sammeln supernatant, Vermeidung von Kontamination der Proben mit Trophozoiten aus dem Pellet. Beseitigen Sie alle Zellen übertragen, indem der Überstand durch ein 0,22 um Celluloseacetat-Membran. Aktivieren Proteasen mit 0,02% β-Mercaptoethanol.
5. Um vermeintliche unerwünschte Verunreinigung mit Molekülen aus toten Zellen freigesetzt zu verwerfen, erneut die Trypanblau-Ausschluss-Test für die Lebensfähigkeit der Zellen. Und die Gesamtzahl lebensfähiger Zellen sollten die gleichen sein wie in Schritt 4.2 erhalten. Ist dies nicht der Fall ist, kann der Überstand gesammelt enthalten nicht nur sekretierte Proteine ​​und sollte verworfen werden.

5. Interaktion von MDCK-Zellen mit Trophozoiten, Trophozoiten Lysate oder Secreted Produkte

1. Inkubieren konfluenten MDCK Zellmonoschichten mit Live-Trophozoiten (ein MDCK-to-Amöbe Verhältnis von 1:1), Trophozoit Lysate (ein MDCK-to-Amöbe Verhältnis 1:2) oder sezerniert Produkte (ein MDCK-to-Amöben-Verhältnis von 1 : 10) bei 37 ° C für 2 min und 30 (Fig. 2A).
2. Waschen Epithelzellen fünfmal mit eiskaltem PBS, um ungebundene Moleküle oder Trophozoiten zu beseitigen.

6. Herstellung von Proben für die Immunfluoreszenz

1. Kultur MDCK Zellen auf sterile Deckgläschen in einer 24-Multiwell-Zellkulturschale gegeben. Überprüfen Sie die Zellen auf dem inversen Mikroskop, bis sie 100% des Zusammenflusses zu erreichen. Dann ersetzen Medium mit 1 ml frischem DMEM-Medium, ergänzten und übertragen Sie die Platte mit einem 37 ° C Inkubator für 24 h mehr.
2. Entfernen des Mediums unter Verwendung einer Vakuumpumpe und einer sterilen Pasteurpipette aus Glas und 1 ml warmem PBS zu jeder Vertiefung. PBS entfernen und wiederholen Sie die Wäsche mit frischem PBS. Achten Sie darauf, Zellen vom Boden der gut mit der Glaspipette zu kratzen.
3. In verschiedenen Bedingungen von Trophozoiten in 1 ml warmem PBS: Live-Trophozoiten (T), Trophozoit Gesamtlysate (TL) und sezerniert Produkte (SP).
   1. Setzen Sie die Kulturplatte im Brutschrank für 2 oder 30 min.
   2. Bereiten Sie zwei Kontrollbedingungen: eine namens Zeitpunkt 0 min, wobei MDCK-Zellen sollten nicht mit E. inkubiert werden histolytica, sondern nur mit 1 ml warmem PBS; und ein anderer Zustand als Sekundärantikörper Steuerung, in diesem Fall inkubieren MDCK mit T, TL oder SP 2 oder 30 min und lassen Inkubation mit primären Antikörpern.
4. Waschen Epithelzellen fünfmal mit kaltem PBS, um ungebundene Moleküle oder Trophozoiten zu beseitigen.
5. Beheben und Permeabilisierung der Zellen mit 1 ml 96% Ethanol für 30 min bei -20 ° C.
6. Um Ethanol zu entfernen, führen drei Schnellwaschschritten mit 1 ml PBS bei Raumtemperatur.
7. Führen Sie die folgenden Schritte in einer feuchten Kammer, um Austrocknen der Proben zu vermeiden:
   1. Verwenden Sie einen flachen Kasten verfügbar, die geschlossen und mit einem feuchten Papiertuch auf dem Proben kann sicher gestellt werden, gefüllt werden kann. Beispielsweise dient eine leere Pipettenspitze Feld diesen Zweck sehr gut.
   2. In der Kammer, gleichmäßig legen Parafilm Schicht und Pipette 25 ul Blocking (0,5% BSA) für jede Deck.
   3. Nehmen Deckgläser aus den Brunnen mit einer feinen Pinzette vorsichtig entfernen überschüssige Flüssigkeit vom Rand mit einem Filterpapier und legte Deckglas in den Tropfen enthalten Blocking-Lösung (0,5% BSA) mit den Zellen vor der Blockierlösung. Inkubieren der Proben für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
8. Vorbereitung einer Mischung von primären Antikörpern in PBS: IgM Maus-Anti-EhCPADH112 (M &agr;-EhCPADH112, 1:10 Verdünnung) und IgG Kaninchen anti-ZO-1 (P &agr;-ZO-1, Verdünnung 1:100).
9. Legen Sie ein neues Blatt Parafilm in der feuchten Box und Pipette 25 ul Antikörper-Lösung für jedes Deckglas.
10. Heben Sie die Deckgläser aus der Sperr Lösung, trocknen überschüssige Flüssigkeit an den Rändern mit einem Filterpapier und legen Sie sie in den Tropfen mit den Zellen vor der Antikörperlösung. Die Proben über Nacht bei 4 ° C inkubieren
11. Setzen jedes Deckglas in eine Vertiefung einer 24-Multiwell (Zellseite nach oben) und 1 ml PBS.
12. Vorbereitung einer Mischung von fluoreszierenden sekundären Antikörpern in PBS: Ziege-anti-Maus-IgM-FITC gekoppelt (1:100 Verdünnung) und Ziege-anti-Kaninchen-IgG zu TRITC (1:50 Verdünnung) gekoppelt ist.
13. Legen Sie ein neues Blatt Parafilm in der feuchten Box und Pipette 25 ul der Sekundärantikörper-Lösung für jedes Deckglas.
14. Übertragen Sie die Proben in 6,10 und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur im Dunklen, um die Bleich der fluoreszierenden Farbstoffe zu vermeiden. Wiederholen Sie Schritt 6.11.1.
15. Für die Kernfärbung, Inkubation für 3 min mit 200 ul 0,05 mM DAPI-Lösung bei Raumtemperatur und vor Licht schützen. Wiederholen Sie Schritt 6.11.1.
16. Um die Fluoreszenzfarbstoffe zu sparen, setzen Sie die Deckgläser (Zellen nach unten) in 5 ul Vecta Schild Antifade Montagelösung auf Glasobjektträgern. Verschließen Sie die Deckgläser mit Nagellack Probe Austrocknen zu verhindern.
17. Für langfristige Lagerung, halten Sie gleitet in eineMikroskop-Objektträger-Box bei -20 ° C
18. Analysieren Vorbereitungen durch konfokale Mikroskopie durch Z-Stapel-Sektionen und xz-Ebenen (2A).

