Introduction
وتستمد الجذعية الجنينية (ES) خلايا من الكتلة الخلوية الداخلية من الكيسة مرحلة الأجنة 1. تحت ظروف التربية المناسبة التي تجديد الذات والبقاء المحفزة. في عام 2006 أظهرت ياماناكا وزملاؤه أن الخلايا الناضجة يمكن برمجتها إلى ما يسمى الجذعية المحفزة (آي بي إس) الخلايا عن طريق التعبير القسري للعوامل النسخ أكتوبر 4، KLF-4، سوكس-2، C-MYC (OKSM) 2. خلايا الجذع، مثل خلايا ES، يمكن أن تؤدي إلى كل أنواع الخلايا في الجسم، ومع ذلك، لأنها خالية من القيود الأخلاقية المحيطة توليد خلايا ES 3. وعلاوة على ذلك، خلايا الجذع تحمل الوعد شخصية الطب التجديدي وعقد إمكانات هائلة لتطبيقات مثل النمذجة المرض والمخدرات في المختبر فحص 4،5. من أجل إعادة برمجة التكنولوجيا لتحقيق هذه الإمكانات، والآلية الأساسية لإعادة برمجة النووية يحتاج إلى أن يفهم بشكل كامل. ومع ذلك، فإن الجهود لتشريح بات برمجةوقد أعاق hway من حقيقة أنه ليس هناك سوى عدد قليل جدا من الخلايا إعادة برمجة (0.1-1٪). وقد تم الإبلاغ عن إعادة برمجة الخلايا الليفية بنجاح للخضوع لسلسلة متميزة من الأحداث بما في ذلك الوسيطة إلى انتقال الظهارية 6-10، وفي المراحل النهائية من إعادة برمجة، وتفعيل الشبكة الأساسية تعدد القدرات الذاتية 11-14. نحن وغيرنا 12،13،15-17 قد حددت مؤخرا مجموعة من علامات سطح الخلية التي تسمح للفصل بين سيطة نادرة من السكان بالجملة الحرارية. إعادة برمجة الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs) يحدث لها تغيرات في التعبير عن خاصتك-1.2، Ssea1 وEpcam (وغيرهم) خلال عملية إعادة برمجة 2 أسابيع طويلة 15. في وقت مبكر خلال إعادة برمجة مجموعة فرعية من MEFs أسفل تنظيم التعبير عن علامة هوية الخلايا الليفية (خاصتك 1.2) ثم قم بتشغيل التعبير عن تعدد القدرات المرتبطة علامة SSEA-1 12. خلال المراحل النهائية من إعادة برمجة خلايا Ssea1 إيجابية reactivأكل الجينات تعدد القدرات الذاتية مثل أكتوبر 4 10-13،15. ويتميز هذا التحول الأخير على سطح الخلية التعبير كشفها من Epcam (انظر الشكل 1) أو في مرحلة لاحقة PECAM 15. مؤخرا، ذكرت أومالي آخرون استخدام CD44 وiCAM1 كبدائل أو مكملة لدنك 1.2 وSSEA-1 لتحديد سيطة إعادة برمجة. لقد سبق FACS استخراج سيطة إعادة برمجة من يوم 0، 3 يوم، يوم 6 والثقافات ويوم 9 يوم 12 إعادة برمجة، وكذلك من خطوط الخلايا المحفزة أنشئت على أساس هذه العلامات سطح الخلية 15،18. لإعادة برمجة النظام والشروط الموضحة أدناه أظهرنا على مستوى خلية واحدة على الرغم من أن السكان هادئة متجانسة، هناك درجة معينة من عدم التجانس في السكان وسيط تحديدها. تجدر الإشارة إلى أن مجموعة فرعية فقط من الخلايا داخل هؤلاء السكان هي قادرة على التقدم إلى ستا المقبل منهاجنرال الكتريك لعملية إعادة برمجة وتؤدي إلى مستعمرات الخلايا المحفزة على الكفاءات المختلفة، التي تميزت على نطاق واسع في وقت سابق 15،19. وعلاوة على ذلك، فإن كفاءة إعادة برمجة هؤلاء السكان يعتمدون كذلك على إعادة الطلاء وثقافة الظروف. لزيادة استنساخ التجريبي نستخدم سلالة الماوس قابل للبرمجة التي تم تصميمها للتعبير عن transactivator النسخي (m2rtTA) تحت سيطرة موضع Rosa26 وكاسيت OKSM متعدد المقارين تحت سيطرة الدوكسيسيكلين المروج استجابة 20،21. باستخدام هذا نموذج الفأر تلتف الآثار الجانبية غير المرغوب فيها من أساليب الفيروسية التقليدية من جيل خلية الجذع، أي السكان غير متجانسة مع انطلاق الخلية إلى خلية التغير في عدد وموقع من المواقع دمج إدراج الفيروسية. وأن عبرت سلالتين الماوس المعدلة وراثيا (OKSM، m2rtTA)، المتاحة كحيوانات مؤسس متماثلة اللواقح في مختبر جاكسون، من أجل إنشاء reprograنموذج الفأر mmable (انظر الشكل 2). في هذا المخطوط ونحن تصف بالتفصيل كيفية اشتقاق MEFs، وتوليد خلايا الجذع، وعزل سيطة إعادة برمجة في مراحل مختلفة من عملية التحويل من نظام مراقبة الأصول الميدانية.
