Summary
I hjärtmyocyter, rörformiga membranstrukturer bildar intracellulära nätverk. Vi beskriver optimerade protokoll för i) isolering av myocyter från mus hjärta inklusive kvalitetskontroll, ii) levande cell färgning för state-of-the-art fluorescensmikroskopi, och iii) direkt bildanalys för att kvantifiera komponent komplexitet och plasticitet i intracellulära membran nät.
Introduction
Hos friska tvärstrimmiga muskelceller, rörformiga membranstrukturer med "tvärgående" riktlinjer (T-tubuli) vinkelrätt mot huvudcellaxeln är riklig. Följaktligen har T-tubuli karaktäriserats som kontinuerliga förlängningar av muskelcellen viktigaste "lateral" ytmembran (sarcolemma), som djupt tränger cytosolen mot cellkärnan. Den fysiologiska rollen av T-tubuli kontinuerliga med den yttre ytan membranet är den snabba elektriska kopplingen av avlägsna intracellulära fack bildas med SER organell kontakt domäner i hela den relativt stora hjärtmuskelcellvolymen genom nanometrisk närhetskoppling av spänningsaktiverade L-typ Ca2 + kanaler (Cav1.2) inåt Ström (I Ca) aktivering angränsande ryanodinreceptor (RyR2) SER Ca2 + releaser. I kammar myocyter (VMS), icke-kontinuerliga membrankontakter ("korsningar") mellan junktional SER domäner och T-tubules tros styra tusentals enskilda intracellulära Ca2 + frisättning nanodomains i varje cell 1.
För varje given kontakt domän, de intilliggande membrandelar vardera av T-tubuli och det perifera (Junktional) SER är ungefär 15 nm nära varandra, därav definieras som nanodomain. Därigenom är mycket små enskilda cytoplasmiska underrum segregerade vilket möjliggör kvasi cellautonoma fack beteenden. När ett inkommande aktionspotentialens aktiverar Cav1.2 kanaler i T-tubuli av VMS, ett relativt litet Ca2 + inåt ström kommer att snabbt öka underrum Ca 2 + koncentrationen [Ca2 +] S i attoliter stora nanodomain 1. Därefter aktiverar [Ca2 +] S ökning Ca2 + -gated ryanodinreceptorer (RyR2) inom nanometer närhet i intilliggande SER membran korsningen, och denna koppling process sker i alla elektriskt pard myocyt nanodomains. RyR2s inträffar så täta flerkanals kluster med en beräknad stökiometri 1 Cav1.2 kanal för 5-10 RyR2 kanaler 2. Eftersom SER till cytosolen [Ca2 +] gradienten är mycket brant (förhållande 10 4: 1) och RyR2s fungera som hög-konduktans Ca2 + frisättning kanaler i funktionellt kopplade kluster, RyR2 aktivering resulterar i en kvantitativt stor Ca2 + släppa ström från T-tubuli kopplade junctionala SER domäner ökar lokalt underrum [Ca2 +] S till 100 ^ M eller högre inom 1-2 msek 3,4. Denna hjärtsignalförstärkning beteende även kallad Ca 2 + inducerad Ca2 + frisättning (CICR). Sammantaget T-tubuli är viktiga membranstrukturer som snabbt aktiverar Ca2 + frisättning signaler via junctionala nanodomain SER kontakter och celltäckande CICR under excitation-kontraktion (EG) koppling.
Förutom T-tubuli, axiell tubulis (A-tubuli) med en väsentligt annorlunda inriktning parallellt med huvud (längsgående) cellaxel har dokumenterats genom elektronmikroskopi (EM), konfokala och 2-foton mikroskopi studier. Till exempel var en cell omfattande kontinuerlig gitter av A-tubuli mellan myofibriller sammankopplade med T-tubuli nära sarcomere Z-linjer visas med extracellulära spårämnen och EM avbildning av fasta marsvin VMs 5. Med hjälp av extracellulära dextran bunden fluorescein färgning och leva 2-foton avbildning av råtta virtuella datorer, var en komplex retikulära 3D tubuli nät visualiseras som består av ~ 60% T-tubuli och ~ 40% A-tubuli 6. Denna studie inte bara lett till 3D-visualisering av riklig A-tubuli, men också till insikten att sektione för EM visualisering är i sig begränsat för analys av komplexa och dynamiska membran nätverk som den tvärgående-axial tubuli systemet (TATS). Följaktligen konfokal levande cell imaging av Tats membran direkt färgas med di-8-ANNEPS utvecklades. Om levande cellTats nätverk analyseras med Fourier-transformation, är det vanliga utseendet på T-tubuli komponenter i utrymmet nära sarcomere Z-linjerna reflekteras av ensemblen effektspektrum från en region av tvärstrimmiga signaler 7. Analysen strategi indirekt har använts för att upptäcka cellomfattande regionala förändringar i TATS komponentregelbundenhet i sjukdomsmodeller 7. Till exempel, orsakade shRNA medierad junctophilin-2 knock-down hjärtsvikt och isoform specifika proteinbrist ledde till T-tubuli omorganisation med nanodomain Ca2 + frisättning dysfunktion 8. Vi har nyligen förlängt analysen av Tats membran nätverk genom direkta kvantitativa metoder och vidare med levande cell Superresolution mikroskopi av enskilda tats komponenter i mus-VM med hjälp av stimulerad emission utarmning (STED) nanoscopy 9. Nanometrisk bildupplösning tillåtet för direkt analys av mindre enskilda tats komponenter som approximerar en 50:50 fördelning av tvärgåendekontra axiella tubuli inriktningar, kvantitativt bekräftar två rikliga ännu differentiellt orienterade individuella tats komponenter i friska mus hjärtan 9. Dessa strategier kommer att beskrivas närmare i protokollet nedan.
