Abstract
Dopaminerga neuroner utgör mindre än 1% av det totala antalet neuroner i hjärnan. Denna låga mängd nervceller reglerar viktiga funktioner i hjärnan såsom motorstyrning, motivation och arbetsminne. Nigrostriatala dopaminerga neuroner selektivt degenererar vid Parkinsons sjukdom (PD). Denna progressiva neuronal förlust entydigt förknippad med motorer symptom av patologin (bradykinesi, vila tremor och muskelstelhet). Den viktigaste agent som ansvarar för dopaminerga neuron degeneration är fortfarande okänd. Dessa nervceller verkar vara extremt sårbara i olika förhållanden. Primära kulturer utgör en av de mest relevanta modeller för att undersöka egenskaper och kännetecken för dopaminerga neuroner. Dessa kulturer kan lämnas in till olika stressmedel som efterliknar PD patologi och nervskyddande föreningar för att stoppa eller bromsa neuronal degeneration. De många transgena musmodeller av PD som har geneUnder det senaste decenniet betat ökade ytterligare intresset för forskare för dopaminerga neuron kulturer. Här fokuserar video protokoll om den känsliga dissekering av embryonala mus hjärnor. Exakt excision av ventrala mesencephalon är avgörande för att få neuronala kulturer är tillräckligt rika på dopaminerga celler för att möjliggöra efterföljande studier. Detta protokoll kan realiseras med embryonala transgena möss och är lämplig för immunofluorescensfärgning, kvantitativ PCR, andra budbärare kvantifiering eller nervcellsdöd / överlevnadsbedömning.
Introduction
Dopamin, en av de viktigaste signalsubstanserna i hjärnan 1,2, huvudsakligen släpptes av mitthjärnan dopaminerga (DA) nervceller. Majoriteten av DA-neuroner bosatta i den ventrala delen av mesencephalon 2-6. Schematiskt kan mitthjärnan DA nervceller delas in i tre anatomiskt och funktionellt distinkta projektionssystem: mesostriatal, mesolimbiska och mesocortical vägar 2,5. Den nigrostriatala vägen är involverad i motorbeteende, de mesolimbiska vägar spelar en viktig roll i förstärkning, motivation och lärande, medan de dopaminerga vägar skjuter till prefrontala cortex är inblandade i kognition 2.
DA nervceller är inblandade i flera mänskliga neurologiska sjukdomar som schizofreni, uppmärksamhetsstörning, hyper aktivitetsstörning, och Parkinsons sjukdom (PD) 2,4. PD karakteriseras av en progressiv och selektiv degeneration av DA neuron ansluter substantia nigrapars compacta (SNC) till striatum. Förlusten av Nigro-striatala DA neuron i svår dopaminbrist i striatum som ansvarar för de motoriska symtomen vid PS (bradykinesi, vila tremor och rigiditet) 7. Den ursprungliga orsaken till idiopatisk PD har inte fastställts och de nuvarande behandlingar är endast symtomatisk, som syftar till att återställa dopaminnivån i striatum. Den mest förskrivna läkemedlet är L-Dopa (Levodopa), den naturliga föregångare till dopamin. Även administrering av Levodopa kompenserar för förlusten av dopamin under en viss tid, motoriska komplikationer uppstår efter långtidsbehandling (dyskinesi och on / off stater) 8,9.
Forskning om dopaminerga nervceller och PD är i ständig utveckling och intensiva ansträngningar görs för att utveckla behandlingar baserade på celltransplantation, genterapi, eller nervskyddande medel 10,11. Dock kvarstår en viktig fråga som inte klar: Vad är orsaken till den extrema vulnerabbilitet i DA nervceller? En del av svaret finns i aktiviteten av DA-neuroner. En minskning av den elektriska aktiviteten och retbarhet av DA neuron tycks öka deras benägenhet att urarta 12. Trots komplexiteten i PD patogenes kräver ytterligare studier för att identifiera de som är involverade i DA mekanismer nervceller degeneration 13-15.
