Summary
미세 유체 와류를 이용한 일렉트로 플랫폼은 정확하고 독립적 인 투여 량 제어와 동일한 세포 집단에 여러 분자의 순차적 전달을 위해 개발되었다. 시스템의 크기에 기초하여 목표 셀 정제 단계 이전 일렉트로 분자 전달 효율 및 처리 된 세포의 생존 능력을 향상시키는 데 도움.
Abstract
물리적으로 세포에 비 - 투과 외인성 분자 프로브를 도입하기위한 아주 강력한 기술이기 때문에 전기 천공은, 과거 몇 년 동안 증가 주목을 받아왔다. 이 작업은 정밀한 분자 종속 매개 변수 컨트롤과 함께 포유 동물 세포에 여러 분자 전달을 수행 할 수있는 마이크로 유체 일렉트로 플랫폼을보고한다. 균일 한 크기 분포와 세포를 분리하기위한 시스템의 능력은 주어진 전계 강도 당 전기 천공 효율 적은 편차를 허용; 따라서 샘플 생존력을 향상. 또한, 그 공정 시각화 기능 효율 향상을위한 반응계에서 프롬프트 분자 전달 파라미터 조정을 허용 실시간 형광 분자 흡수 과정의 관찰을 허용한다. 보고 된 플랫폼의 광대 한 능력을 보여주기 위해, 서로 다른 크기와 전기 요금과 거대 분자 (예를 들면, 덱스 트란은 3000 및 70000 다의 MW로)했다테스트 된 모든 분자 높은 전달 효율 (> 70 %)로 전이성 유방암 세포로 전달. 개발 플랫폼은 온 - 칩 기술은 일렉트로 유리할 수있다 연구 분야의 확장에 사용 가능성을 증명했다.
Introduction
최근, 세포 분자의 세포 내 전달을 용이하게하는 전기 펄스의 사용은 포유 동물 세포를 조작 매력적인 수단이되었다. 일 또한 일렉트로이라고하는이 과정은, 가역적으로 액세스하는 본래 세포막 투과성 분자를 허용 세포막을 permeabilizes 세포의 세포 적 환경이다. 거의 모든 분자 일렉트로를 이용한 세포의 모든 종류의 막으로 임시 만들어진 기공을 통해 세포질 내로 도입 될 수 있기 때문에, 기술이보고 된 것으로, 더욱 재현성 보편적으로 적용하고, 바이러스 - 매개 화학을 포함하는 다른 방법에 비해보다 효율적 세포 생존은 그대로 유지하면서, 광학 접근법. 2-3이 기술은, 형광 물질을 도입하는 약물 4 5 핵산 6-7을 이용하고있다. 이러한 이점을 감안할 때, 일렉트로는 일반적인 노동으로 채택되었다DNA 형질 atory위한 기술, 생체 내 유전자 치료 8 세포 접종 연구. 성공적인 일렉트로 필요한 전계 강도가 밀접 셀의 직경과 상관하기 때문에 종래의 전기 천공 시스템은 동시에 대형화와 이질 샘플 실용적인 효율 및 생존 가능성을 달성하는 것은 여전히 그러나 어렵다. 더욱이, 이러한 시스템은 다수의 분자 양의 정밀한 제어가 벌크 스토캐스틱 분자 전달 프로세스에 대한 의존도로 인해 전달되는 것을 허용하지 않는다. 9는 이러한 문제를 해결하기 위해, 많은 그룹은, 저급 CORPORATION에서 전압의 이점을 제공하고, 미세 유체 일렉트로 플랫폼 개발 더 형질 감염 효율, 세포 사망의 큰 감소, 및 복합 분자를 제공하는 능력. 10-13 이러한 장점은 그 전극 피치 마이크로 전기 천공 시스템의 작은 풋 프린트에 의해 가능하게되었다길이 극적 성공적인 전달을 위해 필요한 전압을 감소시키는, 서브 밀리미터이다. 더욱이, 이들 마이크로 일렉트로 시스템은 전달 효율을 향상하면서 감소 된 세포 사망을 산출, 생성 된 열을 방출 빠르게 균일 한 전계 분포를 달성 할 수있다. 추가적으로 이러한 마이크로 투명 재료 사용률 프롬프트 파라미터 변경에 대한 전기 천공 과정 시츄 관찰에 있습니다. 2,12을 그러나 정확한 투여 량 제어 및 연구 및 치료 적 응용, 6 신흥 필요한 분자 - 및 세포 - 의존 파라미터 제어를, 14-16는 여전히 해결되지 못한 상태로 남아있다.
