Abstract
Dopaminerge neuroner udgør mindre end 1% af det samlede antal af neuroner i hjernen. Denne lave beløb af neuroner regulerer vigtige hjernefunktioner såsom motorstyring, motivation og arbejdshukommelse. Nigrostriatale dopaminerge neuroner selektivt degenererer i Parkinsons sygdom (PD). Denne gradvise neurontab utvetydigt forbundet med motorerne symptomer på patologi (bradykinesi, hvilende tremor og muskulær stivhed). De vigtigste agent ansvarlig for dopaminerge neuron degeneration er stadig ukendt. Men disse neuroner synes at være ekstremt sårbare i forskellige forhold. Primære kulturer udgør en af de mest relevante modeller til at undersøge egenskaber og karakteristika for dopaminerge neuroner. Disse kulturer kan sendes til forskellige stress agenter, der efterligner PD patologi og til neurobeskyttende forbindelser med henblik på at stoppe eller bremse neurondegeneration. De mange transgene musemodeller for PD, der har været GenerATED løbet af det seneste årti steget yderligere interesse hos forskerne til dopaminerge neuron kulturer. Her video-protokollen fokuserer på sarte dissektion af embryonale mus hjerner. Præcis udskæring af ventrale mesencephalon er afgørende for at opnå neuronkulturer tilstrækkelig rig på dopaminerge celler til at tillade efterfølgende undersøgelser. Denne protokol kan realiseres med embryonale transgene mus og er egnet til immunfluorescensfarvning, kvantitativ PCR, second messenger kvantificering eller neuronal vurdering død / overlevelse.
Introduction
Dopamin er et af de væsentlige hjernens neurotransmittere 1,2, er primært frigives af midthjernen dopaminerge (DA) neuroner. Størstedelen af DA neuroner opholde sig i den ventrale del af mesencephalon 2-6. Skematisk kan midthjernen DA neuroner opdeles i tre anatomisk og funktionelt forskellige projektion systemer: mesostriatal, mesolimbiske og mesokortikale veje 2,5. Nigrostriatale nervebaner er involveret i motorisk adfærd, det mesolimbiske veje spiller en vigtig rolle i forstærkning, motivation og læring, mens de dopaminerge baner, der rager til det præfrontale cortex er impliceret i kognition 2.
DA neuroner er involveret i adskillige humane neurologiske lidelser, såsom skizofreni, opmærksomhed underskud hyperaktivitet lidelse og Parkinsons sygdom (PD) 2,4. PD er karakteriseret ved en progressiv og selektiv degeneration af DA neuroner forbinder substantia nigrapars compacta (SNC) til striatum. Tabet af nigro-striatale DA neuroner i alvorlig dopaminudtømning i striatum, der er ansvarlig for de motoriske symptomer af PD (bradykinesi, hvile rysten og stivhed) 7. Den oprindelige årsag til idiopatisk PD er ikke blevet fastslået, og de nuværende behandlinger er kun symptomatisk, der sigter på at genoprette dopamin-niveau i striatum. Den mest ordineret lægemiddel er L-dopa (levodopa), det naturlige forstadium af dopamin. Selvom administration af Levodopa kompenserer for tabet af dopamin i en vis tid, opstår motoriske komplikationer efter lang tids behandlinger (dyskinesi og tænd / sluk stater) 8,9.
Forskning i dopaminerge neuroner og PD er i konstant udvikling, og der gøres intense indsats for at udvikle behandlinger baseret på celle transplantation, genterapi, eller neurobeskyttende midler 10,11. Et stort problem er imidlertid endnu ikke belyst: Hvad er årsagen til den ekstreme vulnerability af DA neuroner? En del af svaret kan findes i aktiviteten af DA neuroner. En reduktion i den elektriske aktivitet og ophidselse af DA neuroner synes at forøge deres tilbøjelighed til at degenerere 12. , Kompleksiteten af PD patogenese kræver dog yderligere undersøgelser for at identificere de involverede mekanismer i DA neuroner Degeneration 13-15.