Protocol
1. صك إعدادات / إعداد الكاشف / انماط
- إعداد الخلايا المحفزة المتوسطة: الملحق 500 مل خروج المغلوب DMEM سائل الاعلام مع المصل 75 مل الجنين البقري (FBS)، 5 مل L-الجلوتامين، 5 مل الأحماض الأمينية غير الأساسية، 500 ميكرولتر β-المركابتويثانول، 5 × 10 5 وحدات سرطان الدم العامل المثبط ( LIF). يرجى الرجوع إلى قائمة المواد للمنتج والمعلومات الشرائية للمواد المستخدمة في سياق هذه المخطوطة.
- إعداد المتوسطة MEF: الملحق 500 مل DMEM سائل الاعلام مع 50 مل FBS، 5 مل L-الجلوتامين، 5 مل الأحماض الأمينية غير الأساسية، 5 مل البيروفات الصوديوم، و 500 ميكرولتر β-المركابتويثانول.
- إعداد تجميد المتوسطة: ل10 مل، والجمع بين 9 مل من FBS مع 1 مل من DMSO.
- إعداد أطباق الجيلاتين المغلفة إضافة 3-5 مل 0.1٪ محلول الجيلاتين الخنزيري إلى قارورة T75، في احتضان RT لمدة 10 دقيقة على الأقل، ونضح الحق قبل الاستخدام.
- إعداد نظام مراقبة الأصول الميدانية وضع العلامات المتوسطة: ل10 مل، والجمع بين 9.9 مل من برنامج تلفزيوني مع 0.1 مل من FBS.
- أداءوالتنميط الجيني PCR لموضع Rosa26 m2rtTA: إجراء التفاعلات مع طق البلمرة DNA وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. استخدام تعديل MgCl 2 -concentration من 3.5 ملي والاشعال 3 التالية: oIMR8052: 5 'GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC 3'، oIMR8545: 5'AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT 3 '، oIMR8546: 5' GGA GCG GGA غا ATG GAT ATG 3 '. شروط الدراجات: 94 ° C لمدة 3 دقائق. 35 دورات (94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة). 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. عقد في 12 درجة مئوية. يتوقع حجم المنتج: 650 نقطة أساس النوع البري للأليل و 340 نقطة أساس لأليل متحولة.
- إجراء التنميط الجيني PCR لموضع الكولاجين-StemCa / OKSM: إجراء تفاعلات البلمرة طق مع الحمض النووي وفقا للتعليمات. استخدام تعديل MgCl 2 -concentration من 2.5 ملي والاشعال 3 التالية: العقيد / FRT-B: "CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3 '5، العقيد / frtA1: 5' GCACAGCATTGCGGACATGC 3 '، العقيد / frtC1: 5' GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG 3 '. شروط الدراجات: 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة: 2 دورات (94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 70 درجة مئوية لمدة 45 ثانية)، و 6 دورات من (94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 68 درجة مئوية لمدة 45 ثانية) و 30 دورات من (94 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة). 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. عقد في 12 درجة مئوية. يتوقع حجم المنتج: 331 نقطة أساس النوع البري للأليل و 551 نقطة أساس لأليل متحولة.
- تنفيذ جميع الخطوات الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 3 دقائق على 4 درجات مئوية.
2. الجيل من الفأر الجنينية الخلايا الليفية
- إجراء التزاوج بين توقيت حيوان من سلالة OKSM مع عضو من الجنس الآخر من سلالة m2rtTA. الأجنة الحصاد في يوم الجنينية 13.5 من اعدام الأم وإزالة قرن الرحم. قبل إزالة قرن الرحم، رش منطقة البطن بمحلول الإيثانول 80٪، لتجنب التلوث الميكروبي.
- نقل قرن الرحم إلى 10 سم صحن زراعة الأنسجة تحتوي على 10 مل من معقم الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). استخدام معقم مقص الصف الجراحية لقطع قرن الرحم إلى أجزاء تحتوي على جنين واحد (انظر الشكل 3A، B).
- استخدام مجهر تشريح (في موقع مثالي على ثقافة غطاء محرك السيارة الأنسجة) وملقط معقم لإزالة بعناية المغلف الرحم والأغشية الجنينية خارج المحيطة بكل الجنين. نقل كل جنين إلى 10 سم طبق منفصل مع 10 مل من برنامج تلفزيوني.
- المضي قدما بإزالة رأس الجنين، وأطرافه، وذيل والأعضاء الداخلية (القلب، الكبد، الأمعاء وغيرها) مع ملقط (انظر الشكل 3C). نقل رأس الجنين في أنبوب 1.5 مل وتجميد أسفل بحيث يمكن استخدامه لالتنميط الجيني إذا لزم الأمر.
- الجذع نقل الجنين إلى لوحة فارغة 10CM واستخدام اثنين من ريش الجراحية لتخطر على الجنين لمدة 2 دقيقة. إضافة 200 ميكرولتر من محلول التربسين / EDTA على رأس الجنين المفروم واحتضان لمدة 3-5 دقيقة في RT. مواصلة تنميق ل2 دقيقة إضافية، إضافة 2 مل من وسائل الإعلام MEF لفي تنشيط التربسين، ومن ثم نقل في أنبوب 15 مل.
- استخدام ماصة 1،000 ميكرولتر لمزيد ميكانيكيا فصل الأنسجة من قبل pipetting لطيف. نقل إلى الجيلاتين المغلفة طبق 10 سم وإضافة إضافي 10 مل من وسائل الإعلام MEF. ملاحظة: كل حاضنات normoxic ونقص الأوكسجين يمكن استخدامها للثقافة، ارجع إلى نقاش لمزيد من المعلومات.