Medan den fysiologiska rollen för den rikliga A-tubuli komponenter i den vuxna hjärtat har förblivit gåtfull har EM-studier dokumenterade SER membranstrukturer associerade med A-tubuli tyder endogena Ca 2 + frisättning nanodomains i marsvin och råtta VM 5,10. Confocal analys av Cav1.2 och RyR2 fann en hög grad av colocalization på A-tubuli korsningar 10. Sedan ~ 20% av spontana Ca2 + gnistor i råtta virtuella ursprung relativt långt bort från Z-linjen strimmor där T-tubuli inträffar typiskt har ett argument varit att A-tubulus associerade nanodomains faktiskt kan existera och fungera som Ca2 + frisättning sajter 11,12. Intressant, T-tubuli bildning och mognad occurs endast efter födseln och parallellt med framväxten av hjärtceller, t.ex. genom groning av prekursor sarcolemmal invaginationer på P5 och omogna grenade TATS nätverksenheterna vid P10 i möss 13. Det framgår att Junctophilin-2 är särskilt viktigt för postnatal TATS nätverk mognaden sedan shRNA knock-down förhindrade förankringen av T-tubuli membran till Ser korsningar som leder till fördröjd Ca 2 + frisättning och patologisk TATS organisation i överensstämmelse med omogen A-tubulus dominerade arkitekturer i VM 13. Dessa observationer kan i slutändan leda till proof-of-concept som T-tubuli bildas genom membran invagination processer medan A-tubuli kan morph genom ytterligare eller alternativa intracellulära mekanismer 14.
Karakterisering av tats membranförändringar hjärtsjukdom har blivit ett viktigt forskningsområde för patofysiologiska frågor. Initiala rapporter i en hundmodell pacing-inducerad hjärt failure visade en förlust på T-tubuli och Cav1.2 Ström (I Ca) 15. En gris modell av ischemisk kardiomyopati visade minskad T-tubuli tätheter och minskad synkronisering av intracellulär Ca2 + släppa 16. Med hjälp av en spontant hypertensiva råttor (SHR) modell av hjärtsvikt, var en förlust av T-tubuli samband med minskad nanodomain koppling av Cav1.2 och RyR2 av det föreslagna systemet för "RyR2 föräldralösa" 7. En förlust av T-tubuli har även visats i human virtuella maskiner från ischemiska, vidgade och hypertrofisk kardiomyopati prover 17. Vidare ökade A-tubuli rapporterats i vävnadssnitt av human dilaterad kardiomyopati 18. Efter hjärtinfarkt, visade vi en differentialmekanism TATS omorganisation i mus virtuella datorer med betydande minskningar av T-tubuli i motsats till ökningar av A-tubuli komponenter 9. Viktigt är bättre lokal membran kontrast uppnås genom levande cell superrelösning STED mikroskopi aktiverat detaljerad kvantitativ analys komponent genom direkta mätningar, som visade signifikant ökning av A-tubuli med totala ökningarna av TATS nätverkslängd och förgrening komplexitet 9. Dessutom visade det sig att träning kan vända T-tubuli ombyggnad hos råttor efter hjärtinfarkt 19 och att hjärt resynkronisering kan leda till att vända ombyggnad av T-tubuli hos hundar med förmaksflimmer tachypacing inducerad hjärtsvikt 20. Sammantaget kommer studier både sjuka människor och djur virtuella datorer samt potentiella terapeutiska ingrepp utan tvekan dra nytta av förfaranden högkvalitativa cellisolerings och detaljerade kvantitativa strategier analys som beskrivs i protokollet och resultat avsnitten nedan.