이 작업은 순차적으로 표적 세포의 미리 선택된 동일한 집단에 여러 분자를 전달할 수있는 미세 유체 와류를 이용한 전기 천공 시스템을 제공한다. 균일 한 크기 분포를 가진 세포는 이전에보고 된 실리콘을 사용하여 이전에 전기 천공 법 (electroporation)에 격리되어제 '선택적 트래핑 메커니즘. 17-18 균일 한 크기 분포, 적은 편차 일렉트로 효율 및 달성 하였다 주어진 전계 강도 당 강화 가능성을 갖는 바이. 19 또한, 연속 마이크로 와류를 사용하여 포획 세포를 교반을 통해 분자의 균일 한 전달 허용 결과와 일치하여 전체 세포질은, 이전에,이 시스템은 일반적으로 생물학적 인 응용에 이용 분자의 넓은 범위에 적용될 수 있음을 입증하기 위해. 다른 와류 이용한 일렉트로 플랫폼을 사용하여 (20)을보고로 전달 된 분자량 광범위한 고분자 전이성 유방암 세포. 또한, 실시간 프로세스 모니터링의 도움으로,이 작품은 주로 확산 매개. 14 대 전기 매개되고, electrporation 동안 분자 전달의 메커니즘에 관한 오랜 논쟁에 종지부를 찍을 더 많은 증거를 제공 6,14,21-22 약물 전달 응용 프로그램 10,19 및 애플리케이션을위한 다양한 도구로 실제적인 가능성이있다.
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Protocol
1 셀 준비
- 접시 1 × 10 10 % (v / v) 소 태아 혈청과 1로 보충 Leibovitz의 L-15 중간에 조직 배양 용 T75 플라스크 당 10 ㎖의 부피 전이성 유방암 세포주 MDA-MB-231의 5 세포 / ml % 페니실린 - 스트렙토 마이신.
- 0 % CO 2 환경과 37 ° C에서 가습 배양기에서 MDA-MB-231 세포를 품어.
- 2 분 동안 0.25 % 트립신-EDTA로 세포를 처리함으로써 이일 파종 후 실험 수확 세포 및 성장 배지 8 ㎖에 첨가함으로써 트립신의 활성 효소를 불 활성화.
- 5 × 105 세포 / ml의 최종 농도 (칼슘 및 마그네슘 2 +없이 DPBS, 1X) 둘 베코 인산염 완충 식염수를 200 × g 및 재현 탁에서 5 분 동안 원심 분리하여 세포 펠렛.
2 장치 설계 및 제작
참고 : 마스크, 마스터 몰드 날조와마이크로 채널 클로징 처리는 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 미세 주조법이 일반 실험실 벤치 탑상에서 수행 될 수있는 동안 클린 룸 안에서 실시하여야한다.
- AutoCAD를 그림 1에 나타낸 바와 같이 미세 유체 장치를 설계합니다. 이 장치는 (L = 7mm W = 40 μm의, 그리고 H = 70 μm의) 여러 주입 포트, 거친 필터와 두 개의 평행 한 직선 직사각형 관성 중심 채널 입구로 구성되어야합니다. 개별 직선 채널은 알루미늄 전극 구멍을 통해이와 떨어져 800 μm의 배치 5 일렉트로 챔버 (W C = 400 μm의)로 구성되어 있습니다. 두 횡 방향으로 인접하는 일렉트로 챔버 음극 용 구멍을 공유한다. 두 개의 직선 채널은 일렉트로 지역의 하류에있는 콘센트에 병합합니다.
- LinkCAD를 사용하여 GDSII 파일에 마이크로 패턴 CAD 파일을 변환합니다. 빈 5 "× 5"포토 마스크에 미세 패턴을 작성레이저 마스크 라이터. 제조 업체의 프로토콜에 따라 마스크를 개발한다. 참고 : 마스크 개발 프로세스는 포토 레지스트 현상, 크롬 에칭 및 레지스트 제거를 포함한다. 대안 적으로, 마이크로 패턴을 고해상도 투명도에 인쇄 (> 20,000 DPI)를 타사 메이커로부터 구입하고, 포토 마스크로 사용될 수있다. 포토 마스크에 최종 마이크로 기능은 네가티브 포토 레지스트의 극성이 일치하도록 투명해야한다.