- بعد 24-48 ساعة لوحة يجب تغطية كثيفة مع MEFs.
- بدلا من ذلك، فإن الخلايا يمكن بعد ذلك نشر المزيد من المجمدة أو أسفل. لتجميد الخلايا، وإزالة وسائل الإعلام والثقافة، وشطف الطبق مع 10 مل PBS لإزالة آثار وسائل الإعلام وتراكب مع 3 مل التربسين حل / EDTA. احتضان لمدة 3-5 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وتعطيل التربسين الهضم عن طريق إضافة 5 مل من وسائل الإعلام MEF ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. تدور باستمرار و resuspend بيليه في 3 مل تجميد سائل الإعلام. نقل إلى 3 cryovials وتجميد أسفل في حاوية تجميد الخلية.
3. إعادة برمجة MEFs
ove_content "> ملاحظة: خلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، واستخدام normoxic حاضنات زراعة الأنسجة لإعادة البرمجة ويمكن أن يكون مفيدا لاستخلاص وتوسيع MEFs تحت ظروف نقص الأوكسجين (5٪ أكسجين، انظر المناقشة لمزيد من المعلومات. ).- ذوبان الجليد بسرعة منخفضة cryovial مرور (P0-P1، 2-3 خلايا ميو) في حمام مائي (37 ° C) ونقل المحتويات إلى أنبوب مع 10 مل من وسائل الإعلام MEF قبل حرارة. خلايا بيليه، resuspend في وسائل الإعلام MEF 12 مل الطازجة، ونقل إلى الجيلاتين المغلفة سفينة الثقافة T75، وتسمح للخلايا لاسترداد لمدة 24-48 ساعة قبل المتابعة. ملاحظة: يمكن أيضا أن تستخدم MEFs مباشرة بعد الاشتقاق.
- بعد إزالة وسائل الإعلام والثقافة، وغسل MEFs مع برنامج تلفزيوني وcellularize بواسطة تتراكب مع حل التربسين / EDTA (3 مل لمدة 3-5 دقيقة عند 37 درجة مئوية). إخماد التربسين عن طريق إضافة 5 مل من وسائل الإعلام MEF وزيادة فصل الخلايا عن طريق خلط لطيف مع ماصة 10 مل. تحديد أعداد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
- لreprograتجارب mming، MEFs البذور على الجيلاتين المغلفة قوارير T75 بكثافة من 6.7 × 10 3 خلية / سم 2 (~ 0.5 ميو خلايا في قارورة) في وسائل الإعلام IPSC تحتوي على 2 ميكروغرام / مل الدوكسيسيكلين. الرجوع إلى الجدول رقم 1 بشأن التوصيات البذر الحصول على حوالي 2 ميو سيطة لإعادة برمجة كل نقطة زمنية. ملاحظة: إعادة برمجة تبدأ مع إضافة الدوكسيسيكلين (2 ميكروغرام / مل) تستكمل وسائل الإعلام
- ل6 أيام الأولى تحل محل وسائل الإعلام كل يوم مع الدوكسيسيكلين جديدة تستكمل IPSC وسائل الإعلام (12 مل من وسائل الإعلام في قارورة T75). بعد هذه النقطة تجديد وسائل الإعلام على أساس يومي إذا كان هناك أعداد الخلايا عالية. مضاعفة حجم الثقافة إذا كانت التغييرات وسائل الإعلام لا يمكن إلا أن يؤديها كل يوم بديل.
- سيطة الحصاد إعادة برمجة عند نقاط الوقت المطلوب (اقتراح: أيام 3 و 6 و 9 و 12) عن طريق إزالة وسائل الإعلام، الشطف مع حجم مناسب من برنامج تلفزيوني (10 مل للقارورة T75) وتتراكب مع الحل التربسين-EDTA (3 مل ل T75 القارورة). احتضانلمدة 3-5 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وإرواء عن طريق إضافة 5 مل من وسائل الإعلام تليها IPSC من قبل pipetting لطيف.
- عد تعليق خلية مع عدادة الكريات (انظر أعلاه)، بيليه بواسطة الطرد المركزي، ونضح خلايا وطاف resuspend في 10 مل من برنامج تلفزيوني لإزالة أي آثار للالتربسين. بيليه الخلايا مرة أخرى، نضح طاف والمضي قدما في الخطوة 4.1 لعزل سيطة إعادة برمجة. ملاحظة: إعادة برمجة الخلايا التي تمر يمكن أن يكون cryopreserved وإذابة لنظام مراقبة الأصول الميدانية العزلة في مرحلة لاحقة.
- لإنشاء الجذع الثقافات برمجتها بالكامل، وتنمو الخلايا في خالية من دوكس IPSC سائل الإعلام لمزيد من 4-7 أيام. ملاحظة: سوف تحتوي الثقافات بنجاح إعادة برمجة عدد كبير من المستعمرات بعد يوم 12 (انظر الشكل 4). خلال هذا الوقت، سوف خلايا الجذع الشاذة التي لا تزال تتطلب التعبير OKSM تختفي.
