Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Et lille volumen Procedure for Viral Koncentration fra Water

Published: February 3, 2015 doi: 10.3791/51744
Automatic Translation
1, 1
1U.S. EPA

Introduction

Menneskelige enteriske virus er vigtige agenser vandbårne sygdomme 1-3, men er generelt til stede i lavt antal i forurenet vandmiljøet, hvilket gør deres opdagelse vanskeligt uden koncentration. Procedurer, der anvendes til at koncentrere vira omfatter typisk et filtreringstrin, efterfulgt af filter eluering og sekundær koncentration af filteret eluatet. En almindelig filtrering procedure beror på anvendelse af ladede membraner såsom elektropositive filtre (for nylig revideret i 4,5). Disse filtre er afhængige af at fange virus suspenderet i vand ved hjælp af elektrostatiske interaktioner mellem filteroverfladen (positivt ladet) og målrettede viruspartikler (negativt ladet). To elektropositive filtre, der er kommercielt tilgængelige stole på denne teknologi, glas / cellulose og nano-alumina / glasfiberfiltre. Glas / cellulose filter omkostninger er op til 10 gange af nano-alumina / glasfiber, som begrænser anvendelsen af ​​glas / CEllulose filtre til rutinemæssig virus overvågning. Nylige undersøgelser har konkluderet forskelle er nominelle mellem disse to filtre i inddrivelse af enterovirus fra omgivende vand 6,7, begrunder brugen af et billigere filter alternativ. Andre filter muligheder såsom elektronegative og glas-uld filtre er blevet undersøgt, men de enten kræver forbehandling af kilden vand (elektronegative filtre) eller ikke er kommercielt tilgængelige (glas-uld filtre). Udviklingen af ​​viruskoncentration procedurer har mest fokuseret på at optimere primære koncentration teknikker (filtre) for at forbedre virus inddrivelser fra vand. Men sekundære koncentration procedurer, som reducerer mængden af eluent typisk fra 1 L til milliliter mængder, kan også have en betydelig indvirkning på virus inddrivelser 8.

Sekundær koncentration af enteriske virus typisk er afhængig af en flokkuleringsmiddel såsom visse typer oksekød ekstrakt (økologisk floccuning) eller skummetmælk flokkulering 9-12 for at fjerne viruspartikler fra filteroverflader. For nylig er en anden sekundær koncentration under anvendelse af kødekstrakt kombineret med tilsætning af celite (fine partikler) vist lovende til udvinding adenovirus, enterovirus, og norovirus 8,13,14. Celite koncentrations- arbejder under lignende principper, til den organiske flokkulering metode at viruspartikler vedhæfte til og frigøres fra partikler (fnug eller celite) ved ændring af pH af suspensionen opløsning. Sammenligninger mellem disse to sekundære koncentration teknikker er blevet evalueret i inddrivelse af spiked adenovirus (ADV) type 40 og 41 8. Denne undersøgelse konkluderede, at de to sekundære koncentrationsteknikker var statistisk ens i inddrivelse af adenovirus. Men det organiske flokkulering metode kræver en 30 min. inkubation ved pH 3,5, mens celite teknikken kræver en kortere inkubation (10 min) ved pH 4,0. Den organiske flocculation kræver også anvendelse af dyrt laboratorieudstyr (centrifuger) at indsamle fnug partikler under tertiær koncentration, celit teknik i modsætning anvender kun grundlæggende laboratorieudstyr (vakuumfiltrering) for at adskille Celite partikler fra suspension.

Visse kombinationer af filtre og sekundære elueringsbetingelser teknikker kan også påvirke virus inddrivelser. En undersøgelse konkluderede, at visse kombinationer af primære (elektropositive filtre) og sekundære koncentrationsteknikker (Celite eller organisk flokkulering) haft stor betydning for inddrivelse af adenovirus 13. Disse resultater tyder på, at optimering er nødvendig for optimalt at genvinde target virus fra en given vand matrix ved anvendelse af disse teknikker. Optimering er en tidskrævende, besværlig proces mange forskere undgå aktivt da mange variabler vil blive evalueret (filter type / mærke pH elueringsopløsning, celite / organisk flokkulering).