- 70 μM의 최종 두께를 갖도록 2000 rpm에서 4 인치 실리콘 웨이퍼 상에 네거티브 포토 레지스트를 스핀 코트 표준 소프트 리소그래피 기술 (23)을 사용하여 장치 설계의 주형을 제조.
- 95 ° C에서 20 분 동안 네가티브 포토 레지스트와 웨이퍼를 프리 베이킹.
- 웨이퍼와 마스크를 연락 마스크 얼 라이너를 사용하여 80 초 동안 UV 소스 (17.4 엠제이 / cm 2)에 노출.
- SU-8 개발에 4 분 동안 노출 된 웨이퍼를 개발한다.
- 측정표면 프로파일로 미터를 사용하여 개발 된 포토 레지스트 두께.
- 제 (실리콘 엘라스토머 키트) 경화 엘라스토머 1 비율 및 PDMS 복제본을 생성하는 주형에 부어 혼합물 : 엄격 10 섞는다. 30 분 동안 주조 엘라스토머를 탈기하고 2 시간 동안 70 ° C의 오븐에서 탈기 엘라스토머 주형을 경화.
- 핀 바이스를 사용하여 입구, 출구 및 전극 삽입을위한 금형 및 펀치 구멍에서 마이크로 패턴과 경화 된 PDMS 복제를 박리. NOTE : 핀 바이스의 통상 절삭 날 직경 단단히 대신 PEEK 튜빙 (32 분의 OD ") 및 알루미늄 전극 (0.029의 OD")를 유지하기위한 충분한 0.76 mm이어야한다.
- 각각 75 W, 500 mTorr로의 고주파 전력 및 산소 분압에서 7 초간 산소 플라즈마 클리너로 처리 된 유리 슬라이드에 결합 PDMS 복제본으로 둘러싸인 미세 유체 채널을 생성.
3 흐름 실험
- 삽입알루미늄 전극 (0.029 "OD) 및 출구 PEEK 튜빙 (32 분"미세 구멍을 통해 지정된 장소에 OD)는 (그림 3B 참조).
- 알루미늄 전극에 고전압 짧은 구형파 펄스를 발생하기위한 18 담당 전기 기기를 연결 PDMS 몰드에 흐르는 용액과 접촉하는 (도 3c 참조). 참고 :이 장비는 펄스 발생기 및 자체 내장 된 고전압 앰프로 구성한다 (18).
- (도 3a 참조) 세포 및 생체 분자와 네 개의 50 ml의 원심 개별적 DPBS를 함유하는 튜브, 용액을 준비하고, 공기 유량 제어 시스템에 연결된 각각의 바이알 홀더에 각각 끼운다. 18
- 미세 유체 장치의 각 입구 구멍에 유리 병 홀더에서 유입 PEEK 튜브를 연결합니다.
- 저런 전기를 갖기 위해 100 V로, 구형파 펄스 V의 크기를 설정LD 강도, E = V / L 전자, 전기 천공 챔버 걸쳐 0.7 kV로 / cm 동등. NOTE : 여기서, L 전자는 양극과 음극이 흐르는 용액과 접촉하는 두 점 사이의 거리 (도 1 참조).
- 40 PSI에 압력 조절기를 설정합니다. NOTE :. 단일 수동 조절 질소원 균일 모든 샘플 튜브를 가압하기 위해 사용되며, 고속 매니 폴드 적시 맞춤식 LabVIEW 소프트웨어를 사용하여 각각의 용액 포트를 활성화하기 위해 이용되는 18
- 밸브 제어의 경우, 밸브 러너 레이블 주문 제작 LabVIEW 소프트웨어를 열고 운영한다라는 제목의 드롭 다운 메뉴에서 실행을 클릭합니다.
- 해당하는 각 밸브 아이콘을 클릭하여 밸브를 켭니다. 참고 :이 활성화 될 때 밸브의 아이콘이 녹색으로 변합니다. 활성화 된 아이콘을 클릭하면 비활성화하고 밸브를 닫습니다. 닫힌 밸브 아이콘이 회색으로 설정해야합니다.
- (DPBS 저수지에 밸브를 열고즉., 1.5 분 동안 안정한 세포 트래핑 와류 발생에 필요한 주요 흐름 속도로 세정액).