Primära kulturer är särskilt relevant att studera DA neuron fastigheter 16-19 och utmana dessa neuroner till olika påfrestningar för utvärdering av neuroskyddande medel 20-24. Rat odlingsmodeller används oftast, eftersom dissekering av råttembryo mesencephalon är lättare, jämfört med musen, och större mängder av nervceller kan erhållas hos råtta. Men generation av transgena musmodeller av sjukdomen 25 har betydligt ökat intresse hjärnforskare community för primära kulturer från musen 26-29. Fastän kulturer prepared från nyfödda djur kan användas, är det bättre att förbereda dem från embryon vid post-mitotiska stadiet (E13.5 för mesencephalon neuroner), när nervceller har behållit sin förmåga att differentiera. Följande protokoll består av isolerade mesencephalon nervceller i primär kultur från musembryon (E13.5), som är den svåraste att förbereda. Notably, tillhandahåller vi ett protokoll med användning av serumfritt odlingsmedium för en bättre reproducerbarhet. De två mest kritiska stegen i förberedelserna kultur (dissekering och mekanisk dissociation) kommer att noggrant beskrivs i den tillhörande videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De möss som användes i detta arbete var omhändertagna och hanteras i enlighet med riktlinjerna från Europeiska unionens råd (86/609 / EU) för användning av försöksdjur.
1 Beredning av Nödvändiga lösningar
- Stamlösningar
- 10x Poly-L-ornitin (PLO) Lösning: Väg in 10 mg PLO hydrobromid (molekylvikt = 30,000-70,000) och lös upp i 70 ml sterilt vatten. Filtrera lösningen genom att använda 0,2 | im sprutfilter, alikvot, och förvara vid -20 ° C.
- 30% glukoslösning: Väg upp 30 g D (+) - glukos och upplöses i sterilt vatten till en total volym av 100 ml. Filter, delprov, och förvara vid 4 ° C.
- 5x Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) / Nutrient Mixture F-12 Ham: Väg upp 6 g DMEM / F-12 Ham pulver och lösas upp i sterilt vatten till en total volym av 100 ml. Filter, delprov, och förvara vid 4 ° C.
- 7,5% natriumbikarbonat (NaHCO 3) Solutiden: Väg upp 7,5 g av NaHCOs 3 och löses upp i sterilt vatten till en total volym av 100 ml. Filter, delprov, och förvara vid 4 ° C.
- 1 M HEPES-lösning: Väg upp 23,8 g HEPES och lös upp i sterilt vatten till en total volym av 100 ml. Filter, delprov, och förvara vid 4 ° C.
- 70% (v / v) etanol: Späd 70 ml absolut etanol med 30 ml sterilt vatten.
- Fosfatbuffrad saltlösning med Glukos och antibiotika (PBS-GAB): tillsätt 10 ml 30% glukoslösning och 5 ml penicillin-streptomycin lösning till 500 ml Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning. Förvara vid 4 ° C.
- Inaktiverat fetalt bovint serum (IFB): Tina bovint serum över natt vid 4 ° C och inaktivering vid 56 ° C under 30 min. Alikvot i 50 ml och förvara vid -20 ° C.
- Kultur Medium: I sterilt vatten, blanda successivt 40 ml 5x DMEM / F12-Ham, 1 ml av 1 M HEPES, 2 ml 200 mM L-glutamin, 2 ml av penicillin-streptomycin, 4 ml 30% glukos and 3 ml 7,5% NaHCOa 3 till en slutlig volym av 180 ml. Filtrera och använd samma dag.
- Hormone Mix
- Bered 180 ml odlingsmedium. Lös 200 mg av apo-transferrin i detta medium.
- Väg upp 50 mg insulin och lös upp i 2 ml 0,1 M HCl. Tillsätt långsamt 8 ml sterilt vatten under blandning försiktigt. Späd denna lösning i odlingsmediet.
- Väg upp 19,3 mg Putrescine dihydroklorid och lös upp i 10 ml sterilt vatten. Tillsätt 10 ml lösning på hormonblandning.
- Bered en 3 mM natriumselenit lösning i sterilt vatten och en 2 mM progesteron lösning i absolut etanol. Lägg 20 | il av varje lösning på hormonblandning.
- Filtrera den hormonblandning, alikvot i 10 ml och förvara vid -20 ° C.
