Abstract
Muitas doenças relacionadas com o cérebro tem a morte celular neuronal envolvida na sua fisiopatologia. Melhoria em modelos in vitro para estudar os efeitos neuroprotetores ou neurotóxicos das drogas e vias a jusante envolvidos ajudaria a obter insights sobre os mecanismos moleculares de neuroproteção / neurotoxicidade e, potencialmente, poderia facilitar o desenvolvimento de drogas. No entanto, muitos ensaios in vitro de toxicidade existentes têm limitações importantes - mais avaliar a neurotoxicidade e neuroprotecção num único ponto de tempo, não permitindo observar o decurso do tempo e a cinética do efeito. Além disso, a oportunidade de coletar informações sobre as vias de sinalização a jusante envolvidos na neuroproteção em tempo real seria de grande importância. No protocolo corrente que descrevem a utilização de um analisador de células à base de impedância em tempo real para determinar os efeitos neuroprotectores da serotonina 2A (5-HT 2A) agonistas do receptor numa linha de células neuronais sob livre de marcador e em tempo real Conditíons, utilizando medidas de impedância. Além disso, demonstra-se que os inibidores das vias de segundo mensageiro podem ser utilizados para delinear as moléculas jusante envolvidos no efeito neuroprotector. Os requerentes também descrevem a utilidade desta técnica para determinar se um efeito sobre a proliferação celular, contribui para um efeito neuroprotector observada. O sistema utiliza placas de microeletrônica especiais referidas como E-placas que contêm alternando matrizes de microeletrodos de ouro na superfície inferior dos poços, que servem como sensores celulares. A leitura da impedância é modificada pelo número de células aderentes, a viabilidade celular, a morfologia e a adesão. Um parâmetro adimensional chamado Índice celular é derivada das medições de impedância eléctrica e é usado para representar o estado da célula. Em geral, o analisador de células à base de impedância em tempo real permite em tempo real, livre de marcador de avaliação de neuroprotecção e neurotoxicidade, e a avaliação do envolvimento das vias de segundo mensageiro, contribuindo para maisavaliação detalhada e de alto rendimento de potenciais compostos neuroprotetores em vitro, para a seleção de candidatos terapêuticos.
Introduction
Morte das células neuronais desempenha um papel fundamental na fisiopatologia de várias doenças relacionadas com o cérebro 1. A disponibilidade de dados fiáveis e de alto rendimento em ensaios de toxicidade in vitro é fundamental para obter uma melhor visão sobre os mecanismos de neurotoxicidade e ajudar a selecionar moléculas neuroprotetores como candidatos terapêuticas no desenvolvimento de medicamentos 2. No entanto, existem muitas limitações para mais amplamente utilizados em assays.They neurotoxicidade in vitro avaliar a neurotoxicidade / neuroprotecção a um único ponto de tempo, não permitindo resolução cinética; costumam usar etiqueta ou sonda que pode interferir com as vias de sinalização e limitar estudos adicionais na mesma população de células, e muitas vezes são de trabalho intensivo, e em muitos casos não fornecem uma visão mecanicista. No presente estudo demonstram a utilidade de um analisador de células à base de impedância em tempo real para determinar a neurotoxicidade e neuroprotecção em uma linha de células neuronais em tempo real e sob livre de marcadorcondições e fornecer informações sobre os mecanismos a jusante, através da análise das vias de segundos mensageiros envolvidos no efeito.
Estudos anteriores confirmaram a validade do analisador de células em tempo real para determinar a citotoxicidade, bem como os efeitos sobre a proliferação de células nas linhas de células em comparação com as técnicas convencionais 3,4,5,6. Por exemplo, observou-se uma boa correlação entre as leituras do ensaio padrão de viabilidade celular WST-1 e valores de índice de células em vários pontos de tempo, sob condições de proliferação basal e após dois paradigmas diferentes tóxicos em células HeLa 3. Em A549 e MDA-MB-231 células de proliferação e de citotoxicidade provocada com o paclitaxel microtúbulos estabilizador mostrou valores muito semelhantes, quando avaliada através de medições de índice celular e utilizado de forma padrão a sulforodamina B (SRB) 4. Na linha de célula neuronal de neurônios do hipocampo imortalizados HT-22 Celulares medições do Índice foram validados por sua capacidade to detectar a proliferação de células, a citotoxicidade do glutamato e citoprotecção contra a amplamente utilizado 3 (4,5-dimetiltiazol-2-il) 2,5-difenil-brometo (MTT) 5. No mesmo estudo os resultados do ensaio de MTT e medições de índice celular também se correlacionou bem na medição neuronal proliferação de células progenitoras, citotoxicidade após privação de fatores de crescimento e resgate de citotoxicidade pelo pan-caspase inibidor QVD 5. A citotoxicidade induzida em células NIH 3T3 por Vandetanib (crescimento endotelial vascular receptor do factor inibidor e do receptor do factor de crescimento epidérmico), mostrou resultados semelhantes medidos com os valores de índice celular ou ensaio de incorporação de vermelho neutro 6.