Til dette sTudy en procedure blev udviklet for at identificere optimale betingelser for viruskoncentration fra vand ved hjælp af spidse human adenovirusstammer 40 og 41. Formentlig da hver virustype viser en unik capsid morfologi og specifik capsid ladning, muligvis optimeres for hver viruskoncentration protokoller målrette for at opnå optimal viral opsving. Denne undersøgelse giver en tilgang for ADV 40 og 41 koncentration af: 1) evaluering virus inddrivelser i postevand ved hjælp elektropositive filterskiver efterfulgt af 2) evaluering af en etableret organisk flokkulering metode versus celiten teknik som en sekundær koncentration, og 3) evaluering af elueringsbuffere for tertiær koncentration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af glas og filterhuse

  1. Medmindre andet er angivet, sterilisere alle glas, filterhuse og løsninger ved 121 ° C i 15 min. For at sikre sterilitet, dækker alle åbninger eller udsatte overflader med enten aluminiumsfolie eller tape-sikrede papir før sterilisering.
  2. Saml apparatet filtrering ved at fastgøre filterhuset (47 mm diameter) til 1 L sidearm Erlenmeyer-kolbe. Saml filtre kræves: diameter 47 mm elektropositive / elektronegative disc filtre.
  3. Forbered 1 L på 1,5% kødekstrakt (flokkulering; producerer fnug partikler når opløsningens pH sænkes til 3,5, eller ikke-flokkulerende; som ikke aggregat ved pH 3,5) med 0,05 M glycin ved at opløse 15 g kødekstrakt i 1 l deioniseret vand og tilsætte 3,75 g glycin.
    BEMÆRK: Ikke-flokkulerende oksekød ekstrakter vil kræve tilsætning af celit før tertiær koncentration.
  4. Tilføj eluering tilsætningsstof natrium Polyphosphate til oksekød ekstrakt i en koncentration 0,1%.
  5. Tilsæt 1 M saltsyreopløsning, dråbevis, blanding kødekstrakt, pH opløsning til den ønskede pH. Autoklave kødekstrakt i 15-30 minutter ved 121 ° C.
  6. Mål 0,1 g fine, medium eller stor partikel celite (til brug med ikke-flokkulerende kødekstrakt kun).
  7. Forbered vakuum / sugning ved fastgørelse kompatibel slange til Erlenmeyer sidearm kolbe og vakuum stikkontakt.

2. Udarbejdelse af løsninger og Virus Stock

  1. Forbered 1 L 1 M HCI.
  2. Forbered 1 L 1 M NaOH.
  3. Forbered 1x PBS-opløsning (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 1,47 mM K 2 PO 4, og 4,3 mM NaH 2 PO 4).
    1. Juster pH 1x PBS til 9,0 under anvendelse af 1 M NaOH.
  4. Forbered og fortyndes lager virus til 10 4 -10 5 mest sandsynlige nummer (MPN) ml -1 ved at blande 1 ml lager virus med 9 ml PBS (pH7), som tidligere beskrevet 8,13. Opbevares ved -80 ° C i 1 ml alikvoter.
    1. Steriliser virus lager ved filtrering sprøjte (0,22 um porestørrelse) til fjernelse af potentielle kontaminanter.
  5. Dechlorerede Tap Water
    1. Mål 1 L af sterilt postevand ved anvendelse af en steril måleglas og hældes i en 2 L bægerglas indeholdende magnetisk omrørerstav.
    2. Tilføj 0,7 g natriumthiosulfat og bland indtil granulat opløses. Juster pH ledningsvand til 7-7,5 om nødvendigt ved anvendelse af 1 M HCI eller 1 M NaOH-opløsning.
    3. Thaw virus spike (1 ml) og tilsæt hele mængden af ​​spike til 1 L af dechlorinated sterilt postevand. Bland i 10 min.
    4. Forbered en metode blank (dechlorerede postevand uden adenovirus) med hvert forsøg og proces på samme måde som den spikede prøve.

