Summary
Xenopus laevis grodyngel föredrar bada på den vita sidan av en svart / vit tank. Detta beteende styrs av sin vision. Utifrån detta beteende, presenterar vi ett enkelt test för att testa synen av grodyngel.
Abstract
Mätning av synfunktionen i grodyngel i grodan, Xenopus laevis, möjliggör screening för blindhet i levande djur. Den optokinetic svaret är en vision-baserade, reflexivt beteende som har observerats i alla ryggradsdjur testade. Tadpole ögon är små så svansen flip svar användes som alternativ åtgärd, som kräver en utbildad tekniker för att registrera den subtila svar. Vi utvecklade ett alternativt beteende analys baserad på det faktum att grodyngel föredrar att simma på den vita sidan av en tank när den placeras i en tank med både svarta och vita sidor. Analysen som presenteras här är ett billigt, enkelt alternativ som skapar ett svar som lätt mäts. Installationen består av ett stativ, webbkamera och kapslade testa tankar, lätt tillgängliga i de flesta Xenopus laboratorier. Denna artikel innehåller en film som visar beteendet hos grodyngel, före och efter avskiljande synnerven. För att testa funktionen hos ett öga, vi inkluderar även representativa resultatet av ett grodyngel i vilken varje öga gick retinal axotomi på varandra följande dagar. Framtida studier skulle kunna utveckla en automatiserad version av denna analys för att testa visionen om många grodyngel på en gång.
Introduction
Xenopus laevis har använts som modellorganism för att studera ögonbildning. Ögonen utvecklas snabbt, växer till mognad på mindre än en vecka för att testa gener eller vägar som har en effekt på visuell utveckling och funktion. För att testa synen, har optokinetic och optomotor svar använts i zebrafisk och Xenopus grodyngel, respektive 1,2. Eftersom ögonen på Xenopus grodyngel är relativt mindre än zebrafisk, kräver denna analys användning av specialutrustning och utbildad personal för att upptäcka subtila svans-flip och ögonrörelsebeteende i Xenopus. En mer robust uppträdande i Xenopus är preferensen för simning i en tank med en vit bakgrund, som beskrivs häri 3. Vid placering av ett grodyngel i en halv svart / halv-white tank, simmar pre-metamorphic grodyngel snabbt till den vita sidan av tanken. Vi använde tidigare denna analys för att avgöra om pluripotenta cell-derivedögon var funktionella 4. Här rapporterar vi en detaljerad version av denna analys, som kan användas för att testa den visuella funktion premetamorphic Xenopus grodyngel.
Denna analys är enklare än optomotor svarsanalysen, eftersom det bara kräver en monterad digital videokamera, digitalkamera programvara och standardutrustning finns i de flesta Xenopus laboratorier. Dessutom kräver den inspelade svar ingen särskild utbildning för att Tally resultat. Vår representativa resultat visar att samma grupp av grodyngel som genomgått dubbel retinal axotomy, simmar slumpmässigt runt tanken. Vi har också tagit med de beteendeanalysresultat från ett representativt grodyngel, som visar hur ett öga kan testas för visuell respons. Ett kalkylblad har tagits så att siffrorna som förvärvats under analysen kan sättas in och analyseras. Detta arbetsblad kan användas för att bestämma huruvida de testade grodyngel ha en visuell respons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurvård
Xenopus laevis grodyngel som användes i denna studie odlades, upp och behandlas i enlighet med förfaranden som godkänts av Upstate Medical University IACUC och Guide för skötsel och användning av försöksdjur.
. 1 Pre-beteende Setup: Grodyngel
- Erhåll befruktade Xenopus embryon från en kommersiellt tillgänglig källa eller in vitro-befruktning av oocyter, som tidigare beskrivits 6.