Usámos recentemente o sistema analisador de células em tempo real para avaliar os efeitos neuroprotectores da serotonina 2A (5-HT 2A) agonista do receptor de cloridrato de (±) -2,5-dimetoxi-4-iodoamphetamine (DOI), em uma linha de células neuronais ( células SK-N-SH) e selecionados para o envolvimento de secoª vias Messenger através monitorar o efeito da sua inibição química sobre a neuroproteção observada 7. Curiosamente, o receptor 5-HT 2A tem agonistas tanto alucinógenas e nonhallucinogenic (como o DOI e lisuride, respectivamente), o que pode ativar ambas as segundas vias comuns de mensagem e distintas 8.
As vantagens da técnica apresentada é que ela permite a coleta de informações em tempo real sobre a sobrevivência das células no decorrer do dia, para delinear as vias de segundo mensageiro envolvido, para avaliar a possível contribuição de efeitos de proliferação de neuroproteção, e para selecionar um tempo ideal para estudos adicionais de ponto final sobre a mesma população de células. Um diagrama esquemático do fluxo no protocolo actual é apresentado na Figura 1.
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Protocol
1 Preparação
- Coloque a estação do analisador de células em tempo real num incubador de cultura de tecido fixado a 37 ° C e com 5% de CO 2. Realizar toda a manipulação de cultura de células e tratamentos farmacológicos em um capuz de cultura de tecidos em condições de esterilidade.
- NOTA: Neuronal linhas celulares que requerem ajustes de temperatura diferentes em relação às condições normais de cultura, deve ser ajustada em conformidade. Para as linhas de células fracamente aderentes, utilizar agentes de revestimento para facilitar a interacção das células com os microeléctrodos de ouro no fundo dos poços da placa de E-96.
- Preparar soluções 1000X ações dos compostos farmacológicos para o tratamento de cultura de células (agentes neuroprotetores ou inibidores vias de segundo mensageiro no solvente apropriado - dimetilsulfóxido ou água estéril) e armazená-los a -20 ° C. Use o solvente como veículo nos seguintes tratamentos.
- Cultura de células de neuroblastoma humano SK-N-SH em DMEM / F12 suplementado com 10% soro fetal bovino (FBS) (meio de proliferação) em frascos de cultura de células com 175 cm 2, a densidade de superfície de cerca de 75%. Manter passagem número de células dentro de uma gama de (cerca de 10 passagens) para verificar a coerência entre as experiências em termos de taxa de proliferação celular e resposta a citotoxicidade. São preferidos os números de passagem inferior.
- Lava-se a camada de células SK-N-SH aderente com PBS, e trypsinize com solução de tripsina-EDTA a 0,05% durante 5 min a 37 ° C. Centrifugar as células a 170 x g durante 5 minutos para remover a tripsina. Ressuspender as células em 10 ml de meio de proliferação. Contar as células com o contador de células Scepter e ajustar o número de células de 300.000 células / ml, diluindo as células com meio de proliferação.
2. Galvanização e proliferação de SK-N-SH Células
- Adicionar meio de proliferação de 100 ul a cada poço da placa de E-96 e deixá-lo por 30 minutos na capa de cultura de tecidos à temperatura ambiente para equilibrar. Insira o E-Plate 96 em tempo real a estação analisador de células na incubadora de CO 2 a 37 ° C.
- Inicie o software em tempo real analisador de células. Na página de layout, selecione os poços incluídos no experimento e entrar nas caixas de edição a informação sobre o tipo de celular, número de células, nomes e concentrações de compostos químicos utilizados para o tratamento de células.
NOTA: Para efeitos do presente protocolo, pelo menos, 4 repetições são recomendados para cada tratamento. - Na página de software Programação determinar "Passos" incluídos no experimento, selecionando o número de varreduras de medição Índice de celular eo intervalo entre as varreduras para cada etapa. Desde Passo 1 é pré-determinado para a medida de fundo, selecione "Adicionar uma etapa" e defina o Passo 2 para medir o Índice de celular a cada 15 minutos durante 96 horas.
NOTA: Para os tratamentos, no qual são esperados efeitos com cinética rápida, definir varreduras em intervalos mais curtos. - Clique em Iniciar para iniciar a etapa pré-determinado automaticamente ume medir a impedância dos meios de fundo. Este valor é automaticamente subtraídos pelo programa em cada ponto de dados uma vez que as células são adicionadas aos poços.
- Utilizar a suspensão de células previamente preparada no passo 1.5) de 300.000 células / ml em meio de proliferação. 30.000 células / poço de toxicidade celular / estudos de neuroproteção e 15.000 células / poço para estudos de proliferação celular. Retire o E-Plate e adicionar 100 mL de suspensão de células por poço para os estudos de toxicidade celular / neuroproteção e adicionar suspensão de células de 50 mL e meio de proliferação 50 ul por poço para os estudos de proliferação celular. O número de células plaqueadas por cavidade tem de ser optimizada para cada linha celular empiricamente.
- Agite suavemente o E-Plate 96, mesmo para metalização das células. Deixar a placa de E-96 durante 30 minutos na capa de cultura de tecidos à temperatura ambiente para permitir que as células assentar uniformemente ao fundo dos poços.
- Insira o E-Plate 96 no tempo real da estação analisador de células e começar Passo 2 no Cronograma pidade. Monitorar valores do Índice de celular em todo o experimento, exibindo as curvas de celulares na página Plot e os dados do Índice de celular matérias sobre o celular Index página do software.
3. Serum Privação
- 24 h após o plaqueamento das células, uma pausa na experiência, e remover a placa de E-96 a partir da estação em tempo real analisador de células. Dilui-se inibidores de segundo mensageiro de estoques 1000X com meio livre de soro / DMEM F12 - 200 × a concentração final. Tratar as células com 1 ul inibidores das vias de segundo mensageiro a ser testado para o seu envolvimento na neurotoxicidade / neuroprotecção 30 min antes de se iniciar a citotoxicidade, para inibir as respectivas vias. Retorne o E-Plate 96 para a estação e retomar as medições do Índice célula experimental.
- Depois de uma pausa de 30 minutos novamente a experiência. Remova cuidadosamente meio de proliferação plenamente do E-placa de 96 poços com uma pipeta (ou multi-canal pipeta), tomando cuidado para não romper a camada de células aderentesdirigindo a extremidade da ponta da pipeta para o canto do poço. Adicione 200 ^ l / poço de DMEM isento de soro / meio F12 (meio privação de soro). Assegurar a troca rápida de meio de cultura de células, para minimizar a agitação mecânica das células.
- Dilui-se os compostos a ser testados quanto aos seus efeitos neuroprotectores de 1000X estoque com meio DMEM / F12 isento de soro de 200 × a concentração final. Adicionar 1 ul compostos a ser testados quanto aos seus efeitos neuroprotectores e 1 ul inibidores das vias de segundo mensageiro em poços individuais de acordo com o plano experimental.
- Em células para estudos de proliferação não mudam médio. Dilui-se os compostos a ensaiar a partir de estoque 1000X de 200 × a concentração final no meio de proliferação, trata-se com 1 ul por poço e continuar a cultura no meio de proliferação.
- Retomar a experiência para continuar com celulares medições índice a cada 15 minutos durante 96 horas como definido anteriormente.
4 Dados Análise
- Para neurotoxicidade / dados de neuroproteção normalizar Índice celular para o último ponto de tempo antes do tratamento farmacológico ou mudança de meio para reduzir a variação entre os experimentos, selecionando "Índice celular normalizado" e "normalizar Time" na página Plot.
- Destaque os poços na página Plot para as condições experimentais de interesse e clique em "Adicionar" para traçar as curvas de índice de celular normalizados. Observar a cinética do efeito neurotóxico / neuroprotectora, ou de inibição segundo mensageiros como curvas normalizadas Índice celular como uma função do tempo.
- Observar as curvas Índice celular para os tratamentos com fármacos testados em meio de proliferação, como uma função do tempo para avaliar se um efeito sobre a proliferação está envolvido no efeito neuroprotector / neurotóxico.
- Exportar a informação experimental para todos os pontos celular tempo Índice da página em software celular índice em um arquivo do Excel para iniciar a avaliação estatística dos resultados
- Para a análise estatística das diferenças de valores do Índice de celulares em diferentes condições de tratamento em momentos específicos, selecione valores do Índice de celular em respectivos tempos de arquivo exportado Excel. Analisar os valores do Índice de celular para os pontos de tempo seleccionados com unidirecional ou bidirecional análise de variância (ANOVA) seguida do teste post-hoc usando o software estatístico.
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Representative Results
Privação de soro leva à diminuição nos valores de índice de células, que podem ser monitorados continuamente com o analisador de células em tempo real
Neurotóxicos estímulos para as células de levar a uma redução nos valores do índice de células, o que pode ser monitorado em tempo real com a técnica apresentada e a dinâmica dos quais é dependente do estímulo neurotóxico específico e do tipo de célula estudada. Figura 2 mostra o aumento em Índice celular quando as células SK-N-SH foram cultivadas em meio de proliferação até atingir um patamar (linha verde) e a queda de Índice celular seguido de uma estabilização com os novos níveis inferiores após a ligação das células à privação de soro meio (linha a vermelho). Esta queda pode representar uma mudança na adesão celular, devido à retirada do soro.
Efeitos neuroprotetores do tratamento medicamentoso pode ser monitorado continuamente com o analisador de células em tempo real
"> O efeito neuroprotector dos compostos adicionados antes (pré-tratamento), e ao mesmo tempo (co-tratamento) ou após o estímulo neurotóxico (sugerindo a recuperação das células) também pode ser seguida de forma contínua com o analisador de células em tempo real, fornecendo assim informação sobre . da taxa e duração do efeito neuroprotector Figura 3 mostra resultados representativos da dinâmica de neuroprotecção de dois agonistas de 5-HT 2A - 5 uM de DOI (Figura 3A) e 20 uM lisurida (Figura 3B) adicionado no momento da comutação em células meio de privação de soro.O analisador de células em tempo real permite distinguir entre os efeitos sobre a sobrevivência de células e proliferação de células
Uma questão importante em estudos de neuroproteção em linhas de células neuronais é se um efeito sobre a proliferação celular, contribui para o efeito de compostos sobre a sobrevivência celular observada. Com o anal célula em tempo realYzer o efeito sobre a proliferação pode ser testado na mesma placa de 96 E-avaliar a neurotoxicidade. Figura 4 mostra a falta de efeito do tratamento DOI 5 fiM na proliferação de células SK-N-SH, que sugere um efeito sobre a proliferação, não contribui para a observada efeito neuroprotetor.
O analisador de células em tempo real permite determinar quais vias de segundos mensageiros estão envolvidos no efeito neuroprotetor / neurotóxico
A activação do receptor inicia uma cascata de segundos mensageiros efeitos. O protocolo atual permite que a tela para o envolvimento de um número de segundos mensageiros em um efeito neuroprotetor / neurotóxico em tempo real através de pré-tratamento com seus inibidores. Uma vez que o efeito de inibidores de segundos mensageiros na sobrevivência das células pode ser pronunciada, e em muitos casos é não linear com o tempo, após a sua cinética é muito informativa. Figura 5 apresenta o efeito de 10 mM fosfatophatidylinositol 3-quinase (PI3-K) inibidor LY294002 sobre a sobrevivência de células e DOI neuroprotecção em células SK-N-SH privadas de soro. No gráfico apresentado, LY294002 10 uM evitou o efeito neuroprotector de DOI em privação de soro, mas também tiveram algum efeito tóxico da sua própria.
E vias de segundo mensageiro inibidor concentrações relevantes para cada composto testado, pode ser determinada através de pesquisa de literatura. Concentrações adequação dos inibidores segundos mensageiros tem de ser verificada e, se necessário otimizado experimentalmente. O objectivo de optimização consiste em seleccionar uma concentração, o que tem um efeito mínimo sobre os valores do Índice celular por si só, enquanto continua a inibir eficazmente o respectivo segundo mensageiro. Como um exemplo, alguns inibidores da segunda vias de mensageiro, o que pode ser relevante para o receptor 5-HT 2A, são apresentados na Tabela 1 Estes inibidores têm sido anteriormente utilizados para avaliar alvos a jusante implicados no aumento serotoninérgica da extracellular regulada por sinal fosforilação da cinase 9. Temos demonstrado a sua utilidade para avaliação das vias a jusante envolvidos na neuroproteção por agonistas dos receptores 5-HT2A após a confirmação e, em alguns casos, otimizando suas concentrações para o nosso paradigma experimental 7.
Figura 1 Diagrama esquemático do fluxo de trabalho apresentado no protocolo atual. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 Efeito da privação de soro no Índice de celular. Privação de soro (linha vermelha) induz a uma rápida diminuição do Índice de celular, em comparação com o aumento gradual na célula valores do Índice em meio de proliferação (linha verde). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 Efeito de 5-HT 2A agonistas no Índice celular após a privação de soro. Tratamento com medicamentos citoprotectores (nesta experiência 5-HT 2A agonistas DOI (5 mM) (A) (linha magenta) e lisurida (20 pM) (B ) (linha magenta escuro) restaura parcialmente valores do Índice de celular diminuíram privação de soro (linha vermelha). Cliqueaqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 Celulares valores do índice no curso de proliferação celular. Tratamento com medicamentos em meio de proliferação (no atual experimento 5 mM DOI) (linha magenta) permite avaliar o efeito sobre a proliferação em comparação ao tratamento veículo (linha verde). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Segunda inibidores de mensagens pode afetar a sobrevivência das células por conta própria e pode ser usado para a tela para o efeito de vias de segundos mensageiros na OBSEneuroprotecção rved. Nesta experiência as células foram sujeitas a privação de soro a ser tratado com o veículo (linha vermelha), 1 uM de DOI (linha magenta), pré-tratadas com 10 pM de PI3-K inibidor LY294002 e tratadas com 1 uM de DOI (linha azul) ou pré-tratados com 10 mM LY294002 e tratados com veículo (linha preta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Exemplos de inibidores de segundo mensageiro, o que pode ser relevante para o receptor 5-HT 2A vias a jusante e as suas concentrações por nós utilizadas em experiências em tempo real do analisador de célula.
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Discussion
O protocolo atual apresenta a utilidade de um analisador de células em tempo real para avaliar de forma contínua e em condições livres de etiqueta os efeitos neuroprotetores / neurotóxicos de compostos em linhas de células neuronais e para obter insights sobre as segundas vias mensageiros envolvidos no efeito.
Embora a utilidade do analisador de células em tempo real para estudar a toxicidade e efeitos das drogas sobre a proliferação celular é geralmente reconhecido, poucos estudos têm usado em tipos de células neuronais relacionados. Mostrámos previamente a utilidade do analisador de células em tempo real para monitorizar a neuroprotecção de um agonista do receptor 5-HT2A em células de neuroblastoma humano SK-N-SH, enquanto Ga et al. Mostraram que pode ser utilizado para avaliar a neurotoxicidade do peptídeos beta-amilóide em células de neuroblastoma humano SH-SY5Y 7,10. Um estudo recente indicou que, embora o analisador de células em tempo real de forma fiável medido célula proliferação e morte celular em umA linha celular euronal e células precursoras neuronais, a sua precisão na avaliação morte celular em neurónios primários depende da gravidade da lesão 5. É importante notar que a corrente alternada utilizada para o sistema analisador de células em tempo real é de muito baixa magnitude, gerando correntes microampere. Essas correntes são bem abaixo do potencial limiar de células excitáveis como os neurónios. O sistema analisador de células em tempo real baseia-se em medições da impedância a partir da superfície inferior da placa de E-96 poços, por conseguinte, o grau de aderência celular é de importância crítica. É possível que uma maior optimização do revestimento dos poços E-placa com proteínas da matriz extracelular para melhor aderência pode melhorar os resultados obtidos com os neurônios primários.
O manuscrito actual demonstra uma nova abordagem de utilizar o sistema analisador de células em tempo real para delimitar vias de segundo mensageiro envolvidos na neuroprotecção. O protocolo baseia-se na inibição química da segunda messengers hipótese de ser envolvido na ação de um agente neuroprotetor. A Tabela 1 lista alguns inibidores segundo mensageiro vias normalmente utilizadas, o que pode ser relevante para o receptor 5-HT 2A, como um exemplo, e as suas concentrações apropriadas para o paradigma experimental apresentada. Este projeto experimental permite uma seleção rápida de vias potencialmente relevantes de segundo mensageiro, para selecionar alvos a jusante para estudos mais detalhados, através de abordagens complementares.
Uma vantagem importante do analisador de célula em tempo real, é também a capacidade de avaliar se um efeito sobre a proliferação é uma parte de um efeito neuroprotector observada. Usando linhas de células neuronais em vez de neurônios primários em ensaios de toxicidade oferece algumas vantagens, como menor custo, de fácil acesso e sem necessidade de experimentação animal. No entanto, devido ao facto de as linhas de células neuronais em contraste com os neurónios primários proliferam, o efeito potencial sobre a proliferação necessita de ser controlado noOs ensaios de neurotoxicidade. A oportunidade do analisador de células em tempo real oferece para realizar esse controle na mesma experimental E-placa de 96, facilita o projeto experimental.
Vários parâmetros técnicos devem ser considerados em experiências com o analisador de células em tempo real. O número de células a ser revestida por poço deverá ser determinado empiricamente através de experimentação de titulação para cada tipo de célula testada. A citotoxicidade e proliferação de tratamento são tudo começou depois de 24 h após o início da cultura de células, para permitir que a aderência completa das células. Os melhores resultados em experimentos de citotoxicidade a partir quando as células atingiram 65-70% de confluência foram obtidos no protocolo atual. Para as experiências de proliferação inferior confluência celular é preferido (20-30%) a seguir ao efeito de uma droga de uma curva de proliferação.
No soro protocolo atual paradigma privação neurotoxicidade é apresentada devido a sua robustez, facilidade de uso e utilidade para aproximarprivação trófico mediada morte neuronal, o que é importante durante o desenvolvimento, cerebral aguda ou trauma nos nervos, 11 e neurodegeneração. No entanto, uma grande variedade de paradigmas de neurotoxicidade pode ser utilizado com o sistema analisador de células em tempo real. Aqui, o co-tratamento com um agente citoprotector na altura da citotoxicidade é apresentado. No entanto, o pré-tratamento ou tratamento após a (recuperação celular avaliando) evento tóxico também podem ser empregues, dependendo dos compostos a ser testados.
Em geral, o protocolo actual sugere a utilidade de um sistema analisador de células em tempo real para avaliar a neurotoxicidade e neuroprotecção em linhas de células neuronais de forma contínua e livre de marcador e para obter informações sobre as vias a jusante envolvidos nestes efeitos.
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Disclosures
Os custos de publicação para o atual vídeo-artigo foram patrocinados pela "ACEA Biociências".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA SP system bundle | ACEA Biosciences | No: 00380601030 | Consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit |
| E-plate 96 | ACEA Biosciences | No: 05232368001 | For culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station |
| SK-N-SH cells | ATCC (in partnership with LGC Standards) | HTB-11 | Can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-063 | Supplements proliferation, but not serum deprivation medium |
| Tissue culture flask T175 | Sarstedt | 83.1812.302 | For culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96 |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | For trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks |
| Scepter 2.0 cell counter | Merck Millipore | PHCC20060 | Automated cell counter |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies | 10010-015 | For washing the cells |
| (±)-DOI hydrochloride | Sigma-Aldrich | D101 | 5-HT2A agonist for cell culture treatment |
| LY-294002 hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9908 | PI3-K inhibitor for cell culture treatment |
| Lisuride maleate | Tocris Bioscience | 4052 | Compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | For dissolving LY-294002 and lisuride maleate |
References
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