Xenopus laevis 蝌蚪倾向于在黑白相间的水箱中游向白色一侧。这种行为由其视觉引导。基于这一行为，我们提出了一种简单的检测蝌蚪视觉功能的实验方法。
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本文内容
摘要
摘要
测量非洲爪蟾（Xenopus laevis）蝌蚪的视觉功能，可实现对活体动物失明状态的筛选。视动反应是一种基于视觉的反射性行为，在所有已测试的脊椎动物中均能观察到。由于蝌蚪的眼睛很小，过去常采用尾部翻转反应作为替代检测方法，但这需要经过训练的技术人员来记录细微的行为反应。我们开发了一种新的行为检测方法，其依据是：当蝌蚪被置于一侧为黑色、另一侧为白色的水箱中时，它们倾向于游向白色一侧。本文介绍的这一检测方法成本低、操作简便，且能产生易于测量的行为反应。实验装置由三脚架、网络摄像头以及嵌套式测试水箱组成，这些材料在大多数Xenopus实验室中均容易获得。本文附有一段视频，展示了在切断视神经前后蝌蚪的行为变化。为了测试单眼功能，我们还提供了对同一只蝌蚪在连续两天内分别对其双眼进行视网膜轴突切断后的代表性实验结果。未来的研究可在此基础上开发自动化版本，以同时检测大量蝌蚪的视觉功能。
引言
非洲爪蟾 被用作研究眼睛形成的模式生物。其眼睛发育迅速，不到一周即可成熟，便于检测对视觉发育和功能有影响的基因或通路。为检测视觉功能，已在斑马鱼中应用视动反射和视动反应。 非洲爪蟾 蝌蚪，分别1,2 . 由于眼睛的 非洲爪蟾 蝌蚪体型相对小于斑马鱼，因此该检测需要使用专业设备和经过培训的人员，以识别其微小的尾部抽动和眼部运动行为 非洲爪蟾更稳健的行为 非洲爪蟾 偏好在白色背景的水箱中游泳，本文对此进行了描述3将蝌蚪放入一半黑色、一半白色的水箱中时，变态前的蝌蚪会迅速游向水箱的白色一侧。我们此前曾利用该检测方法来判断多能干细胞来源的眼睛是否具有功能。4. 在此，我们报告了该检测方法的详细版本，可用于检测变态前阶段动物的视觉功能 非洲爪蟾 蝌蚪
该实验比视觉运动反应实验更为简便，因为它仅需要一台固定的数码摄像机、数码相机软件以及大多数Xenopus实验室中常见的标准设备。此外，记录的反应结果无需特殊培训即可进行统计。我们的代表性结果显示，经历双侧视网膜轴突切断的同一批蝌蚪在水箱中随机游动。我们还提供了代表性蝌蚪的行为检测结果，展示如何对单眼进行视觉反应测试。文中附有工作表，可用于录入实验过程中获得的数据并进行分析。该工作表可用于判断所检测的蝌蚪是否具有视觉反应。
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方案
动物护理
本研究中使用的Xenopus laevis蝌蚪，均按照纽约州立大学上州医科大学动物护理与使用委员会（IACUC）以及《实验动物护理与使用指南》批准的程序进行培育、饲养和处理。
1. 行为前准备：蝌蚪
- 从商业来源获取受精的Xenopus胚胎，或如先前所述进行体外（in vitro）卵母细胞受精6。
- 将处于囊胚至神经板阶段的胚胎置于含有0.1X MMR [10 X Marc's Modified Ringer's (MMR) 溶液储备液（10 mM MgCl2；20 mM KCl；20 mM CaCl2；50 mM HEPES；1 M NaCl；调至pH 7.5，高压灭菌后室温保存）] 并添加50 µg/ml庆大霉素抗生素的60 mm培养皿中，于18 ˚C培养。每天更换0.1X MMR，并移除任何死亡胚胎。
- 当胚胎发育至Nieuwkoop和Faber阶段约27–307时 ，将胚胎转移至不含抗生素的0.1X MMR中，以促进肠道菌群生长。
- 继续培养蝌蚪直至其达到摄食阶段（阶段45），然后将其转移至盛有0.1X MMR的100 mm培养皿中。每隔一天喂食一次荨麻粉上清液，中间间隔日更换0.1X....
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结果
既往研究报道，变态前的Xenopus蝌蚪倾向于在黑白双色水箱的白色一侧游动，并将该检测称为背景颜色偏好实验3。我们对该实验进行了改进，可在不到一周的时间内检测蝌蚪单侧眼睛的视觉功能，从而便于随后取其眼睛组织进行组织学检查。
我们在此展示该反应是由视觉线索引起的。视频1中左右两个图中的蝌蚪为同一批动物。左侧为手术前的动物，右侧为切断双侧视神经后的动物。我们搅动水体以表明并未添加任何物质来驱赶动物远离黑色一侧或吸引其趋向白色一侧。在视频中，我们在底部角落提供了蝌蚪的示意图，显示了每组动物视神经的状态。视频1中，正常的未经手术的蝌蚪在测试水箱中不到30秒即对背景颜色产生反应，而失明的蝌蚪则在水箱中无目的地游动。视频播放速度已加快，实际记录时间显示在右上角。
为了检测单眼的视觉功能，我们纳入了一只动物的实验结果，该动物的一侧视神经被切断，并在我们的检测中进行了测试。另一侧视神经在两天测试后被切断，随后几天再次测试其视觉引导的行为.......
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讨论
本文报道了一种简单的视觉引导行为检测方法，经过最少培训的实验室人员可在一周内轻松完成。虽然其他检测方法需要专用设备以及动物行为学方面的专业知识，但本方法可快速测定视觉功能。另一种行为检测方法——视觉回避检测，已被开发用于研究视顶盖在Xenopus10视觉感知中的作用。该检测通过移动背景与静止背景的对比，测量空间调谐性和对比敏感度，因此能够比本文报道的简单检测方法更深入地评估基于视觉的特定行为。已有研究报道了一种自动化行为系统，可测量斑马鱼在水箱一侧停留的时间8。此外，目前也有商业软件（例如 ANY-maze 软件）可用于测量斑马鱼在黑暗或明亮环境中停留的时间9。而本文所报道的检测方法无需购买此类昂贵的设备或软件，仅依赖常规试剂和设备即可测定视觉功能。
视觉引导实验在单个动物上进行，以检测其视觉功能。当比较多只蝌蚪的行为实验结果时，我们观察到同一处理组内的动物之间无统计学差异。我们对三只蝌蚪连续测试了六天，另对五只蝌蚪连续测试了三天，每天进行十次试验。在这两种情况下，未处理组或单次轴.......
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披露
作者无任何利益冲突披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院资助：EY015748、EY017964（MEZ）和 EY019517（ASV）。本研究还得到了预防失明研究基金会向眼科系提供的无限制资助以及纽约州中部狮子会的支持。我们还要感谢我们的动物技术员 Matthew Mellini 对实验动物的精心照料，并感谢他临时参与本视频的拍摄。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1/2 加仑柔性储液罐（带盖） | eNasco | SB19271M | 尺寸：5-3/8" × 7" 3-3/4" |
| 黑色电工胶带 | |||
| 白色组织纸 | |||
| 大型接种转盘 | VWR | 50809-022 | 尺寸：直径 114.3 × H 76.2 mm（4 1/2） x 3") |
| Durasorb 防护垫 | VWR | 82004-836 | 尺寸：43.2 × 60.1 厘米（17 × 24）") |
| Kimwipe | Krackeler Scientific, Inc. | 1945-34155-CS | |
| 标准三脚架 | 各种 | ||
| iSight 摄像头或网络摄像头 | 苹果 | M8817LL/A | 较大的蝌蚪适用，但较小的蝌蚪难以观察 |
| 便携式计算机 | 苹果/个人电脑 | 各种 | 我们使用了13" MacBook，配备 2 GHz Intel Core 2 Duo 处理器，运行 MacOSX Lion 10.7.5 |
| MiniDV 便携式摄像机 | SONY | DCR-HC42 | 通过6芯和4芯alpha FireWire 400火线连接至计算机 |
| 手持摄像站 | 索尼 | DCRA-C121 | 可用于连接火线接口与相机 |
| QuickTime Player 软件 | Quicktime | 版本 10.1 | |
| 26 G 针头（5/8）" 长度 | VWR | BD305115 | |
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| 一次性用品 | |||
| 硫酸庆大霉素 [50 mg/ml] | Fisher Scientific | 17-528Z | 室温保存 |
| Sylgard 184 硅酮弹性体 | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| Instant ocean | 福斯特与史密斯医生 | CD-116528 | 储备液 = 100 克/升，室温保存 |
| 磷酸氢二钠 | Sigma Aldrich | S0876 | 储备液 = 0.4 M，室温保存 |
| 体外 受精胚胎 | eNasco | LM00490MX | 100 个胚胎/单位 |
参考文献
- Maurer, C. M., Huang, Y. Y., Neuhauss, S. C. Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders. Rev Neurosci. 22 (1), 5-16 (2011).
- Solessio, E., Scheraga, D., Engbretson, G. A., Knox, B. E., Barlow, R. B. Circadian modulation of temporal properti....
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重印与许可