Dessutom, vilket framgår nyligen mantelyta kontra TATS membran handel med KATP kanal isoformer 21, är det viktigt att beakta förmaks myocytes (AMS) som biologiskt distinkt liksom jämförande hjärtcellmodell versus VMS. T-tubuli nyligen dokumenterats i får och människa äf 22. Aktuella uppgifter tyder på att några T-tubuli finns i AM-celler och typiskt i större däggdjur som får och människor, men inte i smågnagare 23. I motsats till virtuella datorer, i AMS intracellulära Ca2 + frisättning tycks uppträda från cellytan föröknings genom diffusion mot cellkärnan, vilket resulterar i markerad spatial och temporal Ca2 + gradients 23. Inom denna ram verkar det viktigt att belysa mekanismerna för intracellulär Ca2 + signalering instabilitet för vanliga former sjukdom såsom förmaksflimmer 24. Sammanfattningsvis är både AM och VM cellisolering och varje för friska och sjuka hjärtan som vanligen användes protokollen. Endast om cellisolering görs på rätt sätt som bedöms av mikroskopisk dokumentation av tillräcklig cellernas kvalitet bör AM och VM prover vara carried framåt för kvantitativ TATS analys. Detta innebär att följande protokoll avsnitten är kritiskt beroende av hög kvalitet cell isolat från musen eller andra arter följt av levande cell mikroskopi för att analysera intakta tats membran. Som påpekats tidigare är karakterisering av Tats membran ett utmanande forskningsområde med en benägenhet för fixering och förberedelse artefakter 6, membranförändringar på grund av osmotiska ändringar och upplösning begränsningar konventionella ljusmikroskop 9. Vi noterar att de senaste state-of-the-art protokoll för isolering av mänskliga ändringsförslagen för Ca 2 + avbildning och patch-clamp och rått VMs för cellodling har tidigare publicerats i denna tidskrift 25,26.
Protocol
OBS: Alla djurförsök har granskats och godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University Medical Center Gött i enlighet med human vård och användning av försöksdjur.
1 Isolering av förmak och kammare Myocyter från Mouse Heart
- Hantera djuren så försiktigt som möjligt och enligt godkända protokoll för att minimera stress i allmänhet och speciellt för att undvika eventuella kraftiga oavsiktliga effekter av neurohormonala excesser på isolerade hjärtceller. Dessutom injicera varje mus med heparin (500 IE / kg kroppsvikt sc) minst 20 minuter före hjärt extraktion för att förhindra blodproppar och micro emboli som avsevärt kan försämra avkastningen och integritet hjärtceller under isoleringen.
- Söva möss som är 12 veckor eller äldre genom isofluran inandning, bekräftar frånvaron av smärta abstinens reflexer och avliva djur genom halshuggning.
- Utdrag hjärtat snabbt efter tidigare etablerade expertprotokoll (t.ex. se Kaestner et al. 26 och et al. Louch 27). Undvik oavsiktlig skada på förmaken med onödiga klämma eller sträckning.
- Bevara försiktigt vävnaden i proximala aorta ascendens med hjälp av ett par av stubb pincett och rak sax för att etablera en kontinuerlig tvärgående framkant genom aortakärlväggen, vilket är viktigt för framgångsrik kanyler och perfusion av hjärtat.
- Överför utskurna hjärtat direkt i iskallt nominellt Ca2 + gratis perfusionsbuffert (efter lösningar se tabell 1). Behåll de stora fartygen fastspända under överföring via luft i buffert för att undvika oavsiktlig luftemboli tills hjärtat är helt under vatten. Använd BDM i buffert och is kylda lösningar för att förhindra hjärt kontraktion.
- Använd en kikare zoom mikroskop med tillräcklig 3D Illumnering.
- Kanylera aorta enligt panoramaStereo av hjärtat med en slät, yta polerad 21 G kanyl (ytterdiameter 0,81 mm, för vanlig mus hjärtvikt) som måste vara helt fylld med buffert. Se till att det inte finns några luftbubblor i kanylen genom att ansluta en proximal lösning behållare (t.ex. en spruta) genom en 2-vägs Luer ventil vilket möjliggör snabb kontrollösning flöde.
- Bekräfta enligt binokulärt förstoringen att kanylen är korrekt placerad inuti aortan, vilket är cirka 1 mm ovanför aortaventiler och kransartärgrenar. Absolut undvika passage genom eller oavsiktlig perforering av aorta ventiler med kanylen (detta kommer att permanent störa aortaklaffen stängning och därmed störa hjärt perfusion).