- Placera blastula till neurala plattan stegsembryon vid 18 ˚ C i 60 mm Petri-skålar innehållande 0,1 x MMR [10 X Marc modifierade Ringers (MMR)-lösning lager (10 mM MgCl2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl2, 50 mM HEPES; 1 M NaCl; justerades till pH 7,5, autoklaverades och lagrades vid RT)] med 50 fig / ml gentamicin antibiotikum. Byt 0,1 x MMR varje dag och ta bort eventuella döda embryon.
- När embryona når Nieuwkoop och Faber scenen ~ 27-30 juli, byta ee embryon i 0,1 x MMR utan antibiotika för att tillåta tarm bakterietillväxt.
- Odla grodyngel tills de når utfodring stadium (stadium 45) och flytta dem till 100 mm petriskålar fyllda med 0,1 x MMR. Mata dem nässla pulver supernatanten varannan dag i en vecka, att ändra 0,1 x MMR på den mellanliggande dagen.
- Efter en vecka i 100 mm petriskål, flytta djuren till halv gallon tankar fyllda med grodan vatten [0,5 g / L omedelbar havet och 2 mM Dinatriumvätefosfat (Na 2 HPO 4: mw 141,96) pH 6,8]. Mata dem som i steg 2.4, men byta vatten bara 2-3 gånger i veckan, när vattnet är grumligt. Behåll djuren i en 12 hr light/12 mörka ljuscykel med belysningen slår på klockan 6.
- Placera halv-liters tank med försökspersonerna på en vit yta som en laboratoriebänk underpad, minst 12 tim O / N, före testning.
- Testgrodyngel i stegen 45 till 50 som beskrivs i steg 3 nedan.
. 2 Pre-beteende Setup: Equipment
- Ställ åt sidan ett område på labbet för beteende-analys. Det bör vara i en tyst, låg-trafik område med standard lysrör.
- Förbered test tankar för djuren.
De kapslade, halv-gallon testlådor består av två delar: en inre tank som håller vattnet och grodyngel; och en yttre tank med den visuella stimulus.- För den inre tanken, göra en liten markering på ytterhörn med en Sharpie, 5 cm från botten; detta är den vattenlinje (Figur 1A, grön streckad linje).
- Även för innertanken, fylla divets i tanken (i hörnen och i mitten) med en inert förening, som Sylgard elastomer. OBS: De grodyngel kommer att dröja sig kvar i dessa områden om de inte fylls i.
- För yttertanken, täcker exakt en halv av utsidan av en tank med svart elektrisk tejp och den andra hälften med den vita mjukpapper Figur 1B.
- Placera tankar påinokulering skivspelare.
- Setup webbkameran / stativ så att det framför testtankarna. Justera kameran för att möjliggöra visualisering av testområdet, såsom visas i fig. 1C.
- Anslut webbkameran till en dator med QuickTime Player installerad 5. Slå på kameran. I QuickTime Player, under Arkiv, välj "Ny filminspelning." Beteendet analys installationen kommer att synas på datorn direkt.
- Drapera en lätt bomullstyg över hela installationen för att minska yttre signaler som kan påverka grodyngel beteende, liksom, minska reflekterat ljus på vattenytan.
- Se till att ljusstyrkan under trasa åtgärder mellan 35-50 cd / m 2.
3. Beteende analys
- Fyll inre testtanken till 5 cm vattenmärke i steg 1.2.1 med groda vatten.
- Med hjälp av ett litet nät, rör försiktigt djuret in i den inre testtanken.
- Öppna QuickTime programvara på datorn och med hjälp av den yttre tanken som en guide, se till att kameran har möjlighet att visualisera och spela in testområdet.
- Skriv djurets namn, datum och tid på en bit papper och spela in med kameran.
- Placera testbehållaren i den yttre behållaren med den svarta sidan av tanken till höger Figur 2.
- Börja spela in filmen direkt efter att arrangera tanken och ställa timern på 2 minuter.
- När timern piper, ta bort den inre provtanken, vrid den yttre tanken 180 ° och placera den inre provflaska i ytterbehållaren. Starta timern. Notera: den svarta sidan ska nu vara på den andra sidan.
- Upprepa steg 3.7, åtta gånger för totalt tio försök. Använd figur 2 som en guide, kontroll av varje försök.
- Upprepa beteendet analysen på två separata dagar.
4. Retinal Axotomy
- Placera djuret i 0,02% tricaine tills de svarar intetill en svans nypa med en # 3 pincett.
- Smält 1% agaros i 0,1 x MMR och lägg sedan till en 60 mm petriskål. När svalnat, gör en liten rektangulär divot i agaros och lägga till grodyngel till divot med en liten 0,02% tricaine, så att djuret är delvis nedsänkt i vätskan.
- Pierce huden vid en 45 graders vinkel bakom den dorsala regionen av ögat med en 25 G nål, medan stag djuret mot pincett på motsatta sidan.
- Ta hand inte att klippa venen, som ligger bredvid synnerven, försiktigt nå in i hålet med # 5 pincett, klipp synnerven och vända den ur vägen. Om det finns allvarlig blödning på grund av misstag snipping artären, sedan snabbt placera djuret i 2% tricaine att avliva. VARNING: 2% tricaine lösning kan orsaka domningar i människor. Denna lösning bör hanteras med handskar.
- För att återvinna djuret efter operationen, placera djuret i 100 mm petriskål med 0,7 X MMR och 50 pg / ml gentamicin under 20 min. Next, överföring grodyngel till återvinningstanken med groda vatten. Låt djuret vila O / N.
- Nästa morgon, testa den visuella funktion som beskrivits ovan (steg från 3,1 till 3,9).
5. Analysera resultat
- Efter att försöken avslutats, mäta mängden tid grodynglet stannar på den svarta sidan av tanken.
- Visa manuellt video med programvara som visar tiden och tillåter ofta förekommande pauser. Titta på tiden videodisplayen. Skriv ner starten av den två-minuters försök, vilket är när den inre tanken häckar framgångsrikt inuti den yttre tanken och kvadreras i kamerans synfält.
- Använd läget för grodyngel ögon att definiera vilken sida av tanken djuren simmar på. Definiera korsa över från den ena sidan av tanken till den andra endast när båda ögonen har passerat den svart / vita linjen.
- Skriv ner i början och slutet av varje intervall (i sekunder) att djuret spenderar på den svarta sidan. Pausa och återwind videon att säkerställa noggrannheten. Totalt avsnittet i varje försök.
- Ingång dessa siffror i den bifogade Beteende kalkylblad. Kalkylbladet beräknar förhållandet mellan tid att djuret spenderas på den vita sidan genom att subtrahera tid på den svarta sidan av tanken från den totala sek rättegången 120 och dividera med den totala tiden i sek [(120 - summa sekunder spenderas på den svarta sidan) / 120 sek]. Medelvärden kalkylblads detta förhållande under alla 10 försök.
- Använd en students T-test, parade, tvåsidiga fördelningen för att fastställa om de prövningar mellan dagarna är signifikant (P ≤ 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidigare rapporter har visat att premetamorphic Xenopus grodyngel föredrar att simma på den vita sidan av en svart / vit tank och kallas denna analys, Bakgrundsfärg Preference analys 3 Vi har ändrat denna analys för att testa den visuella funktion av ögonhålornas av grodyngel i mindre än en vecka. På detta sätt kan deras ögon skall samlas in för histologisk undersökning.
Vi visar här hur svaret beror på visuella referenser. I film 1, grodyngel i vänster och höger paneler är samma djur. Till vänster är djuren före operationen och till höger, djuren efter att bryta båda synnerverna. Vi virvlade vattnet för att visa att inget läggs till stöta bort djuren från den svarta sidan eller locka dem till den vita sidan. I filmen, tillhandahåller vi en schematisk bild av grodyngel i de nedre hörnen, som visar tillståndet av synnerven för varje uppsättning av djur. I film 1, normal, un-manövrerade grodyngel svara på bakgrundsfärgen på mindre än 30 sekunder i testtanken medan blindgrodyngel simma planlöst runt tanken. Hastigheten av filmerna ökades och den faktiska tid registreras i det övre högra hörnet.