3. Fremstilling af Millipore filterapparat

  1. Fjern sterilt dækker over filterhuset. Sikrekorrekt pasform mellem filterhuset øvre skål og nedre filter skærmen for at undgå prøve lækage under filtrering.
  2. Fjern steril afdækning fra 1 L Erlenmeyer-kolbe. Kontroller, at proppen af ​​filterenheden passer stramt i topåbning Erlenmeyerkolbe, at skabe en god tætning.
  3. Fjern top skål med filteranlæg fra lavere filter skærmen, og læg 47 mm elektropositive filter disk holdent på skærmen med en steril tang. Vedhæft filterhus skål til bund skærm og låses på plads ved at dreje mod uret.

4. Tap Water Filtration (Primary Concentration)

  1. Mål 100 ml virus spiked postevand hjælp sterilt måleglas.
  2. Hæld 100 ml virus tilsat postevand i filterhus indeholder enten et 47 mm plisseret glas / cellulose-filter eller en nano-alumina / glasfiber disk filter.
  3. Tillad vand langsomt passere gennem filteret. Påfør blid vakuum for at fjerne de resterende rester of ledningsvand fra filteroverfladen.
  4. Hvis du bruger trypsinbehandling, tilsættes 5 ml 0,25% trypsin at filtrere overflade og inkuberes i 5 min.
  5. Vask trypsin fra filteroverfladen med 50 ml sterilt deioniseret vand.

5. Virus eluering fra Filter

  1. Fjern filterhus fra 2 L Erlenmeyerkolbe, og placere på 250 ml side-arm kolbe.
  2. Mål 100 ml oksekød ekstrakt ved hjælp måleglas. Hæld langsomt 100 ml oksekød ekstrakt i filterhuset.
  3. Tillad oksekød ekstrakt at hælde gennem filter, opfange oksekød ekstrakt i en lille (250 ml) Erlenmeyerkolbe. Påfør vakuum til at trække gennem resterende oksekød uddrag filter.

6. Celite Sekundær Koncentration

  1. Overfør kolber indeholdende de eluerede virus til en røre plade. Tilføj sterilt magnetisk omrørerstav og sted på omrøringsplade, blanding for at skabe mindre vortex.
  2. Tilføj 0,1 g celitepulver til 100 ml oksekød ekstrakt og tillade celite at sprede. Anbring steril pH-sonde i kødekstrakt.
  3. Tilføj dråbevis 1 M HCI til kødekstrakt at opnå pH 4,0. Lad langsomt blandes i 10 min.
  4. Placer 47 mm forfilter på filterhuset (som tidligere beskrevet) med en 2 L Erlenmeyer-kolbe.
  5. Hæld 100 ml kødekstrakt / celit blandingen over forfilter. Tillad oksekød ekstrakt at hælde igennem. Anvend svagt vakuum til at trække igennem resterende kødekstrakt fra filteret.
  6. Placer metalrør klip på enden af ​​filterhuset tud. Fastgør steril 15 ml samling polypropylen rør til metalrøret klip. Placer filterhus tilbage i Erlenmeyer-kolbe.
  7. Der tilsættes 5 ml 1x PBS-buffer, pH 9,0 over celit indsamlet på forfilter.
  8. Tillad PBS at dryppe gennem forfilter. Påfør svagt vakuum til at trække gennem resterende PBS i 15 ml opsamlingsrør.

7. Økologisk Flokkulering Sekundær Koncentration

  1. Overfør bægerglas indeholdende det eluerede virus til en omrøringsplade. Tilføj steril magnetisk omrører til 100 ml oksekød ekstrakt og bland til at skabe mindre vortex.
  2. Anbring steril pH-sonde i kødekstrakt.
  3. Tilsæt 1 M HCI dråbevis til kødekstrakt og justere pH til 3,5. Bland i 30 minutter.
  4. Hæld eluatet i 250 ml centrifuge koniske rør og centrifugeres ved 2500 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
  5. Hæld supernatanten pas på ikke at ikke at forstyrre bundfaldet. Resuspender pellet i 5 ml 1X PBS, pH 9.
  6. Centrifugeres suspensionen ved 4.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Hæld supernatanten og kassere bundfaldet.
  7. PH justeres til 7-7,5, Filtersteriliser gennem 0,22 um sprøjtefilter og fryses ved -80 ° C.