2 Beredning av odlingsplattor och instrument
- FBS Beläggning av odlingsplattor: Dagen före dissektion, förbereda 180 ml odlingsmedium. Tillsätt 10 mlIFB till 90 ml odlingsmedium. Lägg 300 | il / brunn av odlingsmedium / 10% IFB till poly-D-lysin förbelagda 24-brunnars plattor. Inkubera över natten vid 37 ° C. Spara resterande media (med och utan IFB) vid 4 ° C.
- Sterilisera instrumenten och Pasteur pipetter. Samla utrustning som förtecknas i Material bord samt en klass II laminärt flöde huva och ett CO2-inkubator.
3 Dissekering av Mouse Mesencephalon
- Offra en E13.5 gravid mus (enligt institutionens riktlinjer). Rengör buken av musen med 70% etanol och öppna buken väggen. Samla livmoderhornen, öppna dem med känsliga sax, dissekera varje embryo från livmoderhornen, och ta bort de fostervatten membran. Placera embryon i en 100 mm petriskål med steril PBS-GAB och tvätta dem genom överföring i 3 på varandra följande identiska bad med hjälp av pincett. För dissektion, placera embryon med 3 i en 60 mm steril petriskål.
- Move finalen petriskål under stereomikroskop. Inte halshugga embryona. Använda Vannas sax, skära hjärnan.
- Ta försiktigt bort och kasta de prognos och hindbrain regioner. Till den rostrala sidan, skär nära den talamisk regionen, till den näst sista sidan skär i näs-regionen, ta bort den överlägsna colliculi.
- När den ventrala mitthjärnan isoleras försiktigt bort hjärnhinnorna som använder ultra fin pincett. Samla dissekerade segmenten, utan hjärnhinnorna, i ett sterilt 13 ml rör fyllt med PBS-GAB.
- Rengör röret innehållande mesencephala noggrant med 70% etanol och föra den under huven.
4. Cell Dissociation
- Tvätta mesencephala 3x med steril PBS-GAB. Låt hjärnan fragment att bosätta mellan varje tvätt och undvika störningar i vävnaden. Efter den sista tvätten, ta bort försiktigt så mycket lösning som möjligt och inkubera hjärnan segment i 3 ml trypsin / EDTA under 15 minuter vid 37 ° C i enCO 2 inkubator.
- Brand polish de Pasteur pipetter för att maximera överlevnaden av nervceller som i slutet av en icke-polerat glas pipett är vass och kan skada cellerna under dissociation steg. Något minska den yttersta diametern (upp 0,5 mm) i pasteurpipett medan brand torkar den.
- Ta försiktigt bort så mycket trypsin / EDTA-lösning som möjligt och tillsätt 10 ml odlingsmedium / 10% IFB. Tvätta hjärnsegment 3x med odlingsmedium / 10% IFB.
- Använda brand-polerad pasteurpipett, börjar dissociation av mesencephala i 6 ml odlingsmedium / 10% IFB. Finfördela 10x (undvik luftbubblor), låta bitar att lösa, samla mediet i en ny steril 13 ml tub.
- Lägg 6 ml odlingsmedium, upprepa föregående steg en gång och samla mediet innehållande dissocierade celler i samma 13 ml rör.
- Centrifugera cellerna vid 160 g under 5 min. Kasta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i odlingsmedium kompletterat med10% hormonblandning.
5. Cell Plating
- Räkna celler i suspension i ett Malassez cell och justera volymen på medium till en koncentration av 600.000 celler / ml. Cirka 1,700,000 celler kan erhållas från en mus hjärnan.
- Avlägsna FBS-innehållande beläggningsmedium från 24-brunnars plattor och lägga i varje brunn 1 ml cellsuspension (600,000 celler / brunn, 2-4% av TH +-celler).
- Inkubera plattan vid 37 ° C och 5% CO2 / 95% luft. Ingen mediumbyte är nödvändigt. Dopaminerga neuron är mogna efter cirka 5-7 dagar in vitro (konsekvent uttryck för dopamintransportören). Håll celler i kultur upp till 15 dagar utan mellan ersättare.
6. Immunofluorescens protokoll
- Rengöring av Täck
- Dagen före dissekering, tillsätt 10 ml 1 M HCl i en petriskål. Lägg på ytan av vätskan 12-15 av glas och vänta 15 min.
- Sink locketglida in i vätskan och vänta 15 min.
- Ta HCI och tvätta 3x med vatten.
