פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת כדי לדמיין ולעקוב אחר קולטנים בודדים על פני תאים חיים ובכך לנתח את הניידות הרוחבית של הקולטן, גודל קומפלקסי הקולטנים וכן לדמיין אינטראקציות קולטן-קולטן חולפות. ניתן להרחיב פרוטוקול זה לחלבוני ממברנה אחרים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי
במאמר זה
סיכום
תקציר
מיקרוסקופיה המולקולה בודדת מתגלה כגישה רבת עוצמה כדי לנתח את ההתנהגות של מולקולות איתות, בפרט בנוגע לאלו היבט (למשל., קינטיקה, דו קיומן של מדינות שונות ובאוכלוסיות, אינטראקציות חולפות), אשר מוסתרות בדרך כלל במדידות הרכב, כגון אלו שהושגו עם שיטות ביוכימיות או במיקרוסקופ רגילה. לפיכך, אירועים דינמיים, כגון אינטראקציות רצפטור לרצפטור, יכולים להיות מיושמים בזמן אמת בתא חי עם רזולוציה spatiotemporal גבוהה. פרוטוקול זה מתאר שיטה המבוססת על תיוג עם fluorophores האורגני קטן ובהיר וקרינת השתקפות הפנימית מוחלטת מיקרוסקופיה (TIRF) ישירות לדמיין קולטנים בודדים על פני השטח של תאי חיים. גישה זו מאפשרת למקם במדויק קולטנים, למדוד את הגודל של מתחמי הקולטן, וללכוד אירועים דינמיים כגון אינטראקציות קולט קולט חולפות. הפרוטוקול מספק תיאור מפורט של איך perform ניסוי מולקולה בודדת, ובכלל זה הכנת מדגם, רכישת תמונה וניתוח תמונה. כדוגמא, היישום של שיטה זו כדי לנתח שני G-חלבון בשילוב קולטנים, כלומר., Β רצפטור סוג חומצת B-2 adrenergic וγ-aminobutyric (GABA-B), הוא דיווח. הפרוטוקול יכול להיות מותאם לחלבונים אחרים קרום ודגמים סלולריים שונים, שיטות transfection ואסטרטגיות תיוג.
מבוא
קולטנים הממוקמים על פני התא לחוש את הסביבה תאית ולהגיב למגוון של גירויים, כמו הניחוח, יונים, נוירוטרנסמיטורים והורמונים קטנים חלבון גדולים. טבע הנוזל של קרומים תאיים מאפשר תנועות של קולטנים וחלבונים קרום אחרים. זה חיוני להיווצרות של קומפלקסי חלבונים ואת המופע של אינטראקציות בין חלבונים חולפים, כגון אלו המשמשים על ידי קולטנים להרכיב ליחידות פונקציונליות וtransduce אותות לתוך התא הפנימי. לדוגמא, ה-G--חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs), המהווה את המשפחה הגדולה ביותר של קולטני 1 על פני קרום התא, הוצעו להקים di-/oligomers, המופיע להיות מעורבים בוויסות מכויל של התמרה אות ו אולי יש השלכות פיסיולוגיות ותרופתיות חשובות 2-5.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. לדוגמא הכנה
- ניקוי coverslip
הערה: עבודה מתחת למכסת מנוע קטר.- להשתמש בפינצטה נקייה למקום coverslips זכוכית (קוטר 24 מ"מ) לבעל coverslip שמפריד coverslips פרט.