7. Inkubation von Trophozoiten mit Protease-Inhibitoren oder spezifische Antikörper

1. Wiederholen Sie die Schritte 3.1 und 3.2. Für jede experimentelle Bedingung, Inkubation 1 x 10 ⁵ Trophozoiten (in 50 &mgr; l PBS resuspendiert) mit Proteaseinhibitoren (1 mM Vollständige und 40 &mgr; g / ml E-64) oder 30 &mgr; g monoklonalem Antikörper gegen EhCPADH112 (mαEhCPADH112) ²¹ für 20 min bei 4 º C (Fig. 2B). Mit diesen Vorbereitungen für Co-Inkubation Assays wie in Schritt 8.5 beschrieben.

8. Messung des transepithelialen elektrischen Widerstandes (TER)

1. Kultur MDCK Zellen auf sterile Transwell durchlässigen Träger (0,4 um Porengröße). In der oberen Kammer gibt man 100 ul der Zellsuspension und im unteren Fachlegen 600 ul DMEM-Medium ergänzt.
   1. Überprüfen Sie die mittlere Ebene in regelmäßigen Abständen. Frisches Medium kann nach Bedarf zugegeben werden.
   2. Überprüfen Sie die Zellen auf einem inversen Mikroskop, bis sie 100% der Zusammenfluss erreichen. Ändern Medium alle 2-3 Tage.
   3. Zur Verbesserung der Zellen (falls erforderlich), die ins Gleichgewicht Transwell-Filter über Nacht bei 37 ° C in DMEM vor Zugabe der Zellsuspension.
2. Sterilisieren STX2 Elektroden in der Haube durch Eintauchen in Ethanol und dann in sterilem PBS für 15 Minuten jeweils, unter UV-Licht. Schließen Elektroden mit einer EVOM epithelialen voltohmmeter und wählen Widerstandsmodus.
3. Sammeln Medium aus dem oberen Fach der einzelnen Transwell und bündeln sie. Bis zu 50 &mgr; l dieser Mischung Medien und es mit 50 ul Trophozoiten Suspension (1 x 10 ⁵ Trophozoiten in PBS) oder nur mit PBS (Kontrolle). Verwenden Sie eine ähnliche Mischung für jeden Transwell.
4. In Mischungen mit der oberen Kammer eines jeden Transwell containing die MDCK-Zellen. Versuchsbedingungen gehören MDCK Zellen ohne Trophozoiten (Kontrolle), eine Co-Kultur mit Trophozoiten oder Trophozoiten mit Proteaseinhibitoren oder mαEhCPADH112 vorinkubiert. Um den Widerstand von Filtern versehen zu beseitigen, verwenden Transwells nur mit Medium inkubiert. Für jede Versuchsbedingung Verwendung mindestens drei Transwells.
5. Sofort messen TER durch Eintauchen der Elektroden in jedem STX2 Transwell.
   1. Sicherzustellen, dass die längere Elektrode den Boden der unteren Kammer berührt, und dass die kürzere Elektrode von Medium in der oberen Kammer abgedeckt (siehe Fig. 2B).
   2. Stellen Sie sicher, dass die Elektroden senkrecht jeder Zeit zu halten. Dadurch wird die Reproduzierbarkeit zu verbessern, deutlich. Vermeiden Sie es, oder Kippen der Elektrode während der Messungen, da dies zu Veränderung von Daten führen.
6. Diese Messung sollte als die erste TER-Wert werden. Dann überwachen die TER während des folgenden30 min.