- Tvätta täckglasen snabbt med ren etanol gång, lägg sedan till ren etanol till skålen och vänta 30 min.
- Under huven, ta bort rengjorda täck från etanol och tillsätt 1 täckglas per brunn i en 12 brunnar cellodling plattan med steriliserade pincett.
- Tvätta täckglas två gånger med sterilt vatten (1 ml / brunn). Sedan, tvätta dem en gång med steril PBS.
- Beläggning av Täck
- Avlägsna PBS och tillsätt 500 | il / brunn av 2x PLO (utspädd i PBS). Inkubera under 4 h vid 37 ° C i CO2 inkubator.
- Ta PLO lösningen och tvätta 3x med steril PBS.
- Avlägsna PBS och tillsätt 500 | il / brunn av 20% IFB / 1 g / ml laminin. Inkubera över natten vid 37 ° C i CO2 inkubator.
- Bordläggningen av celler för Immunfluorescens
- Avlägsna beläggningsmedium från 12-brunnars plattor.
- Lägg 900,000 celler / brunn i 2 ml volym och växa cellerna vid 37 ° C i inkubatorn. Celler kan hållas i kultur upp till 15 dagar utan mellan ersättare.
- Immunfärgning
- Avlägsna medium från 12-brunnars plattor och tvätta med 500 ul / brunn DMEM förvärmd vid 37 ° C.
- Lägg 500 | il / brunn av DMEM förvärmd vid 37 ° C, tillsätt sedan försiktigt 160 | il / brunn av 8% paraformaldehyd (PFA, 2% slutlig koncentration) och inkubera under 10 min vid 37 ° C.
- Avlägsna PFA och tvätta 3x med PBS / 0,1 M glycin under 10 min.
- Avlägsna PBS, tillsätt 300 | il / brunn av PBS / 0,05% Triton X-100/20% getserum och inkubera under 30 min vid rumstemperatur.
- Avlägsna mediet, tillsätt 300 | il / brunn av primär antikropp utspädd i PBS / 0,05% Triton X-100/1% getserum och inkubera i 2 h vid rumstemperatur. Primära antikroppar som kan användas för detektionen av dopaminerga neuroner och karakteriseringen av kulturen är indikerade i tabellen Materials. Håll1 bra utan primär antikropp för att bedöma om bakgrunden till de olika sekundära antikroppar.
- Ta medium och tvätta 3x med PBS / 0,2% gelatin i 10 min.
- Avlägsna mediet, tillsätt 300 | il / brunn av sekundär antikropp utspädd i PBS / 0,05% Triton X-100/1% getserum och inkubera under 1 h vid rumstemperatur, i mörker. Sekundära antikroppar som används anges i tabellen Materials.
- Ta medium och tvätta 3x med PBS / 0,2% gelatin i 10 min.
- Ta medium och tvätta 3x med PBS.
- Montera täck på objektglas cellsidan nedåt i en droppe Vectashield. Håll glasen vid rumstemperatur över natten för att låta monteringsmedium torr, sedan lagra dem vid 4 ° C.
- Förvärva bilder med hjälp av en konfokalmikroskop eller ett faskontrastmikroskop utrustad för epifluorescens. Bilderna har förvärvats med en Leica SP2 UV konfokalmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En illustrerad flödesschema över mesencefalon odlingssteg visas i figur 1. Kortfattat, efter insamling E13.5 embryon från en gravid schweizisk mus, är ventrala mitthjärnan dissekerades från hela embryot. De isolerade hjärnfragment successivt fram för enzymatisk nedbrytning och mekanisk dissociation. Dissocierade celler pelleteras genom centrifugering, resuspenderades i odlingsmedium och ströks ut i förbelagda 12 eller 24-brunnars plattor. Celler bibehålls upp till 15 dagar utan mellan ersättare.
Ett detaljerat flödesschema över den ventrala mitthjärnan dissekering, motsvarande steg 3,2, visas i figur 2. Streckade röda linjerna indikerar de tre huvudskärlinjer på en schematisk representation av E13.5 mushjärna (anpassad från Prestoz et al. 30) och skär steg illustreras.
Fas kontrastbilder av kulturen efter en, 4, och 7 dagar i vitro (DIV) visas i figur 3. nervceller snabbt utveckla tillägg och groning (Figur 3A). Förgrening och förgreningar är mer utsträckt vid DIV4 och DIV7 (figur 3B-3C).