8. Viral Nucleic Acid Extraction

  1. Uddrag virale nukleinsyrer med et egnet kommercielt kit i henhold til producentens anvisninger.
<p class = "jove_title"> 9. AdV 40/41 qPCR

  1. Brug primere og prober samt reaktion mix og termisk cykling profiler som offentliggjort 8,13.
    BEMÆRK: Anslået detektionsgrænse for analysen er ca. 5 qPCR enheder pr reaktion.
  2. Tilføj komponenter af PCR-amplifikation blandinger i koncentrationer som følger: 10 mM Tris (pH 8,3), 50 mM KCI, 4,5 mM MgCl2, 10 mM dNTP'er, 10 pM primere og 1 uM probe og 0,5 pi polymerase, således at de endelige mængder af 45 pi kan tilsættes til passende antal brønde i en 96-brønds PCR-reaktion plade.
  3. Load 45 pi af PCR-amplifikation blanding til hver passende brønd i en 96-brønds, hurtig reaktion PCR-plade.
  4. Tilsæt 5 pi DNA ekstraheret prøve til passende brønde i PCR-plade.
  5. Dæk pladen med varmebestandig dækning sæl, dreje pladen til at flytte eventuelle dråber til bunden af ​​PCR-plade brønde.
  6. Set PCR amplifikationscycli som follOWS: 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cyklusser af 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 min.

10. Oplysninger Analyser

  1. Analyser tredobbelte målinger af serielle 5-folds fortyndinger af prøverne spænder 1: 5 til 1: 625 fortynding række for at bestemme den mest sandsynlige antal (MPN) af de virale partikler, som tidligere beskrevet 8,13.
  2. Analyser serielle 5-folds fortyndinger af adenovirus eksperimentelle pigge spænder 1: 5 til 1: 15.625 fortynding række for at bestemme den mest sandsynlige antal (MPN) af de virale partikler.
  3. Brug af EPA MPN lommeregneren (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html), justere regnemaskinen at redegøre for type af fortynding (1: 5 eller 1:10), antal fortyndinger udføres, samt antallet af udtages i fortyndingsrække.
  4. Udfør log 10 transformation af dataene, efterfulgt ved at normalisere til en enhed af volumen (f.eks, 1 ml, 100 ml, etc.
  5. Evaluere virkningen af de forskellige eksperimentelle variabler (f.eks forskellige Celite typer, pH-intervaller, forskellige filtertyper og forskellige sekundære koncentrations- teknikker) på AdV tilbagebetalinger ved at udføre parametriske eller ikke-parametriske statistiske test (f.eks parret t-test, en eller to way ANOVA) afhængig af fordelingen af ​​dataene og den eksperimentelle design.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Celite udvælgelse

Tre forskellige typer af celite blev testet forud for udvælgelsen af ​​de bedste præstationer variant. Celites med fint at mellemstore partikler produceret den højeste adenovirus inddrivelser. Anvendelse af større celites resulterede i lavere genfindelse for både AdV40 og 41 (mellem 32% -100%) (figur 1). Gennemsnitlige inddrivelser af adenovirus 40 var 144% ± 52% (fin), 115% ± 28% (medium) og 82% ± 53% (stor) partikel celites og AdV41, 132% ± 39% (fin), 83% ± 25% (medium) og 50% ± 11% (stor). One-way ANOVA indikerede optimeret celit teknik genvindes statistisk tilsvarende niveauer af AdV40 (P = 0,7920) og 41 (P = 0,1439) med den organiske flokkulering metode, som udvindes 75% ± 19% og 109% ± 16% . Figur 1 illustrerer forskellene mellem sekundære koncentrations- teknikker og mellem AdV typer.