Primære kulturer er særligt relevant at undersøge DA neuron egenskaber 16-19 og udfordre disse neuroner til forskellige belastninger til evaluering af neurobeskyttende midler 20-24. Rotte kultur modeller anvendes oftest, som dissektion af rotte foster mesencephalon er nemmere, sammenlignet med musen, og kan fås højere mængder af neuroner i rotter. Imidlertid har generation af transgene musemodeller for sygdommen 25 væsentligt forøget interesse neurolog community for primære kulturer fra mus 26-29. Selv kulturer PRepared fra nyfødte dyr kan anvendes, er det bedre at forberede dem fra embryoner på post-mitotiske etape (E13.5 til mesencephale neuroner), når neuroner har bevaret deres evne til at differentiere. Følgende protokol præsenterer isolerede mesencephale neuroner i primær kultur fra museembryoer (E13,5), som er den mest vanskelige at fremstille. Især giver vi en protokol ved hjælp af serum-fri kultur medium for en bedre reproducerbarhed. De to mest kritiske trin i forberedelse kultur (dissektion og mekanisk dissociation), vil blive nøje beskrevet i den tilhørende video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Musene, der anvendes i dette arbejde blev plejet og behandlet i overensstemmelse med retningslinjerne fra Det Europæiske Union Rådets (86/609 / EU) for brugen af forsøgsdyr.
1. Fremstilling af efterspurgte løsninger
- Stamopløsninger
- 10x poly-L-ornithin (PLO) Løsning: afvejes 10 mg PLO hydrobromide (molekylvægt = 30,000-70,000) og opløses i 70 ml sterilt vand. Opløsningen filtreres ved hjælp af 0,2 um sprøjtefilter, portion, og opbevares ved -20 ° C.
- 30% glucoseopløsning: afvejes 30 g D (+) - Glucose og opløses i sterilt vand til et samlet volumen på 100 ml. Filter, portion, og opbevares ved 4 ° C.
- 5x Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) / Nutrient Mixture F-12 Ham: afvejes 6 g DMEM / F-12 Ham pulver og opløses i sterilt vand til et samlet volumen på 100 ml. Filter, portion, og opbevares ved 4 ° C.
- 7,5% natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) Solutipå: afvejes 7,5 g NaHCO3 og opløses i sterilt vand til et samlet volumen på 100 ml. Filter, portion, og opbevares ved 4 ° C.
- 1 M HEPES Løsning: Der afvejes 23,8 g HEPES og opløses i sterilt vand til et samlet volumen på 100 ml. Filter, portion, og opbevares ved 4 ° C.
- 70% (v / v) Ethanol: Fortynd 70 ml absolut ethanol med 30 ml sterilt vand.
- Fosfatbufferet saltvand med glucose og antibiotika (PBS-GAB): tilsættes 10 ml 30% glucoseopløsning og 5 ml penicillin-streptomycin løsning til 500 ml Dulbeccos phosphatbufret saltvand. Opbevares ved 4 ° C.
- Føtalt bovint serum (IFB): optøs bovint serum natten over ved 4 ° C og inaktivering ved 56 ° C i 30 minutter. Alikvot i 50 ml og opbevares ved -20 ° C.
- Dyrkningsmedium: I sterilt vand, blandes successivt 40 ml 5x DMEM / F12-skinke, 1 ml 1 M HEPES, 2 ml 200 mM L-glutamin, 2 ml penicillin-streptomycin, 4 ml 30% glucose ennd 3 ml 7,5% NaHCO3 til et slutvolumen på 180 ml. Der filtreres, og bruge den samme dag.
- Hormon Mix
- Forbered 180 ml dyrkningsmedium. Opløs 200 mg apo-transferrin i dette medium.
- Afvejes 50 mg insulin og opløses i 2 ml 0,1 M HCI. Tilføj langsomt 8 ml sterilt vand under blanding forsigtigt. Denne løsning i dyrkningsmediet fortyndes.
- Afvejes 19,3 mg Putrescin dihydrochlorid og opløses i 10 ml sterilt vand. Tilsæt 10 ml opløsning til hormon-mix.
- Forbered en 3 mm natriumselenit opløsning i sterilt vand og en 2 mm progesteron løsning i absolut ethanol. Tilsæt 20 pi af hver opløsning til hormon-mix.
- Filter hormonet mix, prøve i 10 ml og opbevares ved -20 ° C.