Dopaminerga neuroner detekteras genom immuncytokemi med användning av en anti-TH-antikropp (Figur 4A). Antalet TH +-celler uttrycks per 2,5 cm 2 täckglas (Figur 4B). Vi uttrycker inte antalet TH + celler per samt tätheten av celler är mycket högre på gränsen till den belagda plast väl än på den belagda täckglas, är att i mitten på brunnen. DA nervceller (TH + celler) utgör 2-4% av hela cellpopulationen på täckglas. TH-positiva (TH +) celler, tycks redan i DIV1 och deras antal ökar snabbt för att nå ett maximum vid DIV6.
Den relativa andelen celler bedöms genom immunofluorescens märkning av DA-celler with en anti-DAT-antikropp (figur 5A) eller en anti-TH-antikropp (figur 5B) och samtidig färgning av neuronala celler med anti-MAP2 antikroppen. Representant immunofärgning av flera neuronala populationer som finns i kulturen är också visad i figur 5. GABAerga neuron färgas med användning av en anti-GAD67-antikropp (figur 5C) och representerar omkring 50% av cellerna. Serotonerga nervceller detekteras med en anti-serotonin antikropp (Figur 5D) och utgör mindre än 1% av cellerna i kulturen. Den mesencefalon cellodling innehåller också glutamaterga neuroner (40% av kulturen), kolinerga neuroner, och sällsynta gliaceller (omkring 2-3%). Andel av gliaceller bestäms med hjälp gliafibrillärt surt protein (GFAP) färgning (Figur 5E). Otvetydig identifiering av mesencefalon dopaminerga neuroner kan också uppnås med användning av specifika markörer såsom Pitx3 eller Foxa2 31,32.
Högre förstoring immunofärgning av flera neuronala populationer som finns i kulturen visas i figur 6. Dopaminerga neuroner detekteras med användning av en anti-DAT-antikropp (figur 6A). DAT färgning speglar DA neuron mognadstillstånd. DAT uttrycket börjar vid DIV3-4. GABAerga neuroner och serotonerga neuroner är färgade med hjälp av en anti-GAD67-antikropp (figur 6B) eller en anti-serotonin antikropp (figur 6C), respektive.
Figur 1 Illustrerad flödesschema över mesencephalon kulturen. Huvudkultursteg indikeras. (A) Offra en gravid schweizisk mus, samla E13.5 embryon i petriskålar och tvätta dem med varandra PBS bad. (BC) Enligt dissektion mikroskop, dissect ventrala mitthjärnan från hela embryon och placera dem i ett rör. (D) Lägg till trypsin-EDTA till de dissekerade hjärnfragment och smälta vid 37 ° C i 15 min. (E) Ta bort trypsin, till serum som innehåller-odlingsmedium och utför mekanisk cell dissociation (10 finfördelning rörelser, upprepat två gånger). (F) Pellets cellen, resuspendera dem i serumfritt medium kompletterat med hormoner och plattan dem i förväg belagda 12 eller 24 brunnar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2 Detaljerad flödesschema för mesencephalon dissektion. Huvud dissektion steg indikeras. (A) Mouse embryo vid E13.5 efter removal från livmoderhornen. (B) Utan halshuggning embryot, skära hjärnan. (C) Schematisk bild av embryonal mushjärna vid E13.5. Röda streckade linjer visar var hjärnan bör klippas för att isolera ventrala mitthjärnan (R, rostral cut, C, caudal cut, D, rygg cut). Den cefaliska blåsor telencephalon, diencephalon, mesencephalon och rhombencephalon avgränsas på blått, lila, rosa och grått, respektive. Aq, akvedukt; Hypoth, hypothalamus; LGE, lateral ganglionär eminens; LV, laterala ventrikeln; MFB, medial forebrain bundle; MGE, medial ganglionär eminens; sc, överlägsen colliculi; Thal, thalamus; VM, ventrala mitthjärnan; 4V, fjärde ventrikeln (anpassad från 30). (D) Skär linjer markeras med röda streckade linjer på en E13.5 mushjärna. (E) Mouse hjärnan efter avlägsnande av prognos och hindbrain regioner (dvs efter cut R). (F) mushjärna efter borttagande av superior colliculus (dvs. efter nedskärningar R & D). (G) Ventrala tanke på en isolerad mesencephalon (dvs. efter skär R, C, D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Fas kontrastbilder av kulturen i olika stadier av