Abstract
Na adubação internamente animais, o fluido seminal é geralmente adicionado para os espermatozóides, que formam o sêmen ou ejaculação. Além esperma nutritivo e activação, os componentes no fluido seminal, também pode influenciar a fisiologia feminina para aumentar o sucesso de fertilização do esperma de um doador. Enquanto muitos estudos têm relatado tais efeitos em espécies com sexos separados, poucos estudos têm abordado este em animais simultaneamente hermafroditas. Este protocolo de vídeo apresenta um método para estudar os efeitos do fluido seminal em gastrópodes, usando um caramujo de água doce, simultaneamente, hermafrodita, o grande caracol lagoa stagnalis Lymnaea, como organismo modelo. Enquanto que o procedimento é mostrado utilizando extractos completos de glândula da próstata, os componentes individuais (isto é, proteínas, peptídeos e outros compostos) do fluido seminal pode ser testada do mesmo modo. Efeitos do recebimento dos componentes do ejaculado sobre a postura de ovos pode ser quantificado em termos de frequência de postura de ovos eestimativas mais sutis de desempenho reprodutivo feminino, tais como números de ovos dentro de cada ovo massas. Os resultados mostram que as proteínas do líquido seminal afetar reprodutivo das fêmeas neste hermafrodita simultâneo, destacando sua importância para a seleção sexual.
Introduction
Após a transferência, os espermatozóides são geralmente acompanhadas de líquido seminal produzido por glândulas acessórias masculinas. Enquanto alguns componentes ejaculação desempenham papéis em nutrir e ativar um esperma, outros influenciam a fisiologia feminina, a fim de aumentar o sucesso de fertilização do doador de esperma 2-4. Tais efeitos são especialmente selecionados para, através da seleção sexual, quando uma espécie é altamente promíscuo e tem capacidade de armazenamento de espermatozóides e eficiente digestão de esperma. Sob tais condições, os dadores de esperma competem fortemente para a fertilização de ovos 5. Embora não haja evidência correlacional abundante para a importância de substâncias do líquido seminal para o sucesso de fertilização masculino, prova direta é mais rara e poucos estudos investigou os detalhes da mudança fisiológica e / ou substâncias envolvidas 6.
Nas espécies com sexos separados (ou seja, machos e fêmeas; gonochorists) há um modelo de poucos especi bem investigadoes quando se trata de composição de fluido seminal e os seus efeitos. Exemplos incluem a mosca da fruta, Drosophila melanogaster 6, o mosquito da malária, o Anopheles gambiae 7, eo besouro de farinha vermelho, Tribolium castaneum 8. Tais estudos fluidos seminais são muito mais raros quando se trata de espécies que são, simultaneamente, hermafrodita (ou seja, os indivíduos são funcionalmente macho e fêmea ao mesmo tempo), mesmo que este modo de reprodução é comum em todo o reino animal 9. O exemplo mais notável hermafrodita da transferência de uma substância glândula acessória é, provavelmente, o tiroteio dos chamados dardos de amor em caracóis terrestres 2,10, onde a substância é transferido pelo doador de esperma através de injeção hipodérmica 11,12, ou seja, não juntamente com os espermatozóides. Mas há muitos hermafroditas simultâneos que transferem produtos glândula acessória masculina junto com seu esperma,como as espécies modelo usados aqui, a grande lagoa caracol Lymnaea stagnalis. Pesquisa anterior já demonstrado que a recepção do fluido seminal influencia a produção de descendência feminina desta espécie 13-15, e várias das proteínas dos fluidos seminais envolvidos foram identificados 16,17.