- بدلا من ذلك، لنشر ما تبقى من الجذع الثقافات برمجتها بشكل كامل: في البداية، البذور MEFs المشع في مناطق ذات كثافة من 15 × 10 3 خلية / سم 2
- المقبل، مزارع الخلايا cellularize الجذع عن طريق إزالة وسائل الإعلام، الشطف القارورة T75 مع 10 مل من برنامج تلفزيوني، تتراكب مع 3 مل من محلول التربسين-EDTA واحتضان لمدة 3-5 دقائق عند 37 درجة مئوية. إخماد التربسين عن طريق إضافة 5 مل من وسائل الإعلام IPSC تليها خلط لطيف، ونقل إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، وتدور أسفل ثم معلق في 10 مل سائل الإعلام الجذع.
- نقل 500 ميكرولتر من هذا التعليق الخلية على MEFs المشع (T75 قارورة) والسماح للثقافات لتنمو لمدة 4-5 أيام. ملاحظة: يمكن أن يكون الجذع تأسست الثقافات cryopreserved أو استخدامها لإجراء التجارب. خطوط الخلايا نسيلي يمكن استخلاصها عن طريق التقاط المستعمرات الفردية IPSC تحت المجهر تشريح 22.
- البرد الحفاظ على الثقافات IPSC متموجة كما هو موضح في 2.8 لMEFs.
4. الأجسام المضادة وصفها
- الكريات الخلايا في resuspend الثقافات إعادة برمجة، كما أعدت في القسم 3، فيFACS سائل الإعلام وضع العلامات تستكمل مع الأجسام المضادة (مكافحة خاصتك 1.2 باسيفيك بلو 1: 400، ومكافحة SSEA-1 البيوتين 1: 400 ومعاداة Epcam FITC 1: 400). استخدام 200 ميكرولتر من مزيج تستكمل وضع العلامات لكل 5 مليون خلية واحتضان على الجليد.
- بعد 10 دقيقة استفادة بلطف أنبوب لresuspend الخلايا واحتضان لمدة 10 دقيقة إضافية على الجليد. إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني الباردة في أنبوب وتدور باستمرار.
- لكل أنبوب لتكون ملطخة إعداد 200 ميكرولتر من وسائل الاعلام وضع العلامات تستكمل مع 1 ميكرولتر Streptavidin-PeCy7 (1: 200) في 5 ملايين الخلايا. عندما مكعبات الخلايا، ونضح بعناية وطاف resuspend في حجم مناسب من وسائل الإعلام تستكمل مع وضع العلامات Streptavidin-PeCy7.
- تبقي الخلايا على الجليد لمدة 10 دقيقة، انقر ل resuspend، واحتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد، إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني الباردة في أنبوب، وتدور إلى أسفل ونضح طاف.
- الكريات الخلايا resuspend في وسائل الاعلام وضع العلامات تستكمل مع يوديد propidium (PI) (2 ميكروغرام / مل) في حوالي 1 × 10 7 خلية / مل. إزالة كتل الخلايا عن طريق تمرير تعليق من خلال مصفاة 70 ميكرومتر. نقل الخلايا إلى أنبوب FACS المناسب والاحتفاظ بها على الجليد.
- إعداد عينات منفصلة مع الأجسام المضادة الفردية (معاداة خاصتك-1.2، ومكافحة SSEA-1 و مكافحة Epcam). ملاحظة: هذه مطلوبة لأداء تعويض اللون في القنوات الثلاث المستخدمة في التحليل. بالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة لوضع خلايا غير المسماة الفولتية وبوابات للفرز. من الناحية المثالية تستخدم خلايا الجذع التعويض: يتم تخزين مخزونات 0.5-1 × 10 6 خلايا الجذع الحفاظ على MEFs المشع في cryovials في النيتروجين السائل. وجود MEFs ضروري للحصول على إشارة في القناة خاصتك-1.2.
- ذوبان الجليد في cryovial من خلايا الجذع كما هو موضح لMEFs (القسم 3). بعد الطرد المركزي، يتم تعيين خلايا resuspend في 800 ميكرولتر من العازلة وضع العلامات و 200 ميكرولتر من هذه العينة جانبا وسيطرة غير المسماة.
- استخدام الخلايا المتبقية وضوابط التعويض. خلايا الفجوة بين ثلاثة أنابيب 15 مل وإضافة الأجسام المضادةعلى النحو التالي: المحيط الهادئ تحكم تعويض الزرقاء: إضافة 0.5 ميكرولتر من مكافحة خاصتك 1.2 باسيفيك بلو الأجسام المضادة. FITC أنبوب التعويض: إضافة 0.5 ميكرولتر من الأجسام المضادة المناهضة للEpcam-FITC. PE-Cy7 تحكم التعويض: 0.5 ميكرولتر من مكافحة SSEA-1-البيوتين الأجسام المضادة.
- الاحتفاظ بعينات خلايا الجسم المضاد على الجليد لمدة 10 دقيقة، ومزيج من خلال استغلال واحتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد.
- غسل العينات مع 10 مل PBS البارد لإزالة الأجسام المضادة غير منضم، تدور خلايا أسفل ونضح طاف. الكريات الخلايا resuspend في 200 ميكرولتر من FACS سائل الإعلام وضع العلامات.
- لSSEA-1-البيوتين المضادة للعينات المسمى، إضافة المكورات Streptavidin-PeCy7 (1 ميكرولتر لكل 200 خلية ميكرولتر). خلايا التسمية كما هو موضح الأجسام المضادة الأولية (SSEA-1-البيوتين).
- تمرير جميع العينات بما في ذلك مراقبة غير المسماة من خلال مصفاة 70 ميكرومتر وإضافة PI (2 ميكروغرام / مل). نقل الخلايا إلى أنابيب FACS والحفاظ على الجليد حتى المطلوبة.