- Knyt aorta försiktigt till skräddarsydda, perifer orienterade halkskydd spår i slutet av kanylen med hjälp av två siden suturer. Spola inte krans arteries kraftfullt vid varje punkt. Anslut lösningen fyllda kanylen knuten till aorta och hjärta till en tätslutande utflöde kontakten på en anpassad och förkalibrerat perfusionssystem, aka den modifierade Langendorff setup (antingen med konstant tryck eller konstant flöde, se även diskussionen nedan).
- BEGJUTA hjärtat så snart som möjligt efter 4 min med användning av syresatt perfusions-buffert vid 37 ° C (target perfusionshastighet: 4 ml / min). Starta uppslutningen genom omkoppling av perfusion till kollagenas innehållande digereringsbuffert (600 U / ml kollagenas typ II) för 8-10 min vid 37 ° C. Övervaka utvecklingen av vävnads matsmältningen genom att bekräfta liknande vävnadsförändringar inklusive ökad opacitet, mjukhet och slapphet i hela den synliga hjärtytan.
- Dissekera hjärtkamrarna som behövs följande matsmältningen. Placera kanyl hjärtat under ett binokulärt mikroskop och visualisera den bakre hjärtväggen. Dissekera återstående icke-hjärtvävnad t.ex. lung and fartygsdelar för att undvika kontaminering cell i matsmältningen bufferten med hjälp av mikro sax (t.ex. våren sax med 8 mm raka blad) som visas i figur 1.
- Följ en checklista som särskilda kammare, regioner och / eller celler i kollagenas diger hjärtat bör skördas (Figur 1): vänster och / eller höger förmak, fri till vänster och / eller höger kammarvägg och / eller kammarskiljeväggen.
- För dissektion av specifika hjärtvävnad, använd en relativt bred och platt dissektion bad belagd med ett flera mm tjockt skikt av silikon plast elastomer. Fäst spetsen av hjärtat med en fin insekt stålstift till botten elastomerskiktet.
- Överföra den högra förmakets bihang och dissekera det högra förmaket precis ovanför atrioventrikulär ventiler. Fortsätt dissektion med vänster förmak. Dissekera och kasta den fibrösa ventilapparaten. Slutligen, dissekera de vänstra och högra fria kammarväggar och skiljeväggen och / eller småer vävnadsdelar efter behov.
- Obs endast för praktikanter: att få praktik, börja med icke omsatta mus hjärtan. För att underlätta anatomisk orientering, öva vävnadshantering inklusive alla dissektion på varandra följande steg enligt binokulärseendet som visas i figur 1. När 3D anatomi, manuell hantering enligt binokulärseende och dissektion steg är tillräckligt bekanta, fortsätter du med kollagenas diger mus hjärtan som skisserats ovan.
- För kammar myocyt (VM) cellisolering: överföra kammar vävnad i 2,5 ml av färsk matsmältningen buffert. Om samtidiga cell isoleringar från flera organdelar, t.ex. förmak och kammare försöker, kan en annan person ta över ett ben i cellen dissociation förfarandet, både för att minimera och optimera användningen av möss genom samordnad hantering av flera hjärtvävnad. Fortsätt med steg 1.9.1-1.9.4, därefter 1,10.
- Dissekera antingen hela kammarvävnadeller särskilda delar av dessa (t.ex. LV, RV, fria väggar och / eller septum) i ca 1 mm 3 st i 2,5 ml matsmältningen buffert använder vass sax (t.ex. våren sax med 8 mm raka blad) i en 60 mm petriskål .
- Försiktigt dissociera VM i cellsuspension genom långsam pulverisering av vävnadsbitar med en pipett. Undvik luftbubbling i cellsuspension.
- Lägg 8 ml stoppbuffert till VM cellsuspensionen och överför cellsuspensionen i en 15 ml koniska rör. Låt de återstående vävnadsbitar sedimentera på botten i ca 15 sekunder, men tillräckligt kort för isolerade celler att förbli i suspension. Därefter skörda VM fjädring via överföring av den överstående volymen till en ny 15 ml tub. Om kraftiga vävnadsbitar är närvarande, alternativt använda en minimalt 200 pm fördelade nylonnät att separera vävnadsbitar från cellsuspension.
- Låt VM cellsuspensionen sedimentera till botten av en 15 ml coisk röret genom gravitation för 8 min.
- Tvätta steg: avlägsna supernatanten och försiktigt suspendera återstående VM pelleten i 10 ml perfusionsbuffert. Upprepa tvättsteg 1.9.5 (tillval: lägga till ytterligare tvättsteg för att successivt öka Ca2 + koncentrationen efter behov).
- Resuspendera bosatte VM pelleten i 10 ml perfusionsbuffert och distribuera den återstående cellsuspensionen volym i 1,5 ml mikrorör (cirka 50.000 VM celler per rör).