utveckling. (A) DIV1, (B) DIV4, och (C) DIV7 bilder av samma kultur är visade. Bilder förvärvades på levande celler med ett inverterat mikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. tyrosinhydroxylas färgning av dopaminerga neuroner. (A) Vid DIV8 ades DA-neuroner detekterades med användning av anti-TH-antikropp. Uppenbarelse utfördes med användning av en 3,3 'Diaminobenzidine (DAB)-kit. Bilden förvärvades med ett inverterat mikroskop. (B) Antal TH + nervceller i mesencephalon kulturer som en funktion av ålder av kulturen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 representativ andel av nervceller och astrocyter i kulturen. Vid DIV4, DA nervceller (i magenta) detekterades med hjälp av anti-DAT (A) eller anti-TH-antikropp (B) och GABA-erga neuroner, serotonerga neuroner och astrocyter (i magenta) detekterades med användning av anti-GAD67 (C), anti-serotonin (D) och anti-GFAP (E) antikroppar, respektive. Neuronala celler (i cyan) färgades med en anti-MAP2-antikropp (AE). Bilder förvärvades med ett inverterat mikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 Representant färgning av flera cellpopulationer i mesencephalon kulturen. (A) dopaminerga neuron upptäckts av DAT färgning vid DIV9 (i rött). (B) GABAerga neuron visualiseras av GAD-67 färgning vid DIV9 (i grönt).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll presenteras de förfaranden och reagens som är nödvändiga för att förbereda en primärkultur mesencefala nervceller från embryonala musen och immunofluorescens förfarandet för att upptäcka dopaminerga neuroner. Kritiska steg i proceduren är dissektion av embryon och mekaniska dissociation av de insamlade hjärnfragment. Hög dissektion instrument kvalitet hjälper till att behärska dissektion tekniken. DA nervceller utgör en liten del av mitthjärnan. Således samla den högra delen av den ventrala mitthjärnan är viktigt att få en kultur som innehåller 2-4% av DA-neuroner. Mekanisk dissociation bör utföras noggrant och försiktigt. Om kulturen innehåller kluster av icke-differentierade nervceller, lägga till en eller två finfördelning steg.
Detta protokoll använder serumfritt medium för neuron kultur. Emellertid beläggning med serum som är nödvändigt för att förbättra vidhäftning av cellerna. Hormonblandning, som ersätter Serum, definieras för att möjliggöra neuron tillväxt och för att minimera gliaceller överlevnad och spridning. Följaktligen icke-neuronala celler utgör 2-3% av kulturen (kvantifiering med hjälp av GFAP-färgning). Alternativt kan kulturerna odlas i närvaro av serum med tillsats, två-dagar efter sådd, av cytosin-β-D-arabinofuranosid (Ara-C, 5-8 ^ M) för att undertrycka proliferation av gliaceller 26. Ett annat alternativ till hormonblandningen är användningen av definierade medier och tillägg 29.
Denna teknik är lämplig för att utföra immunofluorescensfärgning, kvantitativ PCR, andra budbärare kvantifiering och olika typer av toxikologin / överlevnads skärmar. Det bör också vara möjligt att genomföra elektrofysiologiska studier av dessa preparat 33,34. Dessa kulturer kan identifiera potentiella kandidatnervskyddande molekyler och bidra till att karakterisera DA neuron egenskaper, och samtidigt minimera antalet djur som används. Emellertid final bekräftelse med hjälp av in vivo-modeller begärs, eftersom odlade nervceller inte får input från andra delar av hjärnan, som kan starkt påverka sin mognad.
Denna teknik är inte så vanligt jämfört med råttodlingsmodeller, trots dess första beskrivningarna i början av åttiotalet 16,17. Bristen på bilder som presenterar den känsliga dissektion kan hindra forskare att utveckla denna mus kulturmodell. Men på grund av uppkomsten av ett stort antal transgena musmodeller för neurodegenerativa sjukdomar 25 med specifik gen ogiltig eller märkning av särskilda neurontyper, DA neuron kulturer från mus är nu av stort intresse.