7. Um die endgültige TER-Wert zu berechnen, subtrahieren Sie die TER-Wert von nur Filter. Um die Ergebnisse von verschiedenen Experimenten vergleichen normalisieren jeden Datenpunkt auf die Ausgangswerte, wobei diese als 100% (Abbildung 2B).

Representative Results

Für eine erfolgreiche E. histolytica Kultur, müssen zwei wichtige Bedingungen erfüllt sein: Wachstum in axenischen Bedingungen und Ernte im logarithmischen Phase. Zuvor Kulturen von E. histolytica wurden leicht in Verbindung mit bestimmten Arten von Bakterien oder Trypanosomatiden ²² etabliert. Allerdings ist es heutzutage üblich, axenischen Anbau dieser Parasiten bedeutet eine unbestimmte Subkultivierung von Amöben in einer Umgebung frei von metabolisierenden Bakterien, Pilze, Protozoen, oder Metazoen-Zellen haben. Darüber hinaus ist entscheidend, die Ernte der Trophozoiten in der späten logarithmischen frühen stationären Wachstumsphase, um lebensfähige und wuchernden Zellen haben ^23. Daher ist es wichtig, diese Phase durch Quantifizierung der Trophozoiten an mehreren Tagen und auch durch die Untersuchung ihrer intakte Morphologie und schnelle Fortbewegung (Fig. 1) zu unterscheiden.

Für Interaktionsstudien, müssen Epithelzellen zu seinin einer konfluenten Monoschicht auf physiologische Bedingungen, Amöben normalerweise im Körper auftreten darstellen. Mehrere epithelialen Zelllinien, leicht zu kultivieren, stehen zur Verfügung. Während eine weitere physiologische Zellmodellsystem würde aus dem Darm wie Caco-2 oder T84 ableiten, wachsen diese Zelllinien eher langsam. Ein schneller wachsenden Zelllinie, die intensiv untersucht worden sind MDCK Zellen ^24. Diese Epithelzellen der Niere Herkunft und zeichnen sich durch hohe TER, starke TJ und einfachen Anbau gekennzeichnet. Diese Zelllinie ist seit Jahrzehnten zur Zellbiologie von Kreuzungen und TJ Zusammensetzung sowie Mechanismen der TJ Montage und Demontage zu studieren. Aus diesen Gründen MDCK Zellen werden häufig von Forschern bei der Untersuchung TJ Funktionen gewählt. MDCK-Zellen wurden ebenfalls häufig als Modell für die Untersuchung der Mechanismen während Amöbiasis ^{5,8,10,25-28,} ausgelöst werden. In einer neueren Studie berichteten wir, dass die Interaktion von Stamm I MDCK-Zellen und Darmepithelzellen Caco-2-Zellen mit live Amöben, und Amöben Lysate Produkte verursacht ähnliche Auswirkungen auf die Zusammensetzung und TJ TER ^10. So MDCK-Zellen sind ein geeignetes Modell, um Mechanismen der Amöben-Epithel-Interaktionen zu untersuchen. Weiterhin ist die Verwendung von mehreren E. histolytica Produkte (intakte Trophozoiten, Trophozoit Gesamtlysate oder sekretierte Produkte als Trophozoiten Kulturüberstand geerntet) ist entscheidend, um zusätzliche und relevante Informationen über Moleküle in diesen Wechselwirkungen beteiligt, wie Verfügbarkeit, Wirkung, Sekretion Beteiligung von anderen Molekülen und Auslösen liefern Signalwege.