5. FACS عزل الوسطيات
ملاحظة:يتم فرز الخلايا باستخدام الإسفار المنشط فارز الخليوي مع 405 نانومتر، 488 نانومتر و 560 نانومتر ليزر الإثارة وفوهة 100 ميكرومتر.
- انشاء الفولتية إلى الأمام لوالجانب مبعثر بحيث يتم تصور سكان الخلية بشكل صحيح. رسم بوابة حول الخلايا كما هو مبين في الشكل 5A لاستبعاد الحطام. ملاحظة: الإعداد الصحيح من الفولتية على فارز خلية يمكن أن تكون معقدة وتتطلب مشغل FACS ذوي الخبرة.
- استخدام مبعثر إلى الأمام (FSC) ارتفاع مقابل منطقة FSC لاستبعاد المجاميع (الشكل 5B).
- تصور قناة PI مقابل FSC إلى البوابة في PI على الخلايا الحية السلبية (الشكل 5C).
- استخدام الخلايا غير المسماة لضبط الفولتية للقنوات الفلورسنت من PB، FITC / GFP، بي، Cy7. وضع مثالي السكان الخلية في الطرف الأدنى من القناة المعنية.
- وضع بوابات مع الخلايا السيطرة غير المسماة كما هو مبين في الشكل 6A، B إلى جزء فرعي عبادة إعادة برمجةتدابري في اليوم 3 و 6 و 9 السكان: SSEA-1- / خاصتك 1.2 + الخلايا. SSEA-1- / خاصتك-1.2- خلايا. وإعادة برمجة سيطة SSEA-1 + /-خاصتك 1.2- الخلايا.
- وعلاوة على ذلك تقسيم يوم 9 SSEA-1 + /-خاصتك 1.2- جزء باستخدام بي-Cy7 مقابل FITC صمة عار. رسم بوابات حول SSE-A1 + / + Epcam خلايا وSSEA-1 + / خلايا Epcam-. وضع بوابات مع الخلايا السيطرة غير المسماة كما هو مبين في الشكل 6C، D.
- ملء مسبق أنابيب جمع المناسبة مع وسائل الإعلام خلية الجذع (1-2 مل) قبل فرز المجموعات السكانية الفرعية المطلوبة (انظر الشكل 7 لمحات FACS تمثيلية للMEFs، يوم 3 / يوم 6/9 يوم / 12 يوم الثقافات وخلايا الجذع).
- أداء نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز وفقا لبروتوكول المصنوعات.
- بعد FACS عزل الخلايا لتقديم التنميط الجزيئي (RNA / استخراج البروتين، مناعي لونين، تحليل DNA methylome الخ). بدلا من ذلك، قد تكون مختلفة الكسور خلية مثقف.
Representative Results
بعد التشريح، تفصيل والطلاء للجنين E13.5 الماوس، ومن المتوقع أن يصل confluency في حوالي 1-2 أيام في صحن 10 سم. في هذه المرحلة، فمن الطبيعي للثقافة لاحتواء بعض القطع الملتصقة من الأنسجة التي لم يتم cellularized صحيح. هذه سوف تختفي بعد الركض.
الدوكسيسيكلين على الاستقراء، MEFs إعادة برمجة تغيرات شكلية متميزة. حول يوم 6، يجب بقع تشبه مستعمرة المبكرة تبدأ في الظهور (الشكل 4C). وهذه تستمر في النمو من حيث الحجم على المزيد من ثقافة (انظر الشكل 4D، E). تجربة إعادة برمجة جيدة ينبغي أن يؤدي إلى> 500 المستعمرات في T75 التي كانت المصنفة في البداية مع 5 × 10 5 الخلايا (الشكل 4E). الثقافات الجذع أنشئت تمتلك المميزة قبة على شكل مستعمرات ويجب أن تكون في معظمها خالية من الخلايا المتمايزة (4F الشكل). في بعض الأحيان، الركض إضافية من الجذع cultuقد تكون هناك حاجة الدقة لإزالة خلايا غير متمايزة / برمجتها جزئيا. يمكن تقسيم قارورة متموجة من الخلايا في نسبة 1:10 على طبقة المغذية من MEFs المشع.
كما ذكر أعلاه، تنعكس التغييرات المورفولوجية والجزيئية خلال إعادة برمجة بالتغيرات التي تطرأ على ملامح نظام مراقبة الأصول الميدانية لدنك-1.2، SSEA-1، وفي نهاية المطاف Epcam (انظر الشكل 7A-F). كما ذكرت سابقا 12،15، في حين MEFs هم في الغالب إيجابي لدنك 1.2 والسلبية للعلامات أخرى، يوم 3 الثقافات بالفعل تبدو مختلفة بشكل ملحوظ. وقد بدأت نسبة كبيرة من الخلايا لأسفل تنظيم التعبير عن خاصتك 1.2 ومجموعة فرعية صغيرة جدا من هذه الخلايا السلبية خاصتك 1.2 أصبحت إيجابية لSSEA-1، وإعادة برمجة الفعلية المتوسطة لهذه النقطة مرة. عدد سيطة إعادة برمجة التي يمكن استخلاصها من يوم 3 ثقافات لا يمكن التنبؤ بها جدا ونسبة SSEA-1 + /-خاصتك 1.2- عادة ما تقع في نطاق بين 1-10٪ من viablخلايا البريد. في يوم 6 و 9 نسبة مئوية زيادة الخلايا SSEA-1 +، عادة أعلى بكثير من 10٪، ويمكن الكشف عنها. حول يوم 12 مجموعة فرعية من SSEA-1 خلايا إيجابية يمكن أن يتم الكشف عن تسمية أيضا إيجابية لEpcam. يوم 12 الثقافات، مثل يوم 3 الثقافات، يمثل عنق الزجاجة في تنقية وسيطة، كما أن نسبة SSEA 1.2 + / + Epcam خلايا غير متغير ويقع في حدود 2-4٪ فقط من جميع الخلايا الحية عادة. العدد المتوقع وسيطة إعادة برمجة الواردة في الجدول 1 يخدم فقط كما تقريبي. سوف الحسنة مزارع الخلايا المحفزة النية أنشئت تكون إيجابية بقوة لSSEA-1 وEpcam.