O objetivo geral deste protocolo, que é uma extensão dos métodos relatados em Koene et al 16, é testar os efeitos das proteínas do líquido seminal em vários parâmetros de postura de ovos em moluscos gastrópodes. Isto é conseguido por meio de dissecção da glândula da próstata (isto é, a glândula acessória masculina que produz o fluido seminal) de caracóis doadores sexualmente isolados a partir de uma cultura de laboratório padronizado. Em segundo lugar, o esperma do doador é coletado a partir das vesículas seminais e soluções de tratamento diferentes são feitas. Subsequentemente, os caracóis do teste são anestesiados e injectados por via intravaginal com uma solução de teste (por exemplo,extrato de próstata glândula sozinho, extrato de glândula da próstata com o esperma, esperma sozinho, meio transportador sozinho). Estes moluscos de teste são então monitorizados durante os dias seguintes, a semanas, sob condições padrão, para gravar a postura de ovos. Massas de ovos são coletados, digitalizados para a contagem e medição de vários parâmetros, e em seguida, colocar em frascos individuais para incubação. Após cerca de duas semanas, os filhotes são contados e digitalizados. Todos os exames, de ambos massas de ovos e filhotes, são então analisados por meio de um pacote de software de análise de imagem livremente disponível.
Para este protocolo a cepa de laboratório do grande caracol lagoa, stagnalis Lymnaea, é usado, que é produzido na Universidade VU de Amsterdã. Esta espécie serve como um sistema modelo para investigar perguntas sobre seleção sexual e reprodução em hermafroditas. Relativamente grande tamanho do animal faz com que seja muito acessível experimentalmente. Além disso, uma vez que é usado como uma espécie de modelo em muitos bdisciplinas iological já sabemos muito sobre a biologia básica destes animais. Este método vai ajudar a estudar questões sobre processos de seleção sexual que são mediadas através de proteínas do líquido seminal em geral. Além disso, porque estes são hermafroditas simultâneos, é possível tratar se estas proteínas actuam em formas semelhantes e / ou diferentes, como o fazem na espécie em que os sexos são separados 16,17.
Protocol
1. Criatório
- Obter espécimes adultos de Lymnaea stagnalis (L.) a partir de uma cultura de laboratório como o da Universidade VU.
- Manter a água baixo teor de cobre a 20 ° C, tanto no criatório (molluscarium) e tanques experimentais, que têm troca de água contínuo.
- Definir o ciclo claro / escuro de 12 horas: 12 horas.
- Para reprodução, alimentar os caramujos adultos sem pesticidas ad libitum alface, alimentar os jovens juvenis com TetraPhyll (alimentos peixes) flocos. Manter caramujos em tanques separados de acordo com sua idade, a partir de massas de ovos que são colocados dentro de um prazo de 24 horas.
- Uma vez que os caracóis são removidas dos tanques de criação não são devolvidas, para evitar os efeitos de terem sido mantidos em condições ligeiramente diferentes, bem como para prevenir pseudoreplicação.
2. Dissecção
- Isolar os caracóis por 1 semana, e alimentá-los à vontade, para garantir that têm esperma completo e lojas fluido seminal.
- Prepare um microscópio estéreo, uma placa de dissecação com pinos, pequenas tesouras cirúrgicas, fórceps finos e grossos, uma seringa de 10 ml preenchida com uma solução de MgCl2 50 mM, agulhas de injeção (0.3 mm x 13 mm) e algumas toalhas de papel.
- Eutanásia um caracol através da injeção de solução de MgCl2 (geralmente de 3 ml ou mais para caramujos adultos com um comprimento de concha de 31,6 ± 2,1 mm e peso úmido de 2,89 ± 0,55 g). Penetrar o pé com a agulha de injecção em um ângulo de 45 ° e injectar através da aplicação de uma pressão suave de forma contínua até o caracol relaxa e permanece estendida (em segundos). Retire a agulha de injeção e verifique se o caracol é sacrificado (por exemplo, verificar se o reflexo de retirada tentáculo está ausente).
- Com cuidado, retire a casca após a sua curvatura, usando uma pinça grossa. No meio do caminho, retire delicadamente o músculo columela da concha, raspando com a pinça. Gire suavemente tele caracol fora de seu escudo, seguindo a direção do enrolamento da concha.