- För förmaks myocyt (AM) cellisolering: överföra rötas / dissekerade förmaksvävnad i 1 ml färskt matsmältningen buffert.
- Skär delvis smälta förmaksvävnad i ca 1 mm 3 st i 1 ml matsmältningen buffert med hjälp av mikro sax i en liten petriskål (t.ex. 60 mm diameter). Dissociera försiktigt AM-celler ur de spjälkade vävnadsbitar i cellsuspension med hjälp av sönderdelning med en 1 ml plast pipett med ett snitt spets för att undvika skadliga vätskestrålar. Underfinfördelning strikt undvika luftbubbling i cellsuspension. Efter mekanisk omrörning, tillsätt 4 ml stoppbuffert (50 ^ M CaCl2, 10% BCS) att arrestera eventuella kvarvarande kollagenas aktivitet i cellsuspension.
- Överför AM cellsuspension i en 15 ml koniska rör. Låt de återstående vävnadsbitar sedimentera på botten i ca 15 sekunder, men tillräckligt kort för de isolerade cellerna att förbli i suspension. Skörda supernatanten volym innehållande de fria AM celler via lösningen förflyttas till en ny 15 ml tub.
- Centrifugera AM cellsuspensionen, t.ex. 2 min vid 20 xg vid RT eller - att föredra för membranstudier - låt cellerna bosätta sig långsamt genom gravitationen i 20 min i en 15 ml koniska rör.
- Tvätta steg: kassera supernatanten och försiktigt återsuspendera AM pelleten i 5 ml perfusionsbuffert. Upprepa 1.10.4.
- Resuspendera AM celler försiktigt i 5 ml perfusionsbuffert. Fördela cellsuspensionen volymen 1,5 ml mikro badkares (ca 1.000 AM celler per rör).
- Analysera och dokumentera den isolerade cellpopulation kvalitet för varje hjärta inklusive cell avkastningen med hjälp av trypanblått färgning.
- För detta, späd 500 | il av cellsuspensionen som en: 1 vol / vol med trypanblått-lösning (slutkoncentration 0,02%) med användning av 1 ml cut pipettspetsar. Blanda cellerna och trypanblått försiktigt genom mycket långsam upp / ner pipettering. Omedelbart tillämpa trypanblått innehåller cellsuspension till en Neubauer-typ förbättrades cytometer och räkna intakta myocyter med ett inverterat mikroskop.
- Uteslut alla celler med uppenbar skada, membran blebs, störda strimmor, kontrakturer och celler ansamlas intracellulärt trypanblått (Figur 2). Också utesluta spontant contracting celler, vilka är mottagliga för efterföljande celldöd. För att bedöma räkning av intakta celler i suspension, använd endast hjärtmyocyter med regelbundna strimmor som utesluter trypanblått helacellvolymen.
- Bedöma integritet enskilda förmaks- och kammar myocyter i genomlysning mikroskopi. Spara den ljusa fältet bilden som en Tif fil för dokumentation och vidare analys.
- Använd följande kriterier för analys av hjärtcellintegritet:
- bekräfta förekomsten av regelbundna strimmor hela den synliga cellvolym;
- bekräftar den kontinuerliga integritet laterala membranytan på båda cell sidor parallella med myofilamenten;
- visualisera skarpa räfflor vid inskjutna skivor på båda cell sidor som speglar integritet specifika ytan membranstrukturer; och
- visualisera fluorescerande signaler om Tats membran (eller immunolabeled caveolin-3 protein eller andra membranmarkörer) som beskrivs i avsnitt 3 för lokalisering korrelation bredvid den underliggande cellspecifika ljusa fält bild morfologi (t.ex. kombinera båda bilderna med ImageJ som över förening image).
- Bestäm sarcomere längd från den ljusa fält bilder. För medel sarcomere längd, mät avståndet sekventiellt inriktade sarcomere strimmor, och delar upp avståndet med antalet sarkomerer. Mät minst två ställen per cell. Utför analysen med kommersiell programvara eller offline med ImageJ.
OBS: Om behandling med uncoupling agenter, intakt avslappnad VM från mus hjärta visar en genomsnittlig sarcomere längd ~ 1,9 um 28.
- Använd följande kriterier för analys av hjärtcellintegritet:
- Kvantifiera morfologi och dimensioner av enskilda förmaks- och kammar myocyter från den överförda ljusmikroskop bilden. Tänk på att AM och VM-celler skiljer sig avsevärt i storlek. Mät cell längd, bredd och area, och beräkna den längd: bredd-förhållande.
- Analysera 2D celldimensioner från det ljus bild i ImageJ använda kommandona polygon markeringsverktyget och lägg till ROI chef, analog med figur 3. Om morfologisk cHanges förväntas inom specifika studiesammanhang, ytterligare dokument för alla celler den specifika mus-stam, ålder, kön, hjärtstorlek, och eventuella interventioner för efterföljande dataklassificering.