ويتبع أسفل التنظيم الهوية الليفية علامة خاصتك 1.2 بنسبة تصل التنظيم من: الرقم 1. التغييرات السطحية علامة خلال مسار إعادة برمجةيشار SSEA-1. إن الانتقال من مجموعة فرعية من SSEA-1 خلايا إيجابية نحو دولة المحفزة بواسطة اكتساب Epcam حوالي 12 يوم. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تمثيل تخطيطي للنموذج الفأر قابل للبرمجة: m2rtTA التعبير تحت السيطرة من موضع Rosa26 نشط بتواجد مطلق في وجود الدوكسيسيكلين (دوكس) البروتين m2rtTA يربط إلى التتراسيكلين المروج التابع (tetOP) في الكولاجين 1A1 (Col1a1) موضع مما أدى إلى التعبير عن أربعة عامل الكاسيت. ترتبط اثنين من أشرطة bicistronic بواسطة موقع الريبوسوم دخول الداخلي (IRES). إطارات القراءة المفتوحة لل4 أكتوبر / KLF-4 و سوكس 2 / ج MYC هي فو الحوار الاقتصادي الاستراتيجي من قبل F2A وE2A تسلسل الشق الذاتي، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. الأجنة تشريح: (A) نقل الرحم قرن في صحن 10 سم مليئة 10 مل PBS و (B) مقطعة إلى قطع تحتوي على جنين واحد. (C) باستخدام الملقط الحرة الأجنة من الأنسجة الجنينية إضافية وإزالة الرأس والأطراف، وذيل والأعضاء الداخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
ليه / ftp_upload / 51728 / 51728fig4highres.jpg "العرض =" 500 "/>
تصبح بقع الشكل 4. التغيرات المورفولوجية خلال إعادة برمجة. تشبه مستعمرة اضحة في الثقافات من يوم 6 فصاعدا. وتتميز iPSCs حسن النية من قبل التشكل على شكل القبة. (A) يوم 0 / MEFs، (B) يوم 3، (C) يوم 6، (D) يوم 9، (E) يوم 12، (F) IPS ثقافة الخلية. شريط مقياس: 200 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. FACS الإعداد الأساسي. (A) مع استبعاد الحطام الجانبية مبعثر الأمام مقابل مبعثر منطقة صمة عار. (B)استبعاد المجاميع من غير الحطام التي تبوب على السكان خلية واحدة إلى الأمام مع منطقة مبعثر الأمام مقابل مبعثر عالية وصمة عار. (C) استبعاد الخلايا الميتة من السكان خلية واحدة بواسطة النابضة PI على الأحداث منخفضة مع قناة PI مقابل الأمام مبعثر منطقة صمة عار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6. المحاصرة. (A، B) عن طريق الخلايا السيطرة غير المسماة إنشاء بوابات لدنك 1.2 + /-SSEA 1- الخلايا، وخاصتك-1.2- / SSEA-1- الخلايا وخاصتك-1.2- / SSEA-1 + الخلايا. (C) استخدام الخلايا السيطرة غير المسماة وضع بوابات للEpcam خلايا الإيجابية والسلبية Epcam. (D) SSEA-1 + /-خاصتك 1.2- خلايا يمكن فصلهاإلى Epcam إيجابي وسلبي إلى السكان Epcam. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7. خاصتك 1.2 مقابل SSEA-1 FACS البقع في مراحل مختلفة من عملية إعادة البرمجة. (A) يوم 0 / MEFs، (B) يوم 3، (C) يوم 6، (D) يوم 9، (E) اليوم 12، زراعة الخلايا (F) الجذع.
الجدول المقترح 1. كثافة البذر، وعدد قارورة والنتائج المتوقعة للP1 MEFs من متخالف الجنين لOKSM وm2rtTA. يرجى النقر ساعةيحرث لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اليوم | عدد من قوارير T75 المصنف في اليوم 0 | إجمالي عدد الخلايا Ssea1 + بعد FACS | إجمالي عدد Ssea1 + / + Epcam الخلايا بعد FACS |
| 3 | 8 | 2000000 | |
| 6 | 4 | 2000000 | |
| 9 | 4 | 2000000 | |
| 12 | 10 | 10 ملايين | 2000000 |
Discussion
من أجل إعادة برمجة بنجاح MEFs إلى خلايا الجذع لتنقية وسيطة في إعادة برمجة كمية عالية من الضروري أن يكون على بينة من العوامل التي لها تأثير على الكفاءة بوجه عام. ولا سيما دفعة من FBS تستخدم لتكملة الإعلام الجذع يمكن أن يكون لها تأثير ضار. في التجارب الإيجابية العامة قدمت مع الجذعية الجنينية FBS المؤهلة (ES) الخلية ولكن الاختبار دفعة من الأمصال من مجموعة متنوعة من البائعين قد تحدد بديلا أرخص.