Während Erreichen der Konfluenz, Epithelzellen bilden Kontakte, die von TJ und AJ stabilisiert werden. Diese Strukturen werden von bestimmten Molekülen, die mit spezifischen Antikörpern im Immunfluoreszenzfärbungen visualisiert werden kann besteht. Zum Beispiel in Fig. 3, Zellkontakte durch einen Antikörper gegen den Marker TJ ZO-1 und eine rote Fluoreszenz visualisiert Laboreled sekundären Antikörper. Da kann man sehen, versammeln sich Zellen in unmittelbarer Nähe zu einem dichten Monolayer ohne Loch zu bilden. In dieser Figur hat die amöben abgeleitet EhCPADH112 Komplex mit einem monoklonalen Antikörper, der von einer grünen Fluoreszenz-markierten sekundären Antikörpers nachgewiesen wird, um die Wechselwirkung des Komplexes mit der Epitheloberfläche studieren angefärbt. Drei verschiedenen Quellen dieses Komplexes wurden dem epithelialen Monoschicht angewendet: Live Trophozoiten (T), Trophozoiten Gesamtlysate (TL) und sezernierten Produkte (SP). Auffallend ist, in allen Fällen, Co-Lokalisation von EhCPADH112 mit ZO-1 beobachtet werden (Abbildung 3, Pfeile), was darauf hinweist, dass dieser Komplex benötigt werden könnten, um E. erleichtern histolytica Eindringen in den Epithelzellen-Monoschicht.

Obwohl diese Wechselwirkung kann bereits so früh wie 2 min nach amöben epithelialen Zell-Kontakt beobachtete werden, die Zellschicht noch nicht von dieser Wechselwirkung beeinflußt, da die ZO-1-Färbung sieht noch continuierliche. Dies ändert sich vollständig nach längeren Inkubationszeiten wie in Fig. 4 gezeigt. Hier wurden Bilder nach 30 Minuten der Exposition gegenüber den drei verschiedenen EhCPADH112 Quellen. Eine klare Störung der TJ wird von einem diskontinuierlichen ZO-1-Färbung im Zellgrenzen (Abbildung 4, Pfeile) visualisiert, wobei der Effekt am deutlichsten in MDCK Zellen vorkommende in Kontakt mit T oder TL. Dagegen ZO-1 wird verinnerlicht und wird in intrazellulären Vesikeln zu sehen. Genaue Kolokalisation mit entweder TJ oder AJ entlang der Seiten Zellmembranen nicht bei einem Blick auf die Oberseite der Monoschicht, sondern indem eine "Seite"-Ansicht der Zellkontakte ²⁹ unterschieden werden. Konfokale Lasermikroskopie ermöglicht eine solche Ansicht entlang der xz-Achse, wie in Fig. 3 und 4 unter jeder xy-Ansicht gezeigt. Diese Bilder zeigen eine klare Aussage, ob Proteine ​​co-lokalisiert mit TJ am apikalen Teil der Seiten Membran oder, wenn sie nicht entfernt werdenTJ unten oder oben TJ an der apikalen Membran. In 3 (Pfeilspitzen), eine genaue Co-Lokalisation des EhCPADH112 Komplex mit ZO-1 beobachtet werden, deutlich enthüllt TJ als Ort der Aktion für diese Virulenz-Faktor. Im Gegensatz dazu, wie E. histolytica Invasion voran (30 min Wechselwirkungen) in die Epithelien durchdrungen EhCPADH112 zu den interzellulären Raum, wie die Färbung entlang der seitlichen Membran zeigte (Fig. 4, Pfeilspitzen). In unserer jüngsten Papier, erlaubt diese Methode uns, zwischen TJ und AJ zu unterscheiden, da dieser Komplex nur mit dem TJ-Marker Occludin und Claudin-1, aber nicht mit der AJ-Marker β-Catenin bei 2 min ¹⁰ der Interaktion co-lokalisiert.