2 Färgning av Tats Membran i Living förmak och kammare Myocyter
- Ladda avbildning kammare (t.ex. POC-R2) med en 42 mm täckglas. För stabil myocyt fastsättning på täckglas, framställa 20 | il av laminin lösning av 1:10 utspädning av laminin lager i fysiologisk perfusionsbuffert (slutlig koncentration 0,2 mg / ml). Sprid 20 ul av laminin lösning jämnt på glastäckglas.
- Förbered 800 l av en 50 ^ M di-8-ANEPPS lösning i perfusionsbuffert. För detta, späd 20 pl 2 mM di-8-ANEPPS stamlösning i 780 pl fysiologisk buffert.
- För att färga VM, låt cellerna reglera genom gravitation under 8 minuter i en 1,5 ml reaktionsröret. För att färga ändringsförslagen, antingen använda gravitation sedimentering eller spi cellsuspensionen för 2 min (se 1.10.3). För både AMS och virtuella datorer, försiktigt bort supernatanten och samtidigt undvika onödig omrörning av cellpelleten och försiktigt resuspendera cellpelleten i 800 l av di-8-ANEPPS innehållande lösningen (50 M). Överför omedelbart den di-8-ANEPPS / myocyt fjädring på laminin-belagda täckglas i avbildningskammaren.
- Fläck VM suspension för 15 min vid RT i mörker.
- Långsamt tar bort överskottsvolym via uppåt vätske menisken vid sidorna av avbildning kammare med en manuell pipett. Bekräfta att majoriteten av di-8-ANEPPS färgade myocyter förblir stadigt fäst på laminin-belagda täckglas och inte blir utsatt för luft. Därefter tvättas den bifogade myocyt suspension en gång genom att långsamt tillsätta 1 ml perfusionsbuffert följt genom att ta bort överflödig vätska inklusive icke-vidhäftande celler.
- Noggrant överdraga de färgade och ytan bifogade myocyter med 1 ml perfusionsbuffert sakta från sidan av tHan avbildning kammare. Placera avbildning kammare på mikroskop scenen.
3 Imaging av TATS membranstrukturer i Living förmak och kammare Myocyter
- I allmänhet noggrant välja den bästa möjliga fluorescerande mikroskop alternativet (ar) tillgängliga för TATS membran avbildning. För konfokal avbildning, överväga senaste generationen, moderna fluorescensmikroskop med optimerade PMT array detektorer och fotonåtervinningsvägar som maximerar fluorescerande signalintensitet. För konfokal avbildning av mindre detaljer i TATS membranstrukturer använder en 63X 1,4 NA olja mål eller - beroende på tillgänglighet - använd en STED Superresolution mikroskop för minsta tats information som granskas för myocyt specifika ansökningar från Kohl et al 34 för allmänna principer för högt. upplösning fluorescensmikroskopi, se diskussionsavsnittet.
- Ställ bildparametrar för att identifiera de flesta, helst alla di-8-ANEPPS färgade intracellulära membran inuti en given myocyt bildplanet. Använd följande parametrar som utgångspunkt för konfokal laserscanningsmikroskopi: excitation 458 nm till exempel på 3% av den maximala lasereffekt; detektera den emitterade signalen mellan 550 nm och 740 nm; detektorvinst (t.ex. huvudkommandot 800); och hål 1 AU för en optisk skiva tjocklek på 900 nm. Justera dessa parametrar för att optimera signal-till-brus.
- Använd ljusa fältet läget att välja en intakt AM eller VM-cell som är lämpligt (figurerna 4A och 4B). Se punkt 1.12 för relevanta kriterier hur man döma cellintegritet att välja celler som sammanfattade: celltäckande regelbundna strimmor och lika sarcomere avstånd, skarpa yta kanter och tandningar på alla fyra cell sidor, kontinuerlig integritet laterala membranytan, och frånvaro av eventuella membran blebs.
- Ta en provbild av en central intracellulär myocyte sektion. För att justera ROI använda "gröda"-funktion →, Justera beskärningsfönstret → slutpixelstorlek mäter 100 nm x 100 nm. Justera x-axeln av grödan fönstret för att motsvara den stora (axial / längd) axeln i myocyt.
- Välj den slutliga bildplanet. Använd enskilda bildrutor för att välja lämpligt bildplanet manuellt i z-riktningen. Kontrollera att tats membran, inklusive T-tubuli och A-tubuli komponenter är synliga för blotta ögat i fokalplanet. Observera att en typisk intracellulär bildplanet kan innefatta en kärna som intracellulär referenspunkt. Se exemplen i figurerna 4A och 4B.