För att testa den vision av ett öga, har vi inkluderat resultat från ett djur vars synnerv var avskurna på ena ögat och testas i vår analys. Den optiska nerven i det andra ögat var avskurna efter två dagar av tester, och visionen styrda beteende testas på följande dagar igen. I fig. 3 visar en graf av mängden tid grodynglet valde att simma på den svarta sidan av tanken. Detta mättes på sex på varandra följande dagar Figur 3A. Såsom beskrivits ovan, den högra synnerven avskiljes efter uppträdande testades på dag 2 och vänster, efter beteende test på dag 4. Grodynglet föredrages den vita sidan av tanken slumpvis på 50% av tiden figur 3C. Lägg märke till att enimal spenderade mer tid på den vita sidan av tanken under de senaste 6 försök på dag 1 till 4. Den tid som spenderas på den svarta sidan var jämnare på dag 5 och 6, när djuret var blind på båda ögonen. Resultaten från var och en av de två dagar beräknades tillsammans och presenteras i en grafisk form figur 3C.
Figur 1. Experimentell uppställning av visionsstyrd beteendeanalys. (A) Innerprovtanken förblir öppen och är märkt för att ange vattennivåer (grön streckade linjer i hörnet). (B) Ytterprovtanken är täckt i svart eltejp på ena halvan och vitt silkespapper på den andra. (C) De grodyngel visualiseras med hjälp av en webbkamera placerad på ett stativ och ansluts till en bärbar dator. Testningen tanks vila på en ympa skivspelare för att möjliggöra enkel vridning mellan försöken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Schematisk bild av hur visionen styrda beteende analys utförs. Rektanglarna representerar testtanken, visar hur den hälften vit / halvförändringar svart område med varje försök. Detta kan användas under beteende-analys för att markera testnummer. Test tanken till höger är en närbild av grodyngel och dess förväntade beteende under två min analys. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
hin-page = "alltid"> 
Figur 3. Ett representativt experiment tallying den andel av tiden grodynglet simmade på den vita sidan av provbehållaren. (A) Storleken på sek grodyngel som spenderas på den svarta sidan av tanken uppmätes och placeras i en tabell. (B ) Tabellen i A omvandlas till den procentuella andelen tid som tillbringas på den vita sidan av tanken. Detta görs genom att subtrahera sekund spenderas på den svarta sidan från den totala försökstiden (120 sek) och dividera med 120 sek. Grodyngel som var obehandlade (U), hade en enda axotomy (SA) och sedan en dubbel axotomy (DA) testades. (C) Diagrammet representerar den genomsnittliga andelen tid i den vita sidan (vit stapel) och svart sida ( svarta fältet). I tabellen används för att göra grafen visas nedan.g3highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1. Behavioral respons av seende och blinda djur i den vita bakgrunden föredrar analys. Grodyngel i vänster och höger sida är samma, men de på höger har genomgått dubbel retinal axotomy. En schematisk i de nedre hörnen visar om synnerven är intakt eller avskurna (blå stapel). Timern i det övre högra hörnet anger tid. Filmen är påskyndas för enklare visning. En gång i det vita området, märker hur de grodyngel simmar nära gränsen mellan vitt och svart och bakåt. Klicka här för att se filmen.
| Day 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | Dag 5 | Dag 6 | |
| Trial 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Försök 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Prov 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Trial 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Prov 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 </ Td> | 0 |
| Prov 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Prov 7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Prov 8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Prov 9 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Prov 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Kvoten av tiden spenderas på vita sidan | ||||||
| Ratio 1 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Ratio 2 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Ratio 3 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Ratio 4 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Kvot 5 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Kvot 6 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Ratio 7 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Ratio 8 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Förhållande 9 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Förhållandet 10 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Genomsnitt | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | <td> 1.00|
| Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | Dag 5 | Dag 6 | |
| Trial 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 69 | 69 |
| Försök 2 | 0 | 3 | 0 | 88 | 68 | 58 |
| Prov 3 | 7 | 0 | 28 | 0 | 58 | 47 |
| Trial 4 | 0 | 0 | 11 | 0 | 59 | 72 |
| Prov 5 | 0 | 0 | 7 | 22 | 57 | 57 |
| Prov 6 | 1 | 98 | 4 | 56 | 69 | 53 |
| Prov 7 | 0 | 13 | 33 | 24 | 44 | 57 |
| Prov 8 | 0 | 113 | 38 | 24 | 36 | 64 |
| Prov 9 | 0 | 0 | 4 | 43 | 60 | 57 |
| Prov 10 | 1 | 21 | 0 | 32 | 63 | 80 |
| Kvoten av tiden spenderas på vita sidan > | ||||||
| Ratio 1 | 100% | 100% | 100% | 100% | 43% | 43% |
| Ratio 2 | 100% | 98% | 100% | 27% | 43% | 52% |
| Ratio 3 | 94% | 100% | 77% | 100% | 52% | 61% |
| Ratio 4 | 100% | 100% | 91% | 100% | 51% | 40% |
| Kvot 5 | 100% | 100% | 94% | 82% | 53% | 53% |
| 99% | 18% | 97% | 53% | 43% | 56% | |
| Ratio 7 | 100% | 89% | 73% | 80% | 63% | 53% |
| Ratio 8 | 100% | 6% | 68% | 80% | 70% | 47% |
| Förhållande 9 | 100% | 100% | 97% | 64% | 50% | 53% |
| Förhållandet 10 | 99% | 83% | 100% | 73% | 48% | 33% |
| Genomsnitt | 99% | 79% | 90% | 76% | 51% | 49% |
Arbetsblad 1. Vit bakgrund föredrar analysbladet. Detta kalkylblad har beräkningarna byggda så att den kan användas för att ange siffror och avprickning resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi redovisar här en enkel syn-guidad beteendeanalys som lätt kan utföras på mindre än en vecka efter minimalt utbildad laboratoriepersonal. Medan andra analyser kräver specialutrustning och kompetens inom djurs beteende, gör denna analys ett snabbt test för att fastställa visuell funktion. En annan beteendeanalys, Visual Undvikande analysen, har utvecklats för att bestämma hur tectum bidrar till visuell perception i Xenopus 10. Denna analys mäter spatial inställning och kontrastkänslighet som svar på ett rörligt kontra stabil bakgrund, och därmed kan mäta mer specialiserad vision-baserade beteende än den enkla analysen redovisas här. Ett automatiserat beteende systemet har rapporterats som kan mäta hur mycket tid som läggs på ena sidan av tanken 8. Det finns också att köpa i handeln (t.ex. ANY-labyrint programvara) som har använts för att mäta den tid zebrafisk bringar i mörka eller ljusa miljöer 9. I enssay rapporterar vi här inte kräver inköp av dessa typer av dyr utrustning eller mjukvara, utan i stället förlitar sig på vardagliga reagenser och utrustning för att mäta synfunktionen.
Visionen guidad analysen utförs på ett djur för att testa sin visuella funktion. När man jämför de beteendeanalysresultat från flera grodyngel till varandra, observerade vi ingen statistisk skillnad mellan djur inom behandlingsgrupperna. Vi testade tre grodyngel på sex dagar i följd och även testat ytterligare fem djur på tre dagar i följd, kör tio försök per dag. I båda fallen fann vi inga statistiskt signifikanta förändringar hos de obehandlade eller enkel axotomi grupperna (P = 0,2067), men ändå erhölls en statistiskt signifikant förändring, när dessa djur jämfördes med den dubbla axotomi gruppen (P = 0,002). Detta mättes med användning av Prism 6.0c mjukvaran som kör en två-vägs ANOVA statistisk test med Tukeys multipla jämförelsetest (n = 8 grodyngel). För att få maximalmängd datapunkter före operationen, föreslår vi att du använder beteendeanalys sex dagar. Om resultat måste erhållas snabbare med mindre degeneration av vävnaden, föreslår vi att du använder den tre dagar systemet.
Denna analys testar ett djur i taget. Vi utförde pilotstudier för att se om två grodyngel eller mer kan mätas samtidigt. För att avgöra om de har två grodyngel i en tank påverkade att de föredrar den vita sidan av tanken, testade vi varje grodyngel för sig och sedan tillsammans. Eftersom bilderna togs ovanför tanken, om grodyngel simmade över eller under varandra under en längre tid, fann vi det svårt att skilja dem åt. Om vi använde grodyngel i olika storlekar, konstaterade vi att den större skulle påverka där den mindre simmade. Framtida teknik skulle kunna utvecklas till genetiskt markera grodyngel, vilket skulle möjliggöra en bättre uppföljning av flera djur av samma storlek.
Vid utförandet av denna analys på dussintals tadpoles, konstaterade vi att vissa grodyngel drog den vita sidan mer konsekvent än andra. Grodynglar, vars beteende varierade med mer än 10% på två på varandra följande dagar, skulle vi ta testades igen på en tredje dagen före operation. Detta kan ha varit på grund av en annan iakttagelse: vi märkte att placera djuren på en vit bakgrund också gjort en skillnad i deras preferens för den vita sidan av tanken. Att ha den extra dag kan ha hjälpt skick några grodyngel att föredra den vita sidan av tanken. En begränsning med denna analys är att den testar endast synfunktionen. Variabiliteten vi observerade kan bero på andra utvecklingsdefekter, förutom nedsatt synfunktion eller blindhet. Av denna anledning fick djuren som uppvisade mindre än 60% preferens för kirurgi inte testas vidare.
Vi testade också en rad olika åldrar av pre-metamorfa grodyngel. Vi fann att grodyngel yngre än etapp 45 var mycket små och deras ögon var svåra att spåra använda vår vibcam. Äldre grodyngel (etapp 51 - 55 +) var mer distraherad; även om de i slutändan tillbringade mer tid på den vita sidan av tanken, de verkar ta längre tid att bada där. Dessa äldre djur var större, och därför lättare att spåra, men behövs för testning före kirurgi såsom angivits ovan. Däremot de flesta grodyngel i stadium 45 upp till 50 betedde sig som förväntat och djur i dessa åldrar skulle vara bäst att använda i framtida studier.
Dygnsrytm ljus förändringar har visats påverka visionsstyrd beteendemässiga reaktioner i Xenopus 2. I överensstämmelse med denna observation, märkte vi att samma djur som snabbt simmade till den vita sidan av provbehållaren i studier som genomfördes på morgonen, tog mycket längre tid under eftermiddagen beteendetester. Efter att ha utfört ett antal "samma djur / annan tid" försök, vi fastställt den bästa tiden för beteendet analysen var från 06:00 till 13:00.
Vi har även använt en digital handheld videokamera ansluten via firewire till försöksdjur i svagt ljus 5. Detta tillät testning av natten eller mörkerseende, där djuret använder sitt spö fotoreceptorer att se. Villkor förändrades genom att helt enkelt hitta den minsta mängden ljus som krävs för djuret att utföra visionsstyrd analys. Analysen presenteras här testar fotopiska synen, där djuret använder oftast sina kon fotoreceptorer att se. Genom att kombinera dessa metoder, båda typerna av visioner, scotopic och fotopiska, kan testas.
Vi använde denna analys för att testa synen av djur med en ektopisk öga vuxit från pluripotenta celler som överuttrycker de inneboende uttryckt ögonfälttranskriptionsfaktorer och den yttre faktorn, Noggin. Ögon som genereras från dessa vävnader var funktionella 4,11. Noggin spelar också en roll i anterior centrala nervsystemet utveckling 12 men med användning av denna vision styrd analys jämförd med djur cap transplant analys, var dess roll i ögats utveckling avslöjats. Andra yttre faktorer som påverkar tidig embryobildning, men har ännu inte visat sig ha en roll i ögats utveckling kan inducerad retinal progenitor bildning i pluripotenta djur cap celler 4,11. Med användning av detta beteendeanalys kan framtida studier bestämma den visuella funktionen av dessa nyligen genererade ögon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats genom anslag från National Institutes of Health: EY015748, EY017964 (MEZ), och EY019517 (ASV). Detta arbete stöddes också av den forskning för att förebygga blindhet Fritt Grant till Ophthalmology avdelningen och Lions i centrala New York. Vi vill även tacka vår djurtekniker, Matthew Mellini, för hans utmärkta hand om djuren och för att kliva in till stjärna i den här videon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/2 Gallon Flex-Tank with Cover | eNasco | SB19271M | Size: 5-3/8" x 7" x 3-3/4" |
| Black electrical tape | |||
| White tissue paper | |||
| Large inoculating turntable | VWR | 50809-022 | Size: Dia 114.3 x H 76.2 mm (4 1/2 x 3") |
| Durasorb underpad | VWR | 82004-836 | Size: 43.2 x 60.1 cm (17 x 24") |
| Kimwipe | Krackeler Scientific, Inc. | 1945-34155-CS | |
| Standard tripod | Various | ||
| iSight camera or webcam | Apple | M8817LL/A | Good for larger tadpoles but small ones are difficult to see |
| Portable computer | Apple/PC | Various | We used a 13" MacBook, 2 GHz Intel Core 2 Duo running MacOSX Lion 10.7.5 |
| MiniDV handycam camcorder | SONY | DCR-HC42 | Connected by firewire to the computer with a 6-conductor and 4-conductor alpha FireWire 400 |
| Handycam station | SONY | DCRA-C121 | This can be used for connecting firewire to camera |
| QuickTime Player software | Quicktime | Version 10.1 | |
| 26 G Needle (5/8" length) | VWR | BD305115 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Disposables | |||
| Gentamicin sulfate [50 mg/ml] | Fisher Scientific | 17-528Z | Stored at RT |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| Instant ocean | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Stock solution = 100 g/L stored at RT |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S0876 | Stock solution = 0.4 M stored at RT |
| In vitro fertilized embryos | eNasco | LM00490MX | 100 embryos/unit |
References
- Maurer, C. M., Huang, Y. Y., Neuhauss, S. C. Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders. Rev Neurosci. 22 (1), 5-16 (2011).
- Solessio, E., Scheraga, D., Engbretson, G. A., Knox, B. E., Barlow, R. B. Circadian modulation of temporal properties of the rod pathway in larval Xenopus. J Neurophysiol. 92 (5), 2672-2684 (2004).
- Moriya, T., Kito, K., Miyashita, Y., Asami, K. Preference for background color of the Xenopus laevis tadpole. J Exp Zool. 276 (5), 335-344 (1996).
- Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7 (8), (2009).
- Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (1), 364-373 (2011).
- Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue determination using the animal cap transplant (ACT) assay in Xenopus laevis. J Vis Exp. 16 (39), (2010).
- Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).
- Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A second-generation device for automated training and quantitative behavior analyses of molecularly-tractable model organisms. PLoS One. 5 (12), (2010).
- Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Dong, W., et al. Visual Avoidance in Xenopus Tadpoles is Correlated With the Maturation of Visual Responses in the Optic Tectum. J Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
- Lan, L., et al. Noggin Elicits Retinal Fate In Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 27 (9), 2146-2152 (2009).
- De Robertis, E. M., Kuroda, H. Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).