Internalisierung von TJ-Komponenten, wie in der Immunfluoreszenzfärbungen in Fig. 4 zu sehen ist, wird in der Regel durch einen Verlust der Barrierefunktion, die von transepithelialen elektrischen Widerstands (TER) gemessen werden kann, begleitet. TERspiegelt den Ionenfluss durch die Monoschicht epithelialer und kann unter Verwendung von Elektroden, wie in 2B gezeigt, gemessen werden. Wenn die Monoschicht noch nicht vollständig ausgebildet oder durch extrazelluläre Signale gestört wird eine freie Strömung der Ionen durch die Zellschicht mit einer niedrigen TER angegeben. TER wurde einer Steuer konfluenten Monolayer, die nicht in Kontakt mit Amöben Produkte oder Monoschichten in Kontakt mit Trophozoiten (Fig. 5) wurde gemessen. Parasite Kontakt gestört Epithelzellen durch eine TER Abfall von 90% im Vergleich zu den Kontrollmonoschichten angegeben Barrierefunktion. Um die Mechanismen, durch die Trophozoiten beeinflussen Barrierefunktion untersuchen, haben wir vorinkubiert die Trophozoiten mit einem Antikörper gegen EhCPADH112, um die Haftung des Komplexes oder mit Protease-Inhibitoren zu verhindern, um die proteolytische Aktivität von diesem Komplex und anderen Proteasen wichtig für Zielzellschäden zu blockieren. Beide Behandlungen führten zu einer fast vollständigen Auflösung der TER Tropfen, was darauf hindeutet, dass sowohl proteolytischen Aktivität und Klebeeigenschaften sind wichtige Virulenzfaktoren von diesem Komplex während E. histolytica Invasion.

Abbildung 1. Typische Wachstumskurve von E. axenisch kultiviert histolytica-Trophozoiten. Inokula von 2 x 10 ⁵ Trophozoiten von E. histolytica HMI-IMSS Klon A wurden in 6-Well-Platten mit TYI-S-33-Medium und nach jeweils 24 h Zellzahlen wurden mit einem hematocytomer bestimmt. Zellwachstum wurde durch Lichtmikroskopie und die Morphologie der wachsenden Zellen überwacht wird, in dem oberen Feld dargestellt. Die Höhe der Trophozoiten wurde für 6 Tage (d) überwacht und Werte wurden in der folgenden Tabelle dargestellt. Die Daten stellen den Mittelwert und die Standardabweichung vom Mittelwert von drei unabhängigen Messungen. Bar = 10 um./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51668/51668fig1highres.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Schematische Darstellung der Wechselwirkungen zwischen Zellen und MDCK unterschiedlichen Bedingungen von E. histolytica. A) Abweichende Bedingungen des E. histolytica zeigen: Live Trophozoiten (T) insgesamt Trophozoiten Lysate (TL) und Moleküle von Trophozoiten in das Medium (SP) sezerniert. Jede Versuchsbedingung wurde für 2 und 30 min Inkubation mit konfluenten MDCK-Zellen untersucht. Nach der Inkubation wurden MDCK-Zellen reichlich gewaschen, um ungebundenen oder Trophozoiten parasitären Moleküle zu entfernen. Dann wurden die Proben für Immunfluoreszenztests verarbeitet, beschäftigt mαEhCPADH112 und pαZO-1-Antikörn Co-Lokalisierung der parasitäre komplexen EhCPADH112 und die TJ-Marker ZO-1 auf. Später artspezifischen Sekundärantikörper an unterschiedliche Fluorochrome gekoppelt wurden verwendet, um die beiden Proteine ​​durch konfokale Mikroskopie erfassen B.) Zugabe von Trophozoiten nur oder Trophozoiten mit mαEhCPADH112 oder Protease-Inhibitoren für 20 min vorinkubiert bei 4 ° C in das obere Kompartiment der Transwells enthält konfluenten MDCK-Zellen. TER von Epithelzellen wurde mit einem STX2 Elektrode mit einem EVOM voltohmeter während 30 Minuten verbunden ist, überwacht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Lokalisierung von EhCPADH112 bei TJ von MDCK-Monoschichten. MDCK-Zellen wurden incuLive-Trophozoiten (T) insgesamt Trophozoiten Lysate (TL) und Moleküle durch Trophozoiten in das Medium (SP) für 2 min gebeizt sezerniert. Oberplatte: Phasenkontrastaufnahmen von MDCK-Zellen. EhCPADH112 und ZO-1 Proteine ​​wurden durch mαEhCPADH112 und pαZO-1-Antikörper identifiziert und dann mit FITC-und TRITC-Sekundärantikörper auf. Die Zellkerne wurden mit DAPI gefärbt. Pfeile: Proteinlokalisierung in Zellgrenzen. Pfeilspitzen in xz-Ebenen: Proteinlokalisierung bei TJ. Bar = 10 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. Internalisierung von EhCPADH112 in MDCK-Zellen. MDCK-Zellen wurden mit lebenden Trophozoiten (T) insgesamt Trophozoiten Lysate (T inkubiertL) und Moleküle von Trophozoiten für 30 min in das Medium sezerniert (SP). Oberplatte: Phasenkontrastaufnahmen von MDCK-Zellen. EhCPADH112 und ZO-1 Proteine ​​wurden durch mαEhCPADH112 und pαZO-1-Antikörper identifiziert und dann mit FITC-und TRITC-Sekundärantikörper auf. Die Zellkerne wurden mit DAPI gefärbt. Pfeile: Proteinlokalisierung in Zellgrenzen. Pfeilspitzen in xz-Ebenen: Proteinlokalisierung an seitlichen Membran (Pfeilspitzen). Bar = 10 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