2. Fremstilling af kultur plader og instrumenter
- FBS Coating af dyrkningspladerne: Dagen før dissektion, forberede 180 ml dyrkningsmedium. Der tilsættes 10 mlIFB til 90 ml dyrkningsmedium. Tilsæt 300 gl / brønd dyrkningsmedium / 10% IFB til poly-D-lysin overtrukne plader med 24 brønde. Inkuber natten over ved 37 ° C. Opbevar de resterende medier (med og uden IFB) ved 4 ° C.
- Sterilisere instrumenter og Pasteur-pipetter. Saml det udstyr, der er anført i Materialer bord samt et klasse II laminar flow hætte og en CO2-inkubator.
3. Dissektion af mus mesencephalon
- Sacrifice en E13.5 gravid mus (efter fastlagte retningslinier). Rens maven af musen med 70% ethanol og åbne maven væg. Saml Uterushornene åbne dem ved hjælp af sarte saks, dissekere hvert foster fra Uterushornene og fjerne fosterhinde membraner. Placer embryoner i en 100 mm petriskål indeholdende sterilt PBS-GAB og vaske dem ved overførsel i 3 på hinanden følgende identiske bade med en pincet. For dissektion, placere embryoner med 3 i en 60 mm steril petriskål.
- Move den endelige petriskålen under stereomikroskop. Må ikke halshugge embryoner. Brug Vännäs saks, punktafgifter hjerner.
- Fjern forsigtigt og kassér markedsafskærmning og baghjernen regioner. Til den rostrale side, skæres tæt på thalamiske region til den caudale side skåret landtangen regionen, skal du fjerne den overlegne colliculus.
- Når den ventrale midthjernen er isoleret, forsigtigt fjerne meninges ved hjælp af ultrafine pincet. Saml dissekerede segmenter uden meninges, i et sterilt 13 ml rør fyldt med PBS-GAB.
- Rengør røret med mesencephala grundigt med 70% ethanol og bringe det under kølerhjelmen.
4. celledissociationsbuffer
- Vask mesencephala 3x med sterilt PBS-GAB. Tillad hjerne fragmenter at bosætte sig mellem hver vask og undgå forstyrrelser af vævet. Efter den sidste vask fjernes omhyggeligt så meget opløsning som muligt og inkuber hjernen segmenter i 3 ml trypsin / EDTA i 15 minutter ved 37 ° C i enCO 2-inkubator.
- Fire-polere de pasteurpipetter at maksimere overlevelse af neuroner som enden af en ikke-poleret glas pipette er skarpe og kan beskadige cellerne under dissociation trin. Lidt reducere ekstremitet diameter (op 0,5 mm) for Pasteur-pipette, mens brand-polering det.
- Fjern forsigtigt så meget trypsin / EDTA-opløsning som muligt, og der tilsættes 10 ml dyrkningsmedium / 10% IFB. Vask hjerne segmenter 3x med dyrkningsmedium / 10% IFB.
- Brug af flammepoleret Pasteur-pipette, begynder dissociation af mesencephala i 6 ml dyrkningsmedium / 10% IFB. Triturat 10x (undgå luftbobler), tillade klumper at bosætte sig, derefter indsamle mediet i en ny steril 13 ml rør.
- Tilføj 6 ml dyrkningsmedium gentage forrige trin en gang og indsamle mediet indeholdende dissocierede celler i det samme 13 ml rør.
- Centrifuger cellerne ved 160 g i 5 min. Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i dyrkningsmedium suppleret med10% hormon-mix.
5. Celleudpladning
- Tæl celler i suspension i en Malassez celle og justere lydstyrken på medium til en koncentration på 600.000 celler / ml. Omkring 1.700.000 celler kan opnås fra en mus mesencephalon.
- Fjern FBS-coating medium fra plader med 24 brønde, og der tilsættes i hver brønd 1 ml cellesuspension (600.000 celler / brønd, 2-4% af TH +-celler).
- Inkubér pladen ved 37 ° C og 5% CO2 / 95% luft. Ingen medium ændring er nødvendig. Dopaminerge neuroner er modne efter omkring 5-7 dage in vitro (konsekvent udtryk for den dopamin-transporteren). Hold celler i kultur op til 15 dage uden medium udskiftning.
6. Immunofluorescensanalyse Protokol
- Rensning af Dækglas
- Dagen før dissektion, tilsættes 10 ml af 1 M HCI i en petriskål. Lå på overfladen af de flydende 12-15 dækglas og vent 15 minutter.
- Sink dæksletglide ned i væsken og vente i 15 min.