OBS: I allmänhet håller cell exponering för laserljus så kort som möjligt. Använd om möjligt enskilda bildrutor för att bestämma den optimala fokalplanet i hjärtmuskelceller. - Justera pixel uppehållstid till cirka 0,5 ps. Välj 16x medelvärdes och spela in bilden som stillbild. Upprepa bildögonblicks steget att fastställa lämpliga avbildningsplanet as beskrivs för tats membranstrukturer i 3,5 efter behov.
- Spara den slutliga bilden och kontrollera att filen sparades i mappen mål. Generellt spara alla bildfiler i samma format (t.ex. LSM) för en enhetlig tillämpning av analysprogram. Före varje bildanalys, återigen bekräfta tillräcklig cellintegritet off-line (beakta kriterier som anges i steg 1.12.1) och omfattar alla eventuella skadade celler från analys. Se exemplen i figurerna 4C och 4D.
4 Analys av TATS Membrane nätverket och dess komponenter
Följande bildbehandlingsstegen för direkt analys av tats membrankomponenter sammanfattas som top-down arbetsflödesdiagram i figurerna 5A och 5B.
- Öppna bildfilen i ett di-8-ANEPPS färgade myocyt i Fiji (http://fiji.sc/), ett fritt tillgänglig variant av ImageJ som innehåller analys plugins väsentliga förbildbehandling. För ytterligare information hänvisas till Schindelin m.fl. 29.
- Spara bilden → Arkiv → Spara som → Tif.
- Att analysera tats membrankomponenter väljer du rätt ROI exklusive utsidan membransignal, använd sedan "polygon val" verktyg för att avgränsa ROI gränsen exklusive utsidan membranet (sarcolemma) och med de intracellulära delarna av Tats membran som visas i Figur 5A (ROI). Lägg den valda ROI till "ROI Manager" genom att tillämpa Analysera → Verktyg → ROI Manager.
- För att välja ROI för orienteringsanalys av Tats komponenter, rikta huvudlängdcellaxeln och bild x-axeln parallellt. Om cellen är något böjd, markera flera ROI och anpassa varje ROI för sig. Uteslut alla kärnor från analysen. Uteslut alla alltför böjda celler från analysen eftersom exakt inriktning av ROis kommer att bli allt svårare och öka orienterings fel under analysen.
- Ta bort någon oönskad signal information från den yttre ytan membranet: Redigera → Töm Utanför att generera "valt ROI" (Figur 5A). Se till att den valda ROI innehåller endast de intracellulära membran delar, som motsvarar med TATS nätet.
- Utför följande kedja av bildbehandlingssteg (kommandon) före den efterföljande kvantitativ analys som dokumenterats i figur 5A.
- Klicka på → Process → Subtrahera bakgrund. Ställ rullande bollen radie till 5 pixlar.
OBS: Ställ den rullande bollen radie till 5 pixlar om den bild som skall analyseras har en pixelstorlek på 100 nm x 100 nm. För övriga storlekar pixel ställa den rullande bollen radie till antalet pixlar som ungefär motsvarar en fysisk radie på 500 nm. - Klicka på → Process → Förbättra Lokal Contrast (CLAHE). Ställ in blockstorlek till 49, de histogram korgar till 256, den maximala lutningen till 3, och masken på "none".
- Klicka på → Process → Smooth.
- Klicka på → Plugins → Segmente → Statistisk Region Sammanslagning. Ställ in parametrarna för Q100 → klicka på Visa medelvärden.
- Bekräfta fullständig behandling av den statistiska regionen fusionerande indikeras av automatisk presentation av en ny bildram och bekräfta att etiketten "SRM Q = 100" visas. Fortsätt så här med den här bildfilen. Klicka på → Bild → typ → 8-bit.
- Klicka på → Bild → Justera → Threshold. Välj tröskeln tillräckligt låg för att identifiera de flesta, helst alla tats strukturer, särskilt undvika uteslutning av Tats komponenter med låg signalstyrka (använd ett tröskelvärde på 40 som utgångspunkt). Konsultera "Representativa resultat" för detaljerade datautgång och exemplen i Figur 6(Övre tröskelvärdet på 255). Dokumentera det slutliga valet av tröskelparametrar. Observera att rätt val av tröskel bör ge endast specifika TATS membranstrukturer men inte falska positiva signaler på grund av bakgrundsljud.
- Bekräfta korrekt lagring av Tats bilddetaljer kontra extraherade skelett uppgifter, särskilt för mellanliggande och hög fluorescens signalnivåer, för att matcha den (displayen) kontinuitet skelettstrukturen. När en lämplig tröskel har identifierats, tillämpa samma tröskel för alla bilder under analys och upprepa jämförelsen överlagring av den ursprungliga signalen kontra skelett data för att konsekvent minimera denna potentiella källa till bias.