5. E. histolytica über EhCPADH112 induziert epithelialen Barrierestörung. MDCK-Monoschichten wurden mit Live-Trophozoiten inkubiert(T) oder T mit Protease-Inhibitoren (PI) oder mαEhCPADH112 Antikörper (α) für 30 min und TER wurde zu den angegebenen Zeiten ausgewertet vorinkubiert. TER wurde nach dem Anfangswert für jede Transwell normalisiert (~ 3.200 Ω · cm ^2). Mittelwerte und Standardabweichungen der Mittelwerte werden für jeden Zeitpunkt dargestellt. Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism 5 Software mit One-Way-ANOVA-Test durchgeführt. *** P <0,001.

Discussion

Um in vitro Wirt-Pathogen-Interaktionen während epithelialen Infektion durch E. studieren histolytica, ist es entscheidend, mit etablierten Kulturen beider Epithelzellen und Trophozoiten zu arbeiten. Zum Beispiel, früher, E. histolytica Kulturen waren in der Regel in Verbindung mit bestimmten Arten von Bakterien oder Trypanosomatiden ^22,23 etabliert. Jedoch Kokultivierung von E. histolytica Kulturen ist kontraproduktiv für das Studium der Wirt-Pathogen-Interaktionen, weil beobachteten Auswirkungen auf die Wirtszellen konnten nicht eindeutig auf die ameobas zugeschrieben werden, sondern könnte ein Effekt der Co-kultivierten Zellen eher. Somit wird eine Kultur von E. axenical histolytica ist für die Prüfung von bestimmten Host-Pathogen-Interaktionen wünschenswert. Die vorgesehenen Protokoll beschreibt, wie eine solche axenischen Anbau von E. histolytica erreicht werden, um solchen Kulturen für Infektionsstudien gezielt zu nutzen. Zusätzlich ist die Zeitder Ernte von E. histolytica ist ebenfalls kritisch. E. histolytica Ernte während der späten Stadien der exponentiellen Wachstums empfohlen, um eine hohe Ausbeute an Zellen mit hoher Rentabilität zu gewährleisten.