- שים את בעל עם coverslips לתוך מבחנה, ולהוסיף כלורופורם עד coverslips מכוסה. מכסה את הכוס בנייר אלומיניום כדי להפחית את האידוי וsonicate בsonicator אמבטיה במשך שעה 1 ב RT. קח את בעל coverslip מהכוס ולתת את coverslips יבש. <....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הפרוטוקול המתואר ניתן ליישם במגוון רחב של חלבוני קרום שונים. כדוגמא, נציג תוצאות שהושגו עם β-adrenergic קולטנים 2 וGABA-B מדווחים 10. מאז אותות ניאון ממולקולות בודדות חלשים, מזעור הקרינה רקע הוא צעד המפתח הראשון לתוצאות מוצלחות. לכן, חשוב להשתמש coverslips ניקה בהרחבה (איור 2 א), כמו גם כדי למזער autofluorescence מדגם (למשל., על ידי שימוש בתקשורת חופשית פנול האדום). השלב הבא הוא לקבוע את עוצמת הקרינה של מולקולות fluorophore אחת. ניתן.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המתואר מאפשר ניתוח של סידור המרחבי, הניידות וגודל של מתחמי קולטן על פני קרום התא ברמת מולקולה בודדת. בהשוואה לשימוש בחלבוני ניאון, תיוג עם fluorophores האורגני קטן, שהם בהירים וphotostable יותר, יש יתרון בכך שהתיר להדמיה ממושכת של חלקיקי קולטן אחד. מאז רמות ביטוי נמוכות ביותר מושגות (<0.45 חלקיקי קולטן / מיקרומטר 2), ניתן לנתח את המאפיינים של רצפטורים וחלבונים קרום אחרים בצפיפויות שלא יעלו פיסיולוגיים אלה. יתר על כן, תופעות של גירוי הקולטן עם אגוניסטים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
פיתוח פרוטוקול זה נתמך על ידי מענקים מהמועצה האירופית למחקר (מענק מתקדם TOPAS ל-M.J.L) ו-Deutsche Forschungsgemeinschaft (מענקים CA 1014/1-1 לוושינגטון ו-SFB487 ל-M.J.L). T.S. נתמך על ידי קרן אלכסנדר פון הומבולדט.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Chloroform | AppliChem GmbH | A1585 | זהירות: חומר רעיל ומגרה כמו גם חומר מסרטן אפשרי |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | זהירות: בסיס חזק ומגיב קורוזיבי מאוד |
| אתנול מוחלט | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| כיסוי זכוכית | Marienfeld-Superior | 111640 | קוטר 24 מ"מ, 0.13-0.16 מ"מ עובי |
| 0.2 מ"מ פילטר סטרילי | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| תאי CHO | ATCC, USA | ATCC CCL-61 | קו תאי שחלה של אוגר סיני |
| 6 בארות צלחת תרבית תאים | Nunc | 140675 | |
| DMEM/F-12 בינוני | GIBCO, Life Technologies | 11039-021 | מדיום נטול פנול-אדום |
| סרום בקר עוברי | ביוכרום | S 0115 | |
| פניצילין - סטרפטומיצין | Pan Biotech GmbH | P06-07 100 | |
| Trypsin-EDTA | Pan Biotech GmbH | P10-23100 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies | 11668-019 | |
| Opti-MEM I סרום מופחת | בינוני Invitrogen, Life Technologies | 31985-047 | |
| בנזיל גואנין מצומד פלואורופור | ניו אינגלנד BioLabs | S9136S | SNAP-Surface Alexa Fluor 647. צור פתרון מלאי של 1 מילימטר ב-DMSO. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. |
| DMSO | AppliChem GmbH | A1584 | |
| מאגר הדמיה: | 137 מ"מ NaCl, 5.4 מ"מ KCl, 2 מ"מ CaCl<תת>2, 1 מ"מ MgCl<תת>2, 10 מ"מ HEPES, pH 7.3, מסונן סטרילי | ||
| NaCl | AppliChem GmbH | A1371 | |
| KCl | AppliChem GmbH | A3582 | |
| CaCl2 | AppliChem GmbH | A2303 | |
| MgCl2 | AppliChem GmbH | A3618 | |
| HEPES | AppliChem GmbH | A3724 | |
| תא הדמיה | בדיקות מולקולריות, Life Technologies | A-7816 | תא תא אטופלואור, למיקרוסקופיה |
| TIRF-M | Leica | דגם: DMI6000B | |
| מטרת TIRF | Leica | 11 506 249 | HCX PL Apo 100x/1.46 שמן CORR |
| מצלמת EM-CCD | Roper Scientific | Photometrics Cascade 512B | |
| בקר טמפרטורה | Pecon | Tempcontrol 37-2 תוכנת | |
| ImageJ | NIH, ארה"ב | http://rsbweb.nih.gov/ij | |
| תוכנת u-track | מעבדה לביולוגיה חישובית של התא, המחלקה לביולוגיה של התא, בית הספר לרפואה של הרווארד, ארה"ב | ||
| http://lccb.hms.harvard.edu/software.html Matlab תוכנה | The MathWorks, ארה"ב |
מקורות
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Angers, S., Salahpour, A., Bouvier, M. Dimerization: an emerging concept for G protein-coupled receptor ontogeny and function. Annu Rev Pharmacol To....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