Maste Denna teknik tillåter studiet av DA-neuroner som isolerats från någon typ av transgen mus och att undersöka stömingsinducerad genom genmodifiering. Dessutom kan dessa kulturer användas som referensmodeller att jämföras med DA neuron härledda från mus stamceller 35 eller från inducerade pluripotenta stamceller 36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| DMEM 4.5 g/L glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140122 | |
| L-Glutamine, 200 mM solution | Life Technologies | 25030123 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D0547 | Powder |
| Laminin - 1 mg/ml in Tris buffered NaCl | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-Ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Insulin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | I5523 | |
| apo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Stock solution 1 M in water |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Stock solution 2% (w/v) in water |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Paraformaldehyde 16% in water | Electron Microscopy Sciences | RT 15710-S | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck Millipore | 106329 | |
| D(+)-Glucose, Monohydrate | Merck Millipore | 4074-2 | |
| Hydrochloric acid - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) Titripur | Merck Millipore | 109057 | |
| Sterile water - Aqua B. Braun | Braun | ||
| Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent | VWR | 20821.321 | |
| Sterile Petri dishes | VWR | 82050-566 | |
| Pasteur pipettes plain glass - Wilhem Ulbrich GdbR. | VWR | 612-2297 | |
| Counting chamber Malassez | VWR | 631-0975 | |
| Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm | PALL Life science | 4525 | |
| Surgical Scissors - Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long | Fine Science Tools | 14002-14 | To open the abdominal wall |
| Scissors - Straight, pointed, delicate, 10 cm long | MORIA | 4877A | To open the uterine wall |
| Forceps - Curved, usual, serrated jaws 1 mm | MORIA | 2183 | To manipulate embryos |
| Vannas Scissors - Curved, pointed, 7 mm blades | MORIA | MC50 | To take out the mesencephalon |
| Ultra Fine Forceps - Curved, delicate, 13 cm long | MORIA | 9987 | To remove meninges |
| BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates | BD Bioscience | 356414 | |
| BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD Bioscience | 353043 | |
| SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º | MENZEL-GLÄSER | AG00008032E | |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø | MARIENFELD | 117580 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody | Chemicon Millipore | AB5622 | 1/200 |
| Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2 | Chemicon Millipore | MAB5406 | 1/400 |
| Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt | Chemicon Millipore | MAB369 | 1/500 |
| Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody | 1/8,000 - Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch) | ||
| Goat Serum, New Zealand Origin | Life Technologies | 16210-064 | |
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-31556 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | 1/1,000 |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11007 | 1/1,000 |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss microscopy | Stemi-2000C | |
| Bunsen Burner FIREBOY | VWR | 451-0136 |
References
- Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum. Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).
- Iversen, S. D., Iversen, L. L.
- Dahlstroem, A., Fuxe, K. Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons. Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).
- Chinta, S. J., Andersen, J. K.
- Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
- Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O'Keeffe, G. W. Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development. Dev Biol. 379, 123-138 (2013).
- Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R.
- Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson's disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal. 2, (2009).
- Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain. 134, 2339-2357 (2011).
- Obeso, J. A., et al. Missing pieces in the Parkinson's disease puzzle. Nat Med. 16, 653-661 (2010).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Sci Transl Med. 4, (2012).
- Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease. FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).
- Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. , (2013).
- Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. erkerian- Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson's disease. J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).
- Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S.
- di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions. Nature. 288, 370-373 (1980).
- Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones. Nature. 307, 641-643 (1984).
- Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons. Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).
- Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation. J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).
- Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels. J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).
- Toulorge, D., et al. Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2. FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).
- Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis. Mol Pharmacol. 84, (2013).
- Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression. PLoS One. 8 (e62040), (2013).
- Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).
- Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. Genetic mouse models of neurodegenerative diseases. Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).
- Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson's disease. FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).
- Lin, X., et al. Conditional expression of Parkinson's disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1. J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).
- Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice. Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).
- Ramonet, D., et al. Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2. PLoS One. 6 (e18568), (2011).
- Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. Dopaminergic axon guidance: which makes what. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
- Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).
- Ferri, A. L., et al. Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner. Development. 134, 2761-2769 (2007).
- Rayport, S., et al. Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology. J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).
- Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry. Neuroscience. 78, 759-769 (1997).
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).
- Su, H., et al. Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).