Auf der anderen Seite, ist eine gut etablierte Monolayer von Epithelzellen auch zwingend, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Um eine physiologisch eng epithelialen Mono emulieren, müssen kultivierten Zellen im richtigen Timing verwendet werden. Die Monoschicht muss vollständig ohne Löcher ausgebildet werden. Darüber hinaus die korrekte Bildung von TJ und AJ erfordert einige Zeit nach der Zellkontakte etabliert sind. Normalerweise Epithelzellen sind kontakt gehemmt, was bedeutet, dass die Zellen zu stoppen wuchernden in einem Monolayer, so dass es in der Regel besser auf die Zellen geben einen weiteren Tag des Wachstums. Dies sollte jedoch nicht erweitert werden, da diese Kontakthemmung nicht unbestimmt und Zellen an einem Punkt beginnen, einander zu überwuchern. Wenn dies beobachtet wird es notwendig sein wird, geteilt oder ScheibenStandardzellen und verwenden sie in Tests. Die Bildung von Epithelzellen dichten Monolayer wird am besten durch Messung TER gesteuert. Dies erfordert jedoch das Wachstum in Transwell-Filtern, die ziemlich teuer sind. Um ein Auge für eine gute Monoschicht entwickeln kann es hilfreich für den unerfahrenen Experimentator das Zellwachstum in der gleichen Anbau Format vergleichen Verbreitung nach verschiedenen Zell Zahlen sein.

Der Zeitpunkt der Wirt-Parasit-Interaktion Assay ist ein weiterer entscheidender Faktor. Nach 2 min der Interaktion, konnte kein Epithelschädigung beobachtet werden, sondern ein Zusammenspiel von EhCPADH112 mit dem TJ-Molekül ZO-1 war bereits erkennbar. Jedoch nach 30 Minuten Wechselwirkung wurde schweren Epithelschädigung beobachtet, wie durch TJ Demontage und einem Tropfen TER ⁽¹⁰ und dieser Untersuchung) angegeben. Diese Daten legen nahe, dass eine frühzeitige Haft Wechselwirkung mit dem apikalen epithelial ist notwendig, um die Kontakte zu lösen und damit das Eindringen von anderen Molekülen, wie Proteasen, die dann dazu beitragen,Abbau anderer TJ, AJ und Desmosomen Molekülen. Die Konzentration der Proteine ​​Trophozoiten ist ebenfalls wichtig. Zu beachten ist, könnte zu unterschiedlichen Ergebnissen bei der Anwendung Live Trophozoiten oder einfach nur Lysate oder sekretierte Produkte von E. beobachtet werden histolytica. Der relative Anteil an Trophozoiten an Epithelzellen wurde zuvor nachgewiesen und ^10, selbst wenn das Verhältnis von MDCK-zu-sezernierten Produkte durch Amöben war hoch (1,10), war der epithelialen Schaden nicht so streng. Dies zeigt nicht nur, dass die Konzentration eines einzelnen Virulenz Protein ist entscheidend, sondern, dass es auch das Zusammenspiel der verschiedenen Faktoren, die in effektiven epithelialen Schäden an schnellen Invasion der Amöben ermöglichen führen können. Zum Beispiel hervorgehoben Chadee Gruppe die Bedeutung eines anderen Amöbe abgeleiteten Protease, EhCP5, um Epithelschädigung ¹⁶ entlocken. Es scheint wahrscheinlich, dass ein Zusammenspiel von Virulenzfaktoren in vivo erforderlich, um Amöbenruhr zu induzieren und dass fehlende Interaktionen aufgrund inhibition eines einzelnen Proteins kann die Tatsache, dass in den meisten Fällen Infektionen Ruhe ausmachen. In diesem Zusammenhang ist es auch wichtig zu erwähnen, dass epitheliale Produkte wie Mucine sind wichtig, um vor Infektionen zu schützen. Insbesondere mucin2 Knock-out-Mäuse sind anfälliger für EhCP5 TJ-induzierte Veränderungen und Infektionen ^16. So müssen auch Veränderungen auf der epithelialen Seite als Amöbe Invasivität beurteilen.

Eine wichtige Beschränkung der beschriebenen Technologien Kolokalisation erkennen ist, dass es nicht eindeutig belegen eine direkte Interaktion. In diesem Fall könnte eine Kolokalisation oder Wechselwirkung auch durch ein anderes Protein, das gerade nicht sichtbar ist, vermittelt werden. Um eine direkte Interaktion zu erfassen, wird es notwendig sein, um rekombinante markiert (z. B. GST oder 10xHis) Proteine ​​produzieren und führen zu einer Immunpräzipitation und Western-Blot-Tag für den anderen. Wie auch immer, haben Immunfluoreszenzfärbungen den Vorteil, dass deutlich wird, exact zelluläre Lokalisation des Proteinkomplexes und geben der Experimentator eine Vorstellung von den Proteinen, die in solchen in vitro-Interaktionsassays getestet werden sollte. Ein weiterer Nachteil ist, dass es nur wenige Amöben-spezifische Antikörper zur Verfügung. Wenn also eine bestimmte Amöben Proteine ​​in solchen Interaktionsstudien studieren will, wird es wahrscheinlich erfordern die Erzeugung eines Antikörpers. Allerdings, wenn Antikörper verfügbar sind, können die beschriebenen Methoden angewendet werden, um die Relevanz der anderen Amöben Proteine ​​(abgesondert oder oberflächengebundenen) für Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen.