_content "> Filter type evaluering

Et hundrede milliliter mængder virus-spidse, postevand blev koncentreret ved hjælp af enten en plisseret glas / cellulose eller nano-alumina / glasfiber disc filter og blev behandlet ved hjælp af enten celiten eller organisk flokkulering metode. Filtre blev elueret med oksekød ekstrakter ved pH 7,5, 9,0, 9,5, 10, 11 og 12 for at bestemme, hvilket ville være mest effektive i eluering AdV partikler filtre. Glas / cellulose filter kombineret med kødekstrakt ved pH 10 og celit, produceret de højeste tilbagebetalinger (ved qPCR / MPN) for AdV40 (52% ± 22%) og AdV41 (64% ± 4%), hvilket er vist i figur 2 og 3. Oksekød ekstrakt pH 10 genvundet betydeligt højere AdV41 end alle andre pH-værdier (P-værdi range: ,0045-0,041), mens AdV40 fulgte en lignende, om end noget svagere tendens (P-værdi interval: 0,025-0,042). Et glas / cellulose filter blev også evalueret sammen med den organiske flocculation metode. For AdV40, var signifikant højere inddrivelser fået hjælp oksekød ekstrakt pH 10 (40% ± 10%) (P-værdi interval: 0,010-0,027), og for AdV41, både pH 9,5 og 10 udkonkurrerede alle andre oksekød ekstrakt testet pH (P værdiområde : 0,023-0,027) (figur 2 og 3). Samlet set blev celiten teknik med oksekød ekstrakt pH 10 sig at være overlegen i forhold til den økologiske flokkulering metoden i direkte sammenligninger til nyttiggørelse af begge AdV stammer.

Optimeringer af oksekød ekstrakt tilsætningsstoffer

Den optimerede metode (glas / cellulose filter ved hjælp kødekstrakt pH 10 kombineret med celite sekundær koncentration) blev sammenlignet med to andre behandlinger: 1) tilsætning af 0,25% trypsin og 2) supplering af kødekstrakt med 0,1% natriumpolyphosphat. Tilsætningen af ​​trypsin syntes ikke at forbedre inddrivelsen af ​​AdV som kun 16% ± 6% og 24% ± 14% af AdV40 og 41 indgange, henholdsvis blev udvundet (< strong> figur 4). Beef ekstrakt suppleret med 0,1% natriumpolyphosphat gav det højeste genfindelse af AdV40 og 41 sammenlignet med den tidligere optimerede metode. AdV40 opsving syntes at stige med 13%, og AdV41 opsving steg 7% i forhold til metode, men hverken var statistisk signifikant (P-værdi: 0,146). Anvendelse af højere procentdele af natriumpolyphosphat 1%, 3% og 5% (data ikke vist) viste sig at være ineffektiv, hvilket kræver store mængder af syre til at justere pH af disse opløsninger til 4,0 under sekundær koncentration.

Figur 1
Figur 1: Percent recovery ADV-40 og ADV-41 baseret på sekundære koncentration teknik (Celite versus Organic fnug) og typen af Celite anvendes. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelse (n = 3) 8.

"FO: keep-together.within-side =" altid "> Figur 2
Figur 2: Procentvis inddrivelse af ADV-40 ved hjælp af to typer af sekundære koncentrationsteknikker (Celite og økologisk fnug) og to typer af filtre (glas / cellulose og Nano-alumina / Glas) med forskellige pH-niveauer af oksekød ekstrakt. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelse (n = 3) 13.

Figur 3
Figur 3: Procentvis inddrivelse af ADV-41 ved hjælp af to typer af sekundære koncentrationsteknikker (Celite og økologisk fnug) og to typer af filtre (glas / cellulose og Nano-alumina / Glas) med forskellige pH-niveauer af oksekød ekstrakt. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelse (n = 3) 13.

"> Figur 4
Figur 4: Effekten af elueringsbetingelserne tilsætningsstoffer om inddrivelse af AdV 40 og AdV 41 koncentreret anvendelse af Celite som en sekundær koncentration teknik og glas / Cellulose. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelse (n = 3) 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Elektropositiv filtre er anvendelige koncentrere vira fra vand; men disse filtre kan afvige i deres struktur og sammensætning, som kan igen ændre deres effektivitet. Sammenblandingen problemet capsid strukturer og afgifter varierer mellem virusstammer kræver koncentration teknikker skræddersys for at sikre optimal nyttiggørelse 15. Gennem simple ændringer af de eksisterende koncentration teknikker (f.eks elektropositive filtre, oksekød ekstrakt eluering), mere effektiv koncentration af mål-virus kan opnås 16,17.