- Coloque o caracol na placa de dissecação e de definir a extremidade traseira do pé. Em seguida, coloque um alfinete através da cabeça e coloque um pouco de tensão sobre o caracol para facilitar a dissecção.
- Localize o gonóporo feminino, que irá, mais tarde, ser um ponto de referência para dissecção.
- Usando a tesoura cirúrgica e uma pinça fina, fazer a primeira incisão, logo abaixo da borda do manto e cortou para o gonóporo feminino. Quando uma das lâminas das tesouras é empurrado para debaixo da parede do corpo, levante um pouco para garantir que apenas a parede do corpo, e nenhum dos órgãos internos, é cortado. Continue cortando acima da gonóporo para a cabeça e cortar em uma linha reta.
- Localize a próstata (posterior) e vesículas seminais (anterior). Dissecar estes para fora com cuidado e mantê-los no gelo. Use-os para fazer as soluções de ensaio contendo fluido e / ou esperma seminal. Use fisiológico sal Lymnaeaina (5,83 mmol / L de CaCl 2 · 2H 2 O, 3,76 mmol / L de MgCl2 · 6H 2 O, 42,69 mmol / L de NaCl, 37,53 mmol / L de KCl) como um meio de suporte.
- Recolhe-se o fluido seminal que está presente no lúmen da glândula da próstata, bem como o esperma das vesículas seminais. Subsequentemente, suspende, tanto em solução salina, em frascos separados, expressando suavemente o seu conteúdo e removendo o tecido do órgão com uma pinça. Manter em gelo e usar o mesmo dia. Mais tarde, misturar estas suspensões para criar as diferentes soluções de tratamento.
3. Intravaginal Injeção
- Antes de iniciar o procedimento de injeção intravaginal, prepare um silício shell-molde (feito para caber a ponta do shell), seringas de 1 mm, 10-12 cm tubos de silicone com um diâmetro de 1 mm, embotada agulhas de injeção (0.3 mm x 13 mm ), fórceps grosseiras e da mesma seringa de 10 ml cheio com uma solução de 50 mM de MgCl 2 equipada com uma agulha de injecção afiada.
- Recolhe-se o esperma, necessário adicionar ao líquido seminal (ou proteínas de fluidos seminais individuais) em alguns tratamentos; uma dose biologicamente relevante é igual a 1/3 de uma glândula da próstata e vesícula seminal por injecção.
NOTA: Na seção representante resultados (Figura 1) os resultados de um experimento com três tratamentos diferentes são mostrados: controle (meio transportador, ou seja, solução salina), Ovipostatin (uma das proteínas do líquido seminal identificados) sozinho e Ovipostatin acompanhado com esperma. Além disso, para calcular a dose biologicamente relevante em outras espécies, determinar a diferença no peso da glândula da próstata de indivíduos que foram recentemente acasaladas e indivíduos que permaneceram sexualmente isolado 16. - Prepare seringas de 1 ml para cada uma das soluções de teste preparadas. Encha cada seringa com uma solução e garantir que não há bolhas de ar no interior.
- Coloque uma agulha de injeção embotada em cada seringa.
- Para injecção utilizar um 1tubo de silicone mm de diâmetro, com um comprimento mínimo de 10 cm.
- Deslize cuidadosamente o tubo de silicone ao longo da agulha de injecção, tendo cuidado para não furar o tubo e remover o ar a partir do tubo, aplicando suavemente a pressão no êmbolo da seringa.
- Anestesiar um caracol, seguindo o mesmo protocolo que no ponto 2.3. Desta vez, certifique-se não injetar mais de 2-3 ml de 50 mM de MgCl2.
- Coloque o caracol no shell-mold para mantê-lo em uma posição estável.
- Localize o gonóporo feminina, que é claramente visível como uma mancha branca no lado direito do animal, anterior ao tentáculo direito e gonóporo masculino (este local também se aplica a outras espécies de caramujos de água doce). Certifique-se de ter acesso livre.