Dieses Papier beschreibt eine einfache Modell zur Co-Lokalisierung und Wechselwirkungen zwischen den Molekülen der Wirt und Parasit zu erkennen. Das Wissen aus diesen zellbasierten Experimenten gewonnen kann in in vivo Infektionsmodellen mit Hamster oder Mäuse, die physiologische Relevanz für Host-Invasion durch den Parasiten bestätigen angewendet werden. Diese Daten könnten dann für die Entwicklung neuer Behandlungs stra verwendet werdengien.

Zusammenfassend stellen wir ausführliche Protokolle für die Kultivierung von E. histolytica und Epithelzellen für den Einsatz in der Wirt-Pathogen-Interaktionsstudien, insbesondere Tests, die Auswertung der Co-Lokalisation und TJ Demontage zu ermöglichen. Das Timing der Kulturen sowie die von jedem Test ist wichtig, um die Reproduzierbarkeit der erhaltenen Ergebnisse sicherzustellen. Während die Zeitsteuerung der Kulturen kann durch Variieren der Anzahl von disseminierten Zellen beeinflusst werden, das Timing der Versuche selbst hängt von der Art des Assays und der Art der Proteine ​​untersucht.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A	IMSS Hospital, Mexico	Without/number	Virulent trophozoites18
TYI broth	Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich	211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879	3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819
Bovine serum adult	Microlab , Labs., Mex.	SU146	Use at 10% and inactivated to 56 °C for 30 min
Diamond  vitamin  mixture- Tween 80	In vitro	SR-07	Use at 3%
Penicillin	Lakeside,  Méx.	34564SSA IV	0.5 IU/ml
Streptomycin	Lakeside,  Méx.	75757SSA IV	35 µg/ml
Pyrex 15 ml screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps	Corning-Pyrex	9826-16X	16 x 125 mm, capacity 15 ml and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature
Cell culture plates, 6-Well	Corning-Costar	3516	Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2.  Rings on lid prevent cross-contamination
25 cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430168	Canted neck flasks
MDCK (Madin Darby canine kidney) type I	American Type Culture Collection	CCL34	Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage
DMEM medium	Gibco	12800-017	Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose.
Neonate Calf Serum	In vitro	S-02	Use at 10%.
Penicillin/Streptomycin mixture	In vitro	A-01	Stock solution 10,000 U/µg/ml
Insulin	AMSA	398MJ94SSA IV	Stock solution 100 IU/ml
Trypsin solution	In vitro	EN-005	0.05% enzyme solution without calcium and magnesium
75 cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430720	Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium
Transwell permeable supports	Corning-Costar	3470	0.4 µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24-well plate, growth area 0.3 cm2
24-well cell culture dish	Corning-Costar	3524	Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic
Complete Mini	Roche	11836 153 001	Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM
Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64)	SIGMA-Aldrich	E3132	Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/ml
pαZO-1	Invitrogen	402200	IgG rabbit policlonal  antibody  against  a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein
mαEhCPADH112	Homemade antibody	Without/ Number	IgM mouse monoclonal antibody  against  444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27
FITC-goat anti-mouse IgM	Zymed	62-6811	Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary  antibody
TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L)	Zymed	816114	Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled  goat anti-rabbit IgG  secondary antibody.
STX2 Electrode	World Precision Instrument	102711	Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM
EVOM epithelial voltohmmeter	World Precision Instrument	12111	Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements
Neubauer chamber	MEARIENFELD	610610	Hemocytometer
Leica TCS_SP5_MO	Leica	Without/number	Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software
Vectashield	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting medium for fluorescence
4',6-diamino-2-phenylindole (Dapi)	SIGMA	D-9542	0.05 mM final concentration
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological	A-1310	0.5%  final concentration for blocking solution