- Klicka på → Anmälan: bilddata blir binärt som visas i figur 5 under "Threshold".
- Klicka på → Plugins → Skeleton → Skeletonize (2D / 3D). Räddning skeletonized 2D-bild (såsom visas i fig 5) som Tif fil genomklicka på → Arkiv → Spara som → Tif. Analysera skeletonized bildfil för kvantitativ datautgång genom att klicka på → Plugins → Analysera Skeleton (2D / 3D). Välj Prune cykelmetod: ingen. Bekräfta automatisk generering av den resulterande datatabell.
- Spara automatiskt genererade datatabell som txt-fil. Markera relevanta kvantitativa parametrar, t.ex. det totala antalet förgreningspunkter eller den genomsnittliga grenlängd som visas i exempeluppgifter i Figur 7. Överväga ytterligare dataanalys med kompletterande / stödjande programverktyg som Excel och så lämpligt.
- Klicka på → Process → Subtrahera bakgrund. Ställ rullande bollen radie till 5 pixlar.
- Överväg att använda automatiserade bildbehandlingsrutiner när det är möjligt, inklusive alla nödvändiga åtgärder som beskrivs i 4.5 att harmonisera analys mellan enskilda bilder och / eller bildpartier. Använd exemplet Tilläggskodex fil som innehåller en bildbehandlings Macro programmerats för Fiji (justera programmeringen efter behov).
- Analysera idividuell orienteringar av alla eller välj TATS nätverkskomponenter från skeletonized bilddata från Fiji plugin "riktverkan". Generera en rikt histogram där respektive axiellt orienterade A-tubuli eller transversellt orienterade T-tubuli skall företrädas av de 0 ° eller 90 ° papperskorgar. Observera rätt referensbildorientering och att det är viktigt för x-axeln av bilden så att den motsvarar nära med de viktigaste (längsgående) 0 ° axel VM cellen som visas i figur 8 och Representativa resultat.
- Klicka på → Analysera → rikt → ange Metod: Fourier komponenter, Nbins 180, Histogram start -45 → klicka på Visa tabell.
- Spara den nyligen genererade och visas resultaten bord inklusive tillhörande histogramdata som txt-fil. Överväga ytterligare analys av data txt fil med gratis programverktyg som Excel och efter behov.
- För att generera underklasser avuppgifter grupperade datamängder, t.ex., för alla celler som behandlats på samma villkor (och eventuellt andra villkor), upprepa analysen steg från 4,1 till 4,7 för alla relevanta bilder som är lämpligt. Importera skeletonized dataparametrar från alla bilder till en kombinerad Excel-fil för att få fram genomsnittsvärden. Dessutom importera alla rikt histogramdata från samma grupperade dataset till en kombinerad Excel-fil för att beräkna och generera den genomsnittliga rikt histogrammet. Överväga ytterligare bearbetning av grupperade datamängder för att analysera ytterligare TATS nätverksparametrar av intresse för enskilda eller mellan olika behandlingsgrupper efter behov.
Representative Results
Dessutom analysen TATS membrannätet ett antal vanligen använda cellbiologiska tekniker som intracellulär Ca2 + imaging, patch-clamp elektrofysiologi, eller farmakologiska dosresponsstudier beror kritiskt på hög kvalitet primärcell isolering från förmaken eller kamrarna eller välj delar av hjärtvävnad för att möjliggöra karakterisering av mogna differentierade, strukturellt och fysiologiska intakta hjärtmyocyter. Därför isolering och kvalitetsbedömning för AM och VM-celler som beskrivs i avsnitt 1 är ytterst användbara för många olika frågor bland annat här beskrivna TATS nätverksanalys, vilket är kritiskt beroende intakt membran och cellintegritet.
Figur 1 ger en stegvis manual för bilderna hur man ska gå vidare med hjärtvävnaden dissektion börjar med förmakskamrarna i musen hjärta. Därefter är de ventrikulära kamrarna och septum förberett end dissekeras efter behov. Exakt urval och beredning av de korrekta vävnadsdelar är viktigt att tillförlitligt fastställa AM och VM isoleringar med tillräcklig cell renhet. Efter kollagenas matsmältningen kan det vara relativt svårt att identifiera rätt linjen dissektion mellan förmak och kammare vävnad, men när AM och VM-celler blandas okontrollerat i cellsuspension, är det omöjligt att vända den blandade cellpopulationen. Därför anatomisk orientering, 3D vävnads visualisering, tillräcklig erfarenhet av diger hantering vävnad, korrekt identifiering av specifika vävnadsdelar