- Fjern HCI og vaskes 3 gange med vand.
- Vask dækglas hurtigt med ren ethanol én gang, derefter tilføje ren ethanol til fadet og vente i 30 min.
- Under kølerhjelmen, fjerne rensede dækglas fra ethanol og tilsættes 1 dækglas per brønd af en 12-brønds cellekultur plade ved hjælp af steriliseret pincet.
- Vask dækglas to gange med sterilt vand (1 ml / brønd). Derefter vaske dem en gang med sterilt PBS.
- Belægning af Dækglas
- Fjern PBS og tilsættes 500 gl / brønd af 2x PLO (fortyndet i PBS). Der inkuberes i 4 timer ved 37 ° C i CO2-inkubator.
- Fjern PLO løsning og vaske 3x med sterilt PBS.
- Fjern PBS og tilsættes 500 ul / brønd af 20% IFB / 1 g / ml laminin. Inkuber natten over ved 37 ° C i CO2-inkubator.
- Plating cellerne i Immunofluorescens
- Fjern belægning medium fra 12-brønds plader.
- Tilføj 900,000 celler / brønd i 2 ml volumen og vokser cellerne ved 37 ° C i inkubatoren. Cellerne kan holdes i kultur i op til 15 dage uden medium udskiftning.
- Immunfarvning
- Fjern mediet fra 12-brønds pladerne og vaskes med 500 gl / brønd DMEM forvarmet ved 37 ° C.
- Tilsæt 500 gl / brønd DMEM forvarmet ved 37 ° C, hvorefter der tilsættes forsigtigt 160 ul / brønd af 8% paraformaldehyd (PFA 2% slutkoncentration) og inkuberes i 10 minutter ved 37 ° C.
- Fjern PFA og vaskes 3x med PBS / 0,1 M glycin i 10 min.
- Fjern PBS tilsættes 300 ul / brønd PBS / 0,05% Triton X-100/20% gede serum, og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern mediet tilsættes 300 gl / brønd af primært antistof fortyndet i PBS / 0,05% Triton X-100/1% gedeserum og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur. Primære antistoffer, der kan anvendes til påvisning af dopaminerge neuroner og karakterisering af kulturen er angivet i Materialer tabel. Hold1 godt uden primære antistof, for at vurdere baggrunden for de forskellige sekundære antistoffer.
- Fjern mediet og vaskes 3x med PBS / 0,2% gelatine i 10 min.
- Fjern mediet tilsættes 300 gl / brønd sekundært antistof fortyndet i PBS / 0,05% Triton X-100/1% gedeserum og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur i mørke. Sekundære antistoffer anvendes, er vist i et separat tabel.
- Fjern mediet og vaskes 3x med PBS / 0,2% gelatine i 10 min.
- Fjern medium og vask 3x med PBS.
- Monter dækglas på objektglas celle nedad i en dråbe Vectashield. Hold objektglassene ved stuetemperatur natten over for at lade montering halvtør, opbevare dem ved 4 ° C.
- Anskaf billeder ved hjælp af en konfokal mikroskop eller et fasekontrast-mikroskop udstyret til epifluorescens. Repræsentative billeder blev erhvervet med et Leica SP2 UV konfokal mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En illustreret rutediagram af mesencephale kultur trin er vist i figur 1. Kort efter indsamling E13,5 embryoner fra en gravid schweizisk mus er ventrale mesencephalon dissekeret fra hele embryoet. De isolerede hjerne fragmenter successivt forelægges enzymatisk nedbrydning og mekanisk dissociation. Dissocierede celler pelleteret ved centrifugering, resuspenderet i dyrkningsmedium og udplades i præcoatede 12 eller 24-brønds plader. Celler opretholdes op til 15 dage uden medium udskiftning.
En detaljeret rutediagram for den ventrale mesencephalon dissektion, svarende til trin 3.2 er vist i figur 2. Stiplede røde linjer angiver de 3 skærende linier på en skematisk repræsentation af E13.5 musehjerne (tilpasset fra Prestoz et al. 30) og opskæring trin er illustreret.
Fasekontrast billeder af kulturen efter 1, 4, og 7 dage i vitro (DIV) er vist i figur 3. Neuroner hurtigt udvikle udvidelser og spiring (figur 3A). Forgrening og forgreninger er mere udvidet på DIV4 og DIV7 (3B-3C).
Dopaminerge neuroner detekteres ved immuncytokemi ved anvendelse af et anti-TH antistof (figur 4A). Antallet af TH +-celler udtrykkes pr 2,5 cm 2 dækglas (figur 4B). Vi er ikke udtryk for antallet af TH + celler per brønd som tætheden af celler er meget højere på grænsen af det coatede plast godt end på den belagte dækglas, der er på center på godt. DA neuroner (TH + celler) udgør 2-4% af hele cellepopulationen på dækglasset. TH-positive (TH +) celler synes så tidligt som Div1 og deres antal stiger hurtigt at nå et maksimum på DIV6.
Den relative andel af celler vurderes ved immunfluorescens mærkning af DA celler witt et anti-DAT antistof (figur 5A) eller et anti-TH antistof (figur 5B) og samtidig farvning af neuronale celler med anti-MAP2 antistof. Repræsentant immunfarvning af adskillige neuronale populationer til stede i kulturen er også vist i figur 5. GABAerge neuroner er farvet ved hjælp af et anti-GAD67-antistof (figur 5C) og udgør omkring 50% af cellerne. Serotonerge neuroner detekteret med et anti-serotonin-antistof (figur 5D) og udgør mindre end 1% af cellerne i kulturen. Mesencephalon cellekultur indeholder også glutamaterge neuroner (40% af kulturen), cholinerge neuroner og sjældne gliaceller (ca. 2-3%). Andel af af gliaceller bestemmes ved hjælp af gliafibrillært surt protein (GFAP)-farvning (figur 5E). Entydig identifikation af mesencephalon dopaminerge neuroner kan også opnås ved anvendelse af specifikke markører, såsom Pitx3 eller Foxa2 31,32.
Højere forstørrelse immunfarvning af adskillige neuronale populationer til stede i kulturen, er vist i figur 6. Dopaminerge neuroner påvises ved hjælp af et anti-DAT antistof (figur 6A). DAT farvning afspejler DA neuron modning tilstand. DAT udtryk begynder ved DIV3-4. GABAerge neuroner og serotonerge neuroner farves anvendelse af et anti-GAD67-antistof (figur 6B), eller et anti-serotonin-antistof (figur 6C), hhv.
Figur 1. Illustreret flowdiagram over mesencephalon kultur. Er angivet Main kultur trin. (A) Sacrifice en gravid schweizisk mus, indsamle E13,5 embryoner i petriskåle og vaske dem ved successive PBS bade. (BC) Under dissektion mikroskop, dissect ventrale mesencephalon fra hele embryoner og placere dem i et rør. (D) Tilføj trypsin-EDTA til de dissekerede hjerne fragmenter og fordøje ved 37 ° C i 15 min. (E) Fjern trypsin tilsættes serum indeholdende-dyrkningsmedium og udføre mekanisk celledissociering (10 trituration bevægelser, der gentages to gange). (F) hagl cellen, resuspenderes dem i serum-frit medium suppleret med hormoner og plade dem i belagt 12 eller 24 brønde. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Detaljeret rutediagram af mesencephalon dissektion. Er angivet Main dissektion trin. (A) Mouse embryo på E13.5 efter rebortvisning fra Uterushornene. (B) Uden at halshugning embryonet, udskære hjernen. (C) Skematisk fremstilling af embryonale mus hjerne ved E13.5. Røde linjer angiver, hvor hjernen skal klippes at isolere ventrale mesencephalon (R, rostrale cut, C, caudale cut; D, bryst klip). Cephalica vesikler telencephalon, diencephalon, mesencephalon, og rhombencephalon er afgrænset i blå, lilla, pink og grå. Aq, akvædukt; Hypoth, hypothalamus; LGE, lateral ganglioniske eminence; LV, laterale ventrikel; MFB, mediale forhjernebundt; MGE, mediale ganglioniske eminence; SC, overlegen colliculus; Thal, thalamus; VM ventrale mesencephalon; 4V, fjerde ventrikel (tilpasset fra 30). (D) Cutting linier er angivet med røde linjer på en E13.5 mus hjernen. (E) mus hjernen efter fjernelse af markedsafskærmning og baghjernen regioner (dvs. efter cut R). (F) mus hjernen efter fjernelse af superior colliculus (dvs. efter nedskæringer R og D). (G) Ventral visning af en isoleret mesencephalon (dvs. efter nedskæringer R, C, D). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. fasekontrast billeder af kulturen i forskellige faser af udvikling. (A) Div1, (B) DIV4, og (C) DIV7 billeder af den samme kultur er vist. Billeder blev erhvervet på levende celler med et inverteret mikroskop. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. tyrosinhydroxylase farvning af dopaminerge neuroner. (A) Ved DIV8 blev DA neuroner detekteret under anvendelse af anti-TH antistof. Åbenbaring blev udført under anvendelse af en 3,3 '-diaminobenzidin (DAB) kit. Billedet blev købt med et inverteret mikroskop. (B) Antal TH + neuroner i mesencephale kulturer som en funktion af alder af kulturen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Repræsentative andel af neuroner og astrocytter i kultur. På DIV4, DA neuroner (i magenta) blev påvist under anvendelse af anti-DAT (A) eller anti-T-H antistof (B) og GABAerge neuroner, serotonerge neuroner og astrocytter (i magenta) blev påvist under anvendelse af anti-GAD67 (C), anti-serotonin (D) og anti-GFAP (E) antistoffer hhv. Neuronale celler (i cyan) blev farvet med et anti-MAP2-antistof (AE). Billeder blev erhvervet med et inverteret mikroskop. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Repræsentative farvning af adskillige cellepopulationer fra mesencephalon kultur. (A) dopaminerge neuron opdaget af DAT-farvning på DIV9 (i rødt). (B) GABAerge neuroner visualiseret ved GAD-67-farvning på DIV9 (i grønt).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol viser de procedurer og reagenser, der er nødvendige for at fremstille en primær kultur af mesencephale neuroner fra embryonale mus og immunofluorescens fremgangsmåde til påvisning dopaminerge neuroner. Kritiske trin i proceduren er dissektion af embryonerne og den mekaniske dissociation af de indsamlede hjerne fragmenter. Høj kvalitet dissektion instrumenter hjælper med at beherske dissektion teknik. DA neuroner udgør en lille del af mesencephalon. Følgelig indsamle den højre del af den ventrale mesencephalon er vigtigt at opnå en kultur, der indeholder 2-4% af DA neuroner. Mekanisk dissociation skal udføres omhyggeligt og forsigtigt. Hvis kulturen indeholder klynger af ikke-opdelte neuroner, tilføje et eller to flere trituration trin.
Denne protokol anvender serumfrit medium til neuron kultur. Men, belægning med serum er nødvendigt at gøre udlæg i cellerne. Hormon-mix, som erstatter den serum, er defineret til at tillade neuron vækst og for at minimere gliaceller overlevelse og proliferation. Følgelig repræsenterer ikke-neuronale celler omkring 2-3% af kulturen (kvantificering ved hjælp af GFAP-farvning). Alternativt kan kulturerne dyrket i nærvær af serum med tilsætningen to dage efter podning af cytosin-β-D-arabinofuranosid (ara-C, 5-8 uM) til at undertrykke proliferationen af gliaceller 26. Et andet alternativ til hormonet mix er brugen af definerede medier og kosttilskud 29.
Denne teknik er egnet til at udføre immunofluorescensfarvning, kvantitativ PCR, andet messenger-kvantificering og forskellige former for toksikologi / overlevelse skærme. Det bør også være muligt at gennemføre elektrofysiologiske undersøgelser af disse præparater 33,34. Disse kulturer kan identificere førkandidatlandenes neuroprotektive molekyler og bidrage til at karakterisere DA neuroner egenskaber, og samtidig minimere antallet af anvendte dyr. Imidlertid fianmodes nal bekræftelse ved hjælp af in vivo modeller, som dyrkede neuroner ikke modtager input fra andre områder af hjernen, som kan kraftigt påvirke deres modning.
Denne teknik er ikke særlig udbredt, sammenlignet med rotte kultur-modeller, på trods af dens første beskrivelser i begyndelsen af firserne 16,17. Manglen på billeder, der udgør den fine dissektion kan begrænse forskere til at udvikle denne mus kultur model. Men på grund af dannelsen af mange transgene musemodeller for neurodegenerative lidelser 25 med specifikke gen ugyldiggørelse eller mærkning af specifikke neuron typer DA neuron kulturer fra mus er nu af stor interesse.
Mastering denne teknik tillader studiet af DA neuroner isoleret fra enhver form for transgene mus og til at udforske den forstyrrelse induceret af genetiske modifikation. Desuden kan disse kulturer anvendes som referencemodeller skal sammenlignes med DA neuroner afledt fra muse stamcellerceller 35 eller fra inducerede pluripotente stamceller 36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| DMEM 4.5 g/L glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140122 | |
| L-Glutamine, 200 mM solution | Life Technologies | 25030123 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D0547 | Powder |
| Laminin - 1 mg/ml in Tris buffered NaCl | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-Ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Insulin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | I5523 | |
| apo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Stock solution 1 M in water |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Stock solution 2% (w/v) in water |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Paraformaldehyde 16% in water | Electron Microscopy Sciences | RT 15710-S | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck Millipore | 106329 | |
| D(+)-Glucose, Monohydrate | Merck Millipore | 4074-2 | |
| Hydrochloric acid - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) Titripur | Merck Millipore | 109057 | |
| Sterile water - Aqua B. Braun | Braun | ||
| Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent | VWR | 20821.321 | |
| Sterile Petri dishes | VWR | 82050-566 | |
| Pasteur pipettes plain glass - Wilhem Ulbrich GdbR. | VWR | 612-2297 | |
| Counting chamber Malassez | VWR | 631-0975 | |
| Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm | PALL Life science | 4525 | |
| Surgical Scissors - Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long | Fine Science Tools | 14002-14 | To open the abdominal wall |
| Scissors - Straight, pointed, delicate, 10 cm long | MORIA | 4877A | To open the uterine wall |
| Forceps - Curved, usual, serrated jaws 1 mm | MORIA | 2183 | To manipulate embryos |
| Vannas Scissors - Curved, pointed, 7 mm blades | MORIA | MC50 | To take out the mesencephalon |
| Ultra Fine Forceps - Curved, delicate, 13 cm long | MORIA | 9987 | To remove meninges |
| BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates | BD Bioscience | 356414 | |
| BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD Bioscience | 353043 | |
| SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º | MENZEL-GLÄSER | AG00008032E | |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø | MARIENFELD | 117580 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody | Chemicon Millipore | AB5622 | 1/200 |
| Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2 | Chemicon Millipore | MAB5406 | 1/400 |
| Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt | Chemicon Millipore | MAB369 | 1/500 |
| Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody | 1/8,000 - Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch) | ||
| Goat Serum, New Zealand Origin | Life Technologies | 16210-064 | |
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-31556 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | 1/1,000 |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11007 | 1/1,000 |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss microscopy | Stemi-2000C | |
| Bunsen Burner FIREBOY | VWR | 451-0136 |
References
- Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum. Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).
- Iversen, S. D., Iversen, L. L.
- Dahlstroem, A., Fuxe, K. Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons. Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).
- Chinta, S. J., Andersen, J. K.
- Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
- Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O'Keeffe, G. W. Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development. Dev Biol. 379, 123-138 (2013).
- Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R.
- Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson's disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal. 2, (2009).
- Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain. 134, 2339-2357 (2011).
- Obeso, J. A., et al. Missing pieces in the Parkinson's disease puzzle. Nat Med. 16, 653-661 (2010).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Sci Transl Med. 4, (2012).
- Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease. FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).
- Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. , (2013).
- Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. erkerian- Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson's disease. J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).
- Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S.
- di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions. Nature. 288, 370-373 (1980).
- Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones. Nature. 307, 641-643 (1984).
- Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons. Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).
- Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation. J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).
- Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels. J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).
- Toulorge, D., et al. Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2. FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).
- Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis. Mol Pharmacol. 84, (2013).
- Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression. PLoS One. 8 (e62040), (2013).
- Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).
- Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. Genetic mouse models of neurodegenerative diseases. Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).
- Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson's disease. FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).
- Lin, X., et al. Conditional expression of Parkinson's disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1. J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).
- Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice. Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).
- Ramonet, D., et al. Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2. PLoS One. 6 (e18568), (2011).
- Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. Dopaminergic axon guidance: which makes what. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
- Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).
- Ferri, A. L., et al. Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner. Development. 134, 2761-2769 (2007).
- Rayport, S., et al. Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology. J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).
- Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry. Neuroscience. 78, 759-769 (1997).
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).
- Su, H., et al. Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).