Hidtidige forskning har typisk fokuseret på inddrivelse af virus ved at ændre primær koncentration (filtre) skridt, men lidt opmærksomhed er blevet givet til efterfølgende koncentration procedurer, som også kan påvirke virus opsving 18. Det er blevet påvist, at forskellige sekundære koncentration teknikker kan påvirke virus inddrivelser 6,13,19,20. CeliTe-koncentration har vist sig at genvinde tilsvarende niveauer af virus til andre sekundære koncentration metoder 8,14 fra en række matricer, mens du bruger hurtigere og enklere prøve behandlingsprocedurer.

På grund af varierende ydre capsid strukturer kan visse vira blive fysisk fanget i filteret matrix 21, hvilket nødvendiggør vurderingen af forskellige additiver til at filtrere elueringsbetingelser protokoller. For eksempel tilsætning af overfladeaktivt middel, natriumpolyphosphat forbedret både bakteriel og viral genvinding ved primær koncentration 6,13,22-24. På den anden side, lave genfindinger observeret efter tilsætning af trypsin indikerer, at proteaser ikke støtte i spaltning af proteinfibre på den ydre virale capsid. Desuden, mens ikke ualmindeligt 7,25,26, er det bemærkelsesværdigt, at nogle af vores tilbagebetalinger var på over 100%. Som tidligere vist 7,25,26, dette er sandsynligvis på grund af sammenklumpning af laboratoriefremstillede VIrus anvendes som spike.