وثمة عامل آخر يؤثر على كفاءة إعادة برمجة هي من النمط الجيني MEFs 15،20. على الرغم من MEFs المستمدة من الفئران متخالف (هيت) لكل من OKSM وموضع m2rtTA لا إعادة برمجة، homozygousity في واحد أو كلا مواضع النتائج في إعادة برمجة الكفاءة العالية. في الواقع، MEFs المشتقة من نسل OKSM وm2rtTA الصلبان تظهر زيادة في كفاءة إعادة برمجة بالترتيب التالي (OKSM / m2rtTA): هيت / هيت <وطي / هيت <هيت / وطي <وطي /وطي (يرجى ملاحظة أن الأرقام الواردة في الجدول 1 هي للحيوانات هيت / هيت). بمناسبة نادرة يتم التعرف على الذكور وطي / وطي الحيوان، يمكن تعيين الحريم التزاوج مع الإناث متعددة m2rtTA المباراة. سيتم هيت جميع النسل من هذه الصلبان / وطي لOKSM / m2rtTA مواضع، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، أوصى التنميط الجيني السريع من الفضلات ويتم الحصول على الفضلات أكبر عند استخدام الفئران الأصغر سنا للتربية (6-15 أسابيع من العمر).
علاوة على ذلك، أكد استخدام MEFs مرور منخفضة لإعادة برمجة 23. إذا تم اشتقاق MEFs وتوسعت في normoxic حاضنة زراعة الأنسجة نحن نوصي بشدة لاستخدام هذه الخلايا فقط حتى مرور 2. ومع ذلك، إذا المجرب ديه حق الوصول إلى حاضنة انخفاض الأكسجين (5٪ أكسجين) لاشتقاق وتوسيع MEFs، أرقام مرور تصل إلى 3 لا تزال تسفر عن نتائج جيدة 23.
في حالة المجرب اجه المشاكل المرتبطة برمجة، كما هو مبين، والتفسيرات الأكثر احتمالا أرقام مرور عالية في وقت بالإضافة دوكس، راثى غير صحيح من الفئران أو استخدام FBS التي لا تساعد في توليد خلايا الجذع. ومع ذلك، في بعض الحالات النادرة لاحظنا أن MEFs لم تكن قادرة على إعادة برمجة حتى في ظل ظروف مثالية. في هذه الحالات تم تحديد عفوية دي نوفو حذف ضمن إطار القراءة المفتوح في m2rtTA باعتبارها السبب الكامن.
وقد تم تكييف هذه المنهجية بنجاح لاستخراج SSEA-1 + سيطة عبر عزل الخلايا المغناطيسية (MACS). هناك ميزة زمنية واضحة في استخدام أجهزة ماكينتوش، ومع ذلك، يتم تقليل نقاء SSEA-1 + السكان الخلية إلى 80-90٪، وليس أكثر من 95٪، والتي تبعا لنوع التجربة تتجه الخلايا لمدة قد تشكل مشكلة. وهكذا، وهو خيار هو استخدام MACS لإثراء لSSEA-1 + خلايا تليها FACS لزيادة نقاء و / أو جزء منها الى SSEA-1 + / + Epcam وSSEA-1 + / خلايا Epcam-.
"> في حين أن خلايا الجذع التي تنتجها بروتوكول المبين ونموذج الفأر وقد ثبت أن تكون المحفزة والمساهمة بشكل فعال إلى جميع أنسجة حيوانات خيالية 15،20، كان خفض القدرة على إنتاج أجنة مؤلفة بكاملها من هذه الخلايا المحفزة عبر تكامل رباعي الصيغة الصبغية تظاهر 24. وقد تم تحديد أنماط مثيلة الشاذة في الكتلة الجين دلك-Dio3 والسبب الكامن وراء 24. ومع ذلك، فإن إضافة حمض الاسكوربيك في تركيز 50 ميكروغرام / مل إلى وسائل الإعلام خلال إعادة برمجة تكامل رباعي الصيغة الصبغية تنتج خلايا الجذع المختصة 24. يرجى العلم أن الفأر نموذج قابل للبرمجة بديل هندسيا للتعبير عن عوامل إعادة البرمجة في رياضيات الكيمياء مختلفة يمكن أن تنتج خلايا الجذع المختصة رباعي الصيغة الصبغية حتى في غياب العلاج حمض الاسكوربيك 25، ولكن في خلايا أيدينا من هذه السلالة في إعادة برمجة حد كبير انخفاض وتيرة مقارنة إلى هنا استخدام وضع الماوسلتر.المنهجية الموضحة في هذه المخطوطة تسمح للفصل سيطة الجزء الأكبر من إعادة برمجة الحرارية من السكان، وينبغي أن ينظر إليها على أنها أداة قيمة لتشريح وفهم عملية إعادة البرمجة، وإزالة القيود السابقة من الحاجة إلى استخدام السكان unfractioned عن التنميط (على سبيل المثال، الضوضاء إشارة عالية من الخلايا الحرارية). مزيج الأجسام المضادة الموصوفة هنا يسمح العزلة وسيطة من خلايا فأر في نقاء عالية، ومع ذلك فمن الممكن أن علامات إضافية سطح الخلية سيتم كشف في المستقبل من شأنها أن تسمح للحصول سيطة في أعلى نقاء. يرجى ملاحظة أن SSEA-1 التعبير ليس السمة المميزة للخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان وعلى هذا النحو هذا البروتوكول لا يمكن أن تستخدم في إعادة برمجة خلايا المنشأ البشرية. في الختام، وسيطة إعادة برمجة معزولة مرة واحدة مع الطريقة الموصوفة يمكن استخدامها لالتحليلات الجزيئية بما في ذلك التعبير profilinز، لونين مناعي، methylome التحليل، والبروتين المقايسات.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
ونود أن نشيد بالدعم المالي من برنامج فإصابة موناش وكذلك من NHMRC CDF ومنحة مشروع NHMRC. وعلاوة على ذلك، نود أن نشكر سو مي ليم لها اقتراحات بناءة، إدوينا McGlinn لدعمها وفريق موناش Flowcore (ولا سيما آدم Dinsdale) لمساعدتهم في إنتاج الفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse CD90.2 (Thy1.2) Pacific Blue | eBioscience | 48-0902-82 | |
| Anti-Human/Mouse SSEA-1 Biotin | eBioscience | 13-8813 | |
| Streptavidin PE-Cy 7 | eBioscience | 25-4317-82 | |