- 30 초 (즉, 셀 - 포착 공정)를위한 전기 천공 챔버에서 트랩 세포에 세포 용액으로 세척 용액으로부터 활성 용액 포트 스위치.
- 용액 스위칭 단계 동안 파쇄 흐름을 보장하기 위해 셀 - 포착 단계 이전에 10 초 동안 동시에 장치를 통해 모두 세탁 셀 솔루션을 흐른다. 참고 :이 간단한 공동 흐름 단계는 각 솔루션 전환 단계를 반복해야합니다.
- 세척 포트 켜고 비 오염 포집 세포를 제거하기 위해 20 초 동안 세척 장치.
- 관심 장치로 (3000 다 중성 및 음이온 덱스 트란 분자 또는 1.5 밀리그램 / 70000 다 중성 덱스 트란 분자 ml의 0.2 ㎎ / ㎖)의 제 분자를 함유하는 용액을 주입한다.
- 즉시 주사 후 5 쇼트 펄스 (Δt를 2 초 간격으로 30 밀리 초 =) 적용분자 용액 및 오실로스코프를 사용하여 실시간으로 적용되는 전기 펄스의 크기 및 지속 기간을 모니터링한다.
- 3.10만큼 추가 분자의 수와 같은 단계를 반복 배달 할 수 있습니다. 각 분자 납기 후 분자 용액에 100 초 동안 세포를 배양한다 (100)의 과잉 물질을 제거하기위한 세척 용액으로 세척 장치.
- 5 이하 PSI 작동 압력을 낮춤으로써 하류 분석 용 96 - 웰 플레이트에서 세포를 릴리스. 참고 : 100 셀 솔루션의 약 100 ㎕의 각 릴리스에서 수집됩니다.
- 실험은 유동 세포 계측법을위한 충분한 세포를 수집하는 3.16 세 시간을 통해 3.9 단계를 실행합니다.
- 228 × g에서 5 분 동안 처리 된 세포를 포함하는 96 - 웰 플레이트를 원심 분리기.
- 초과 형광 분자를 포함하는 상층 액을 제거합니다.
- 유동 세포 계측법 분석을 위해 DPBS 세포를 재현 탁.
- 분자 U에 대한 흐름 cytometer에 로드셀효율성 분석 ptake.
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Representative Results
개발 병렬 미세 electroporator 전이성 유방암 살아있는 세포로 다양한 크기 및 전하와 거대 분자를 전달. 성공적인 전달 분자는 질적 인 시츄 electroporation하여 선회 세포의 형광 강도의 변화를 모니터링함으로써 결정과 유세포 분석을 통해 정량 측정에 의해 확인되었다. 4A가 처리 된 세포의 90 %가 중성 70000 다 덱스 트란 통풍 관 것을 보여준다. 통계적인 분석을 위해, 각각의 형광 물질에 대한 강도 임계치가 처리되지 않은 살아있는 세포의 대부분 (> 99 %)이 임계 값 미만으로 계산되도록 설정 하였다 (도 4 (c) 참조). 효율은 셀의 수의 비율로 정의된다 성공적으로 처리 된 세포의 총 수에 관심 분자를 차지.도 4b는 효율이 실질적으로 분자에 따라 변화하지 않는 것을 나타낸다중량 전기 요금 (> 0.1 P). 모든 테스트 덱스 트란 분자는 70 % 이상 효율이 세포질로 전달되었다. 또한,도 4d는 순차 전달 분자가 성공적 음이온과 동일한 분자량 (MW = 3000 다)와 중립 덱스 트란을 사용하여 56 %의 이중 분자 전달 효율로 수행되었음을 나타낸다. 로 세포를 처리 할 수있는 현재의 시스템 이전에보고 시스템 (18)보다 더 높은 처리량 및 다중 분자 전달 효율을 10 배이 개선 (각각, 음이온 성 및 중성 덱스 트란에 대해 82 % 및 70 %), 단일 분자의 전달에 영향을 미치지 않는다.