- Use uma pinça de segurar a extremidade do tubo de silicone e suavemente inserir cerca de 2-4 mm do tubo de silicone para o gonóporo fêmea.
- Cuidadosamente aplicar pressão para a seringa e injectar 0,03 ml da solução de teste. Espere meia minute para permitir que a pressão no tubo para se propagar no tracto fêmea antes da remoção do tubo.
- Devolver o caracol tratada para o seu recipiente de isolamento, em que ele pode ser monitorizada, e permitir a recuperação a partir de sedação no tanque experimental.
4. Bioensaio
- Identifique cada caracol para a identificação e medir o seu comprimento de concha. Este último é um bom indicador do tamanho, o que é relevante ao quantificar a produção de descendência.
- Mantenha cada caracol isolado em um recipiente de 460 ml que é perfurado para permitir a troca de água dentro do tanque experimental. É importante colocar todos os recipientes na orientação correcta, com as perfurações na direcção do fluxo de água, para permitir a troca de água eficiente.
- Durante o ensaio biológico, alimentar os caracóis regularmente com uma quantidade padronizada de alface. Use uma rodada, perfurador de metal para cortar alface. Neste protocolo são usados discos de alface de 19,6 cm 2, que se aproxima a umamontar eles máximo pode comer em um dia.
- Coletar uma massa de ovos usando o lado liso de uma espátula e raspe a massa de ovos da parede do recipiente. Use o lado da colher para recolher a massa de ovos.
NOTA: massas de ovos opacas que acabam de ser definidos não pode ser usado para a digitalização (que se tornem transparentes dentro de algumas horas após a postura). Para as espécies modelo neste protocolo, stagnalis Lymnaea, verifique se há massas de ovos todos os dias, uma vez que produzem 2-3 massas de ovos por semana. Isto pode variar em outras espécies. - Digitalize as massas de ovos coletadas digitalmente, utilizando um (laptop) computador que contém o driver do scanner, um scanner de mesa, uma escala de milímetros standard, uma espátula, transferir placas e telhas de vidro.
- Coloque cada massa de ovos sobre as placas de transferência e repetir até que as placas estão cheios. Posteriormente, dab as massas de ovos secar em papel toalha e transferi-los para as telhas de vidro na mesma ordem como nas placas de transferência.
- Vire cada telha de cabeça para baixo (omassas de ovos vai ficar com a telha de vidro) e colocá-lo cuidadosamente no scanner de mesa, logo abaixo da escala milimétrica. Aplique um pouco de pressão para achatar as massas de ovos, que irá distribuir os ovos uniformemente para todos eles são visíveis dentro do mesmo plano de foco. Coloque os azulejos com uma quantidade padronizada de fita em torno de dois gumes para assegurar que todos os ovos são achatados de forma igual.
- Ajuste as configurações do scanner. É importante para ajustar a resolução para o máximo, fazer uma digitalização de visualização, corte a área de trabalho, e ajustar o brilho eo contraste. Digitalize as massas de ovos.
- Coloque cada massa de ovos em seu próprio rotulado frasco de vidro de 20 ml para o desenvolvimento e eclosão.
- Atualize a água em frascos de incubação todos os dias para mantê-lo devidamente oxigenado. Faça isso de acordo com números hatchling e tamanho, na seguinte ordem: decantação / escorrendo (sem filhotes), transbordando (início da incubação), e extrair a água com uma pipeta (muitos filhotes).
- Instale o software de análise de imagens ImageJ livremente disponível (NIH, EUA) eo contador de células plugin.
- Abrir ImageJ, bem como um programa de folha de cálculo para transferir os dados. Em seguida, abra a imagem digitalizada de massas de ovos em ImageJ.
- Defina a escala usando a ferramenta de zoom para navegar até a escala milimétrica. Zoom e ajustar a janela de um milímetro para encher a tela. Desenhar uma linha usando a ferramenta de linha entre as duas linhas que indicam um milímetro. Navegue para Analisar e Definir escala. No menu pop-up a opção comprimento medido torna-se visível, ajuste a distância conhecida a 1 ea unidade de comprimento para mm. Marque a caixa Global, e fechar a janela.
- Defina as medidas preferenciais (comprimento, largura, circunferência), navegando para Analisar e definir medidas a seleção de Área e Diâmetro de Feret (comprimento e largura). Clique em OK para confirmar e continuar com a análise da imagem.
- Para medir os ovos, zoom em em um ovo da primeira massa de ovos que precisa ser medido. Recomenda-se um zoom de 800%. Em seguida, usando a ferramenta elíptica desenhar um oval exatamente em torno do ovo, pressione Ctrl + D para desenhar a circunferência na imagem (para evitar que a medição do mesmo ovo duas vezes). Em seguida, pressione Ctrl + M para gravar a medida das propriedades do oval (comprimento, largura, circunferência); uma tela pop-up é aberto exibindo as medições.
NOTA: O uso da ferramenta elíptica para medir os ovos não se aplica a todas as espécies. Para as espécies com ovos em forma de maneira não uniforme, use as seleções à mão livre em seu lugar. - Meça quantos ovos necessários e, em seguida, salvar as medidas planilha xls.. Opcionalmente, copiar os dados diretamente em uma planilha.
- Posteriormente contar os ovos dentro de uma massa de ovos, usando a janela do balcão e colocou a contagem manualmente na planilha.
- Alternativamente, contar os ovos individuais por massa de ovos, com a ajuda da célula contra plug-in. Para isso, vá até Plug-ins,em seguida, analisar e selecionar Contador de células. A janela de contador de células irá aparecer, marque a opção "manter original" caixa e pressione 'inicializar'. Uma nova janela do contador aparece, selecione a ferramenta mira da barra de ferramentas e selecione um tipo de contador no menu contador de células. Conte os ovos individuais clicando nos ovos individuais na janela do contador de células. Observe a contagem total ao lado do tipo de contador no menu contador de células. Copie esse número manualmente para uma folha de cálculo ou obter os resultados pressionando Resultados.
- Contagem múltiplas massas de ovos dentro de um evento de contagem, adicionando tipos de contador, se necessário.
Representative Results
A Figura 1 mostra a percentagem de animais poedeiras de ovos depois da injecção intra-vaginal de qualquer substância de controlo (solução salina), Ovipostatin, ou Ovipostatin acompanhada com o esperma. N = 15 para cada tratamento; ver Koene et al 16 para obter mais detalhes e estatísticas (Fonte: Figura 3 a partir de 2010 Koene et al, PLoS ONE.)..
Figura 1. Efeito de Ovipostatin na produção em massa de ovo de Lymnaea stagnalis. O gráfico mostra a percentagem de animais poedeiras de ovos depois da injecção intra-vaginal de qualquer substância de controlo (solução salina), Ovipostatin, ou Ovipostatin acompanhada com o esperma. N = 15 para cada tratamento; ver Koene et al. 2,010 detalhes e estatísticas. Reimpressão com permissão de Koene et al 2010 PLoS ONE 5:. E10117.
Discussion
O protocolo apresentado mostra como coletar fluido seminal e como testar isso de uma forma biologicamente significativa. Embora este procedimento aqui é mostrada utilizando o extracto da glândula da próstata, o efeito de uma única proteína do fluido seminal purificado também podem ser testados seguindo o mesmo procedimento. Obviamente, em tais testes é sempre crucial incluir controlos adequados (tratamentos simulados) para assegurar que o processo e / ou o material de suporte não afecta os parâmetros de perguntas 14,16. Usando este método, que já foi demonstrado que existe uma única proteína de fluido seminal, nomeadamente Ovipostatin, que medeia uma redução na postura dos ovos, 14,16. Esta proteína, produzida na glândula da próstata e transferida durante o acasalamento, juntamente com os espermatozóides, representa o primeiro componente de fluido seminal totalmente caracterizados em hermafrodita simultânea e que, até agora, não mostra qualquer semelhança com as proteínas conhecidas.
A constatação de que Ovipostalata reduz a produção de massa de ovos no recipiente corrobora trabalhos anteriores, indicando que as substâncias no sêmen pode influenciar oviposição 13-15. Ao transferir quantidades biologicamente relevantes (ver 3.2 16), pode-se convincentemente demonstrar que é uma proteína de fluido seminal, e não a presença de espermatozóides si, que medeia a redução observada na postura de ovos (Figura 1). Tendo em conta que o recebimento repetido de fluido seminal através de cruzamentos naturais aumenta o investimento por ovo 15, torna-se altamente relevante para quantificar outros parâmetros de postura de ovos. O protocolo apresentado agora fornece os métodos necessários para fazê-lo. Embora nenhum efeito foi encontrado de Ovipostatin sobre o sucesso de eclosão dos ovos postos por o recipiente 16, pode haver outras proteínas do líquido seminal que agem em conjunto com essa proteína. Por isso, os parâmetros que precisam ser quantificados neste contexto - ao lado, que os números de freqüência e de ovos - incluem o tamanho do ovo, hatctempo hing, desenvolvimento e tamanho hatchling hatchling. Além disso, é possível olhar para efeitos sobre outros processos sexo feminino do que a postura de ovos, como o armazenamento de esperma eo uso, bem como a alocação de recursos para a função reprodutiva feminina e masculina 14,17. Claramente, o método apresentado é fundamental para abordar estas questões de seguimento, tanto em Lymnaea stagnalis e em outros caramujos de água doce.
Em suma, os experimentos que utilizam este protocolo mostram que transferidos proteínas do líquido seminal afetam o desempenho reprodutivo feminino do destinatário nestes hermafroditas simultâneos. Dado que poucos estudos têm abordado este, é provável que seja muito mais comum em fertilizar internamente hermafroditas que se reflete atualmente na literatura científica. Especialmente quando se percebe que a escolha do companheiro de pré-cópula e competição do esperma foram mostrados a desempenhar um papel importante nestes hermafroditas 14, que highlights o potencial de tais proteínas da glândula acessória masculina de ser sexualmente seleccionado neste sistema. Finalmente, a pesquisa ajuda a apoiar a noção de desenvolvimento que as proteínas do líquido seminal são de igual importância para hermafroditas simultâneos como eles são para espécies separadas-sexuado.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos MR Helmus para o voice-over, CM Popelier, S. Ypenburg e C. Levesque para assistência técnica. Esta pesquisa é financiada pela Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO), a Academia Real Holandesa de Artes e Ciências (KNAW) ea Organização Student Services Japan (JASSO). Esta publicação foi apoiada por uma bolsa de Acesso Aberto de NWO para JMK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fish food flakes | TetraPhyll | ||
| Stereo microscope | |||
| Small surgical scissors | WPI | ||
| Coarse and fine forceps | WPI | ||
| 10 ml syringe | |||
| Injection needles (0.3 mm x 13 mm) | |||
| 50 mM MgCl2 | |||
| 5.83 mmol/L CaCl2·2H2O | |||
| 3.76 mmol/L MgCl2·6H2O | |||
| 42.69 mmol/L NaCl | |||
| 37.53 mmol/L KCl | |||
| Two component Silicon | Sylgard | ||
| 1 mm syringes | |||
| Silicon tubing (diameter 1 mm) | |||
| Blunted injection needles (0.3 mm x 13 mm) | |||
| Tubes | Eppendorff | ||
| 460 ml perforated containers | |||
| Metal leaf puncher (19.6 cm2) | |||
| Spatula/spoon | |||
| (Laptop) computer | |||
| Flatbed scanner | |||
| Millimeter scale | |||
| Transferring plates | |||
| Glass tiles | |||
| 20 ml glass vials |
References
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