| Anti-Mouse CD326(Epcam) Fitc | eBioscience | 48-5791-82 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Embryonic Stem Cell qualified Foetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10439024 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-070 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| Propidium Iodide solution (PI) | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Gelatine from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Doxycyclin hyclate | Sigma-Aldrich | 33429-100MG-R | |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | Millipore | ESG1107 | |
| DMEM High Glucose | Life Technologies | 11960-044 | |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffer saline) | Life Technologies | 14190-144 | |
| KnockOut DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
| Irradiated MEFs | Life Technologies | S1520-100 | |
| 75-cm2 Tissue culture flasks | Corning/BD Bioscience | 430641 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Corning/BD Bioscience | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Corning/BD Bioscience | 430829 | |
| Disposable surgical blades | Clifford Hallam | SM0501 | |
| Cryogenic vials | Corning/BD Bioscience | 430487 | |
| 70 µm Cell strainer | BD Bioscience | 352340 | |
| Taq DNA Polymerase | Life Technologies | 10342-020 |
References
- Matsui, Y., Zsebo, K., Hogan, B. L. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. Cell. 70, 841-847 (1992).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Stadtfeld, M., Maherali, N., Borkent, M., Hochedlinger, K. A reprogrammable mouse strain from gene-targeted embryonic stem cells. Nature Methods. 7, 53-55 (2010).
- Ebert, A. D., Svendsen, C. N. Human stem cells and drug screening: opportunities and challenges. Nature Reviews. Drug Discovery. 9, 367-372 (2010).
- Zhang, J., et al. A human iPSC model of Hutchinson Gilford Progeria reveals vascular smooth muscle and mesenchymal stem cell defects. Cell Stem Cell. 8, 31-45 (2011).
- Samavarchi-Tehrani, P., et al. Functional genomics reveals a BMP-driven mesenchymal-to-epithelial transition in the initiation of somatic cell reprogramming. Cell Stem Cell. 7, 64-77 (2010).
- Celià-Terrassa, T., et al. Epithelial-mesenchymal transition can suppress major attributes of human epithelial tumor-initiating cells. The Journal of Clinical Investigation. 122, 1849 (2012).
- Liao, B., et al. MicroRNA cluster 302–367 enhances somatic cell reprogramming by accelerating a mesenchymal-to-epithelial transition. Journal of Biological Chemistry. 286, 17359-17364 (2011).
- Cieślik, M., et al. Epigenetic coordination of signaling pathways during the epithelial-mesenchymal transition. Epigenetic., & Chromatin. 6, 1-22 (2013).
- Golipour, A., et al. A late transition in somatic cell reprogramming requires regulators distinct from the pluripotency network. Cell Stem Cell. 11, 769-782 (2012).
- Maherali, N., et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Stadtfeld, M., Maherali, N., Breault, D. T., Hochedlinger, K. Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse. Cell Stem Cell. 2, 230-240 (2008).
- Brambrink, T., et al. Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of mouse somatic cells. Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).
- Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Polo, J. M., et al. A molecular roadmap of reprogramming somatic cells into iPS cells. Cell. 151, 1617-1632 (2012).
- Wright, A. J., Andrews, P. W. Surface marker antigens in the characterization of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 3, 3-11 (2009).
- O'Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. , (2013).
- Hansson, J., et al. Highly coordinated proteome dynamics during reprogramming of somatic cells to pluripotency. Cell Reports. 2, 1579-1592 (2012).
- Stadtfeld, M., Maherali, N., Breault, D. T., Hochedlinger, K. Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse. Cell Stem Cell. 2, 230-240 (2008).
- Stadtfeld, M., Maherali, N., Borkent, M., Hochedlinger, K. A reprogrammable mouse strain from gene-targeted embryonic stem cells. Nature Methods. 7, 53-55 (2009).
- Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27, 543-549 (2009).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).
- Utikal, J., et al. Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells. Nature. 460, 1145-1148 (2009).
- Stadtfeld, M., et al. Ascorbic acid prevents loss of Dlk1-Dio3 imprinting and facilitates generation of all-iPS cell mice from terminally differentiated B cells. Nature Genetics. 44, 398-405 (2012).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).