도 1 (A) 일렉트로 마이크로 유체 시스템의 개략도, (C로 표시)을위한 유입구 세포로 구성된 분자 (M1 및 M2로 표기) 및 플러시 오디오 솔루션이온 (F로 표시), 관성 중심으로 발생이 직선 채널, 전극 및 콘센트 (10) 일렉트로 실. 1μM FITC 솔루션 및 세척 용액 (DPBS)를 사용하여 입구에서 (B) 솔루션 교환 데모 나타내는 활성 솔루션이 균일 하류 챔버의 모든 어레이에 주입 할 수있다. 이미지 콘트라스트는 룩업 테이블 (LUT)을 조정함으로써 향상된다. 스케일 바는 250 μm의 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 양극 (10) (+) 및 오 부극 이루어진 짧은 펄스 고전압 애플리케이션을 위해 이용 15 핀 전극의 사진, (-). 각각 양극, 음극으로부터 2mm 이격 및 전자된다동일한 극성의 ACH 전극은 1.35 mm 간격을두고있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 실험 장치의 3 회로도, (A)의 유체 제어 장치 (B)의 마이크로 유체 electroporator, 및 (C) 전기 기기로 이루어지는. 분자, 세포 및 깨끗한 버퍼 용액을 포함하는 (A) 튜브 개별적 가압 LabVIEW를 제어 공기 흐름 시스템을 사용하여 필요에 따라. 가압 바이알로부터 용액. 설치된 체크 밸브와 PEEK 호스를 통해 미세 유체 electroporator 주입된다 (B) 및 (C)의 전기 신호는 F와 접촉 핀 (15) 전극에 보내진다일렉트로 단계 동안 미세 유체 시스템과 같은 솔루션을 제공합니다. 프로그래밍 된 기간에 전기 펄스를 펄스 발생기 및 전기 펄스의 크기 고전압 증폭기에 의해 100 V로 증폭을 사용하여 생성된다. 모든 적용 전기적 파라미터가 오실로스코프를 사용하여 실시간으로 모니터링된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4 주제 데이터 유세포. (A)을 성공적으로 제어 상대측에 비해, 70000 다 음이온 덱스 트란 분자를 차지 MDA-MB-231 세포의 형광 신호. (B) 효율을 각각 전송 덱스 트란 분자에 대한 종속 분자 중요한 발생하지 않습니다변화 (P> 0.1). (C) 일렉트로 (제어)로 처리하지 않은 세포에 대한 프로필, 세포 계측법 대표 흐름. 성공적인 전달 분자를 나타내는 형광 임계치 관리 시료로부터의 신호가 임계치 아래로 발견되도록 상기 데이터로부터 설정된다. 순차적 electroporation하여 세포 계측법 데이터 (D) 주제 흐름. 오른쪽에 플롯과 형광 줄무늬 이미지 유동 세포 계측법에 녹색, 빨간색과 노란색 상자는 각각 3000 다 중립 덱스 트란 전용, 음이온 덱스 트란 전용 두 덱스 트란 분자를 uptaking 세포에서 형광 신호를 나타냅니다. 스케일 바는 100m이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
처리량 및 다중 분자 전달 효율의 새로운 병렬화 일렉트로 플랫폼, 10 배 향상된 기능을 통해 이전에 개발 된 단일 챔버 시스템이 제공하는 모든 장점에 부가하여 달성되었다. 18 이전 가능한 장점은의 (ⅰ) 전처리 정제를 포함 생존 능력 향상을위한 균일 한 크기 분포, (ⅱ) 정확한 분자량 및 개별 투여 량 조절, 및 (ⅲ) 낮은 동작 전류와 표적 세포. 그들은 분자량, 공액 형광 유형 및 전하의 넓은 범위에서 용이하게 사용할 수 있기 때문에 형광 표지 덱스 트란의 관심 분자로서 선택되었다. 이러한 매크로 분자. 형광 덱스 트란, 배양 시간의 24 최적의 농도가 본질적으로 아르 살아있는 세포 불 투과성 막과 세포 독성을 나타내지 않기 때문에 이러한 연구에 적합하다, 전기 매개 변수는 현재 시스템 이전 t에 대한 확인되었다일렉트로 실험 오. 최적화 프로세스 의한 실시간 흡수 분자 프로세스를 모니터링하는 플랫폼의 능력에 비교적 간단하고 효율적이었다. 이 프로세스의 시각화 작은 투 아니 일렉트로 파라미터의 지식을 가진 분자 또는 세포 유형이 테스트되는 경우 매우 유리하다. 테스트 한 모든 분자 배양 시간은 성공적인 전달 분자의 완료를 나타내는, 모든 열 챔버에 갇힌 세포를 실시간으로 검출 가능한 형광 신호 강도를 발휘하는 100 S로 설정 하였다. 이 분자 전달에 필요한 최소한의 인큐베이션 기간 아닙니다.
그것은 전적으로 확산 4,19,25 또는 전기 영동에 의해 매개되는지 여부, 전기 천공을 사용하여 분자 전달 프로세스에 관한 오랜 논란이있어왔다. 분자 전달 지배적기구 (26) 식별 비교 힘드는 개별 일련의 테스트를 포함 t그는 분자 크기, 전기 요금과 일렉트로의 매개 변수에 따라 성과. 저자가 아는 한,이 힘든 최적화 프로세스는 기존의 일렉트로 시스템과보고되지 않았다. 4,26-28 개발 된 시스템의 간단한 매개 변수 최적화 기능은 일렉트로 효율 검사 변화에 의해, 지배적 인 분자 전달 메커니즘의 식별을 위해 허용 분자 및 전기 매개 변수에 따라 달라집니다. 결과 음이온 3000 다 덱스 트란의 효율이 관찰 된 분자 흡수 가능성이 확산에 의해 매개 된 것을 건의, 중립 대응 (각각 83, 75 %)에 비해 유의 한 차이를 보이지 않았다 것으로 나타났다. 기타 일렉트로 시스템과는 달리, 처리 세포는 지속적으로이 시스템에 일렉트로 과정 전반에 걸쳐 교반 하였다. 궤도 세포의 형광 신호의 점진적 증가는 그 확산을 제안하면 도미 것, 관찰NT를 전달 메커니즘. 중립 70000 다 덱스 트란 분자의 고효율 흡수 분자 (90 %)에도 더 높은 분자량으로 전달 프로세스가 확산의 결과로서 발생하는 것을 의미한다. 마지막으로, 3000 다 음이온과 중성 덱스 트란 분자의 성공적인 순차적으로 전달 분자 전달 분자 요금에도 불구하고 발생하는 주장을 응고. 이 결과는 또한 막 재 밀봉이 일렉트로의 3 분 (분자 전달 100 초) 내에 완료되지 않았 음을 시사한다.
제시된 분자 전달 플랫폼은 순차적 관계없이 전기 요금의 분자 크기의 넓은 범위를 제공 할 수 있습니다. 적시 미세 조정과 개별 파라미터의 변형은 실시간 프로세스 모니터링 기능에 의해 원조 적은 노력으로 달성 될 수있다. 시스템의 크기에 기반 셀 정제 공정이 번잡 샘플 준비 시간 소모적 원심 전후 일렉트로의 필요성을 없애단계. 또한, 시스템의 낮은 운전 전류가 실질적으로 세포 사망률을 감소시킨다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 로우 랜드 주니어 펠로우 프로그램에 의해 지원됩니다. 크리스 스톡스 주문 제작, 컴퓨터를 이용한 압력 제어 설정, 박사 다이앤 Schaak의 개발에 그의 도움을 : 저자는 하버드 로우 랜드 연구소의 과학자들과 직원에게 감사의 말씀을드립니다 생물학적 시료 처리에 대한 그녀의 입력, 윈필드 힐에 대한 전기 설치, 박사 Alavaro 산체스 개발 압력 설정에 필요한 기계 배관 부품 가공에 대한 흐름 cytometer, 스콧 Bevis, 케니 스펜서 돈 로저스에 대한 액세스 권한을 부여합니다. 미세 유체 주인은 하버드 대학 나노 시스템을위한 센터 (CNS)에서 제작 하였다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDA-MB-231 cancer cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-045-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Cellgro, Mediatech, Inc. | 21-030 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 25200-056 | |
| Flow Cytometer easyCyte HT | Millipore | 0500-4008 | |
| Oxygen Plasma Cleaner | Technics Micro-RIE | ||
| Dektak 6M surface profiler | Veeco | ||
| KMPR 1050 | Microchem | ||
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Compressed Nitrogen gas | Airgas | NI 300 | |
| High Pressure Regulator | McMaster-Carr | 6162K22 | |
| Downstream regulator | McMaster-Carr | 4000K563 | |
| High-speed 3/2way-8 valve manifold | Festo | ||
| Inline Check Valve | Idex Health and Science | CV3320 | |
| 5/32" OD x 3/32" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-156F-0 | |
| 1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-250PB-4 | |
| 1/16" PEEK tubings | Festo | P1533 | |
| 1/32" PEEK tubings | Idex Health and Science | P1569 | |
| PEEK tubing unions | Idex Health and Science | P881 | |
| Pulse Generator | HP | 8110A | |
| Aluminum Wire | Bob Martin Company | 6061 ALUM | |
| Oscilloscope | Agilent | DSO3062A | |
| 50 ml centrifuge tubes | VWR | 21008-178 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR | 21008-216 | |
| T75 culture flask | VWR | 82050-862 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 3,000 MW, Anionic | Gibco, Life Technologies | D3307 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D1819 | |
| Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D3329 |
References
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation Past present and future. Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).
- Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).
- Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W. Fabrication of electro-microfluidic channel for single cell electroporation. Biomedical Microdevices. 15, 759-766 (2013).
- Neumann, E., Toensing, K., Kakorin, S., Budde, P., Frey, J. Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells. Biophysical Journal. 74, 98-108 (1998).
- Jaroszeski, M. J., et al. Toxicity of anticancer agents mediated by electroporation in vitro. Anti-Cancer Drugs. 11, 201-208 (2000).
- Buntru, M., Gartner, S., Staib, L., Kreuzaler, F., Schlaich, N. Delivery of multiple transgenes to plant cells by an improved version of MultiRound Gateway technology. Transgenic Res. 22, 153-167 (2013).
- Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4262-4267 (1999).
- Heller, R., et al. Intradermal delivery of interleukin-12 plasmid DNA by in vivo electroporation. DNA Cell Biol. 20, 381-381 (2001).
- Boukany, P. E., et al. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nat Nanotechnol. 6, 747-754 (2011).
- Wang, J., et al. Synergistic Effects of Nanosecond Pulsed Electric Fields Combined with Low Concentration of Gemcitabine on Human Oral Squamous Cell Carcinoma. In Vitro PLoS One. 7, (2012).
- Kim, M. J., Kim, T., Cho, Y. H. Cell electroporation chip using multiple electric field zones in a single channel. Appl Phys Lett. 101, (2012).
- Wang, S. N., Lee, L. J.
- Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl Acad Sci USA. 110, 2082-2087 (2013).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, U649-U693 (2009).
- Ozbas-Turan, S., Aral, C., Kabasakal, L., Keyer-Uysal, M., Akbuga, J. Co-encapsulation of two plasmids in chitosan microspheres as a non-viral gene delivery vehicle. J Pharm Pharm Sci. 6, 27-32 (2003).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, U311-U313 (2007).
- Hur, S. C., Mach, A. J., Di Carlo, D. High-throughput size-based rare cell enrichment using microscale vortices. Biomicrofluidics. 5, (2011).
- Yun, H. Y., Hur, S. C. Sequential multi-molecule delivery using vortex-assisted electroporation. Lab Chip. 13, 2764-2772 (2013).
- Gehl, J. Electroporation theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiol Scand. 177, 437-447 (2003).
- Wang, J., Zhan, Y. H., Ugaz, V. M., Lu, C.
- Jia, F. J., et al. A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells. Nature Methods. 7, U146-U197 (2010).
- Dunbar, C. E. Gene transfer to hematopoietic stem cells Implications for gene therapy of human disease. Annual Review of Medicine. 47, 11-20 (1996).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M.
- Graziadei, L., Burfeind, P., Barsagi, D. Introduction of Unlabeled Proteins into Living Cells by Electroporation and Isolation of Viable Protein-Loaded Cells Using Dextran Fluorescein Isothiocyanate as a Marker for Protein-Uptake. Anal Biochem. 194, 198-203 (1991).
- Dimitrov, D. S., Sowers, A. E. Membrane Electroporation-Fast Molecular-Exchange by Electroosmosis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1022, 381-392 (1990).
- Sukharev, S. I., Klenchin, V. A., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev Yu, A. Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores. Biophysical Journal. 63, 1320-1327 (1992).
- Glogauer, M., McCulloch, C. A. G. Introduction of large molecules into viable fibroblasts by electroporation Optimization of loading and identification of labeled cellular compartments. Experimental Cell Research. 200, 227-234 (1992).
- Verspohl, E. J., KaiserlingBuddemeier, I., Wienecke, A. Introducing specific antibodies into electropermeabilized cells is a valuable tool for eliminating specific cell functions. Cell Biochemistry and Function. 15, 127-134 (1997).