Den lille volumen (100 ml virus spiked vand) koncentration tilgang præsenteres, kan være en praktisk måde at udvikle og optimere virus koncentration metoder, på grund af sin enkelhed og lavt forbrug af ressourcer sammen med hurtig prøve behandlingstid. Ved anvendelse af sådanne små mængder vand, er koncentrationen af ​​PCR-inhibitorer i prøven minimeres også, men det anbefales, at hver kilde vand undersøgt for tilstedeværelsen af ​​PCR-inhibitorer forud for eksperimenteren. Da mange valg af begge filtre og sekundære koncentrations- teknikker findes små volumen koncentration teknikker gør det muligt for hurtige evalueringer af talrige variabler. Det er håbet, at disse teknikker kunne udsendes forud for storstilet filtrering eksperimenter at hjælpe med at identificere hvilke forhold er optimale for target virus koncentration pr givne vand matricer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenovirus 40 stock ATCC VR-931
Adenovirus 41 stock ATCC VR-930
Sodium Thiosulfate Fluka Chemical Co. 72051
Celites #577 Fluka Chemical Co. 22142
NanoCeram 47 mm Argonide N/A
1MDS 47 mm 3M 6408502
AP-20 Prefilter 47 mm Millipore Corp. AP2004700
Glycine  Sigma 50046-1KG
Sodium Polyphosphate Acros Organics 390930010
Trypsin Gibco 25200
PBS Sigma P5368
Hydrochloric Acid Fisher A481-212
BBL Beef Extract BD Biosciences 212303
Difco Beef Extract BD Biosciences 211520
ABI 7900 Real-time PCR system ABI N/A
Stainless Steel Filter Housing Millipore Corp. XX2004720
Blood DNA Extraction Kit Qiagen  51104
EPA MPN Calculator http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sinclair, R. G., Jones, E. L., Gerba, C. P. Viruses in recreational water-borne disease outbreaks: a review. Journal of Applied Microbiology. 107, 1769-1780 (2009).
  2. WHO. Guidelines for Safe Recreational Water Environments. , World Health Organization. Geneva. (2003).
  3. Westrell, T., et al. Norovirus outbreaks linked to oyster consumption in the United Kingdom. Euro Surveillance : Bulletin Europeen Sur les Maladies Transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 15, Norway, France, Sweden and Denmark. (2010).
  4. Wong, K., Fong, T. T., Bibby, K., Molina, M. Application of enteric viruses for fecal pollution source tracking in environmental waters. Environment International. 45, 151-164 (2012).
  5. Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115, 1-11 (2013).
  6. Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water. Applied and Environmental Microbiology. 77, 3500-3506 (2011).
  7. Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2393-2399 (2009).
  8. McMinn, B. R., Cashdollar, J. L., Grimm, A. C., Fout, G. S. Evaluation of the celite secondary concentration procedure and an alternate elution buffer for the recovery of enteric adenoviruses 40 and 41. Journal of Virological Methods. 179, 423-428 (2012).
  9. Katzenelson, E., Fattal, B., Hostovesky, T. Organic flocculation: an efficient second-step concentration method for the detection of viruses in tap water. Applied and Environmental Microbiology. 32, 638-639 (1976).
  10. Fout, G. S., Schaefer, F. W. 3rd, Messer, J. W., Dahling, D. R. ICR microbial laboratory manual. 178, US Environmental Protection Agency. Washington, D.C. (1996).
  11. Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153, 79-83 (2008).
  12. Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47, 2797-2810 (2013).
  13. McMinn, B. R. Optimization of adenovirus 40 and 41 recovery from tap water using small disk filters. Journal of Virological Methods. 193 (2), 284-290 (2013).
  14. Brinkman, N. E., Haffler, T. D., Cashdollar, J. L., Rhodes, E. R. Evaluation of methods using celite to concentrate norovirus, adenovirus and enterovirus from wastewater. Journal of Virological Methods. 193, 140-146 (2013).
  15. Albinsson, B., Kidd, A. H. Adenovirus type 41 lacks an RGD alpha(v)-integrin binding motif on the penton base and undergoes delayed uptake in A549 cells. Virus Research. 64, 125-136 (1999).
  16. He, C., Lian, J. S., Jiang, Q. Electronic structures and hydrogen bond network of high-density and very high-density amorphous ices. The Journal of Physical Chemistry. B. 109, 19893-19896 (2005).
  17. Sedmak, G., Bina, D., Macdonald, J., Couillard, L. Nine-year study of the occurrence of culturable viruses in source water for two drinking water treatment plants and the influent and effluent of a Wastewater Treatment Plant in Milwaukee, Wisconsin. 71, 1042-1050 (2005).
  18. Soto-Beltran, M., Ikner, L. A., Bright, K. R. Effectiveness of poliovirus concentration and recovery from treated wastewater by two electropositive filter methods. Food and Environmental Virology. 5, 91-96 (2013).
  19. Haramoto, E., Katayama, H. Application of acidic elution to virus concentration using electropositive filters. Food and Environmental Virology. 5, 77-80 (2013).
  20. Lee, H., et al. Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water. Journal of Water and Health. 9, 27-36 (2011).
  21. Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater. Journal of Applied Microbiology. 109, 635-641 (2010).
  22. Hill, V. R., et al. Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants. Applied and Environmental Microbiology. 71, 6878-6884 (2005).
  23. Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water. Journal of Microbiological Methods. 68, 260-266 (2007).
  24. Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from water. Journal of Virological Methods. 176, 38-45 (2011).
  25. Melnick, J. L., et al. Round robin investigation of methods for the recovery of poliovirus from drinking water. Applied and Environmental Microbiology. 47, 144-150 (1984).
  26. Schwab, K. J., De Leon, R., Sobsey, M. D. Concentration and purification of beef extract mock eluates from water samples for the detection of enteroviruses, hepatitis A virus, and Norwalk virus by reverse transcription-PCR. Applied and Environmental Microbiology. 61, 531-537 (1995).

Tags

Virologi adenovirus Celite Koncentration Økologisk Flokkulering 1MDS filter NanoCeram filter qPCR
Et lille volumen Procedure for Viral Koncentration fra Water
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McMinn, B. R., Korajkic, A. A Small… More

McMinn, B. R., Korajkic, A. A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water. J. Vis. Exp. (96), e51744, doi:10.3791/51744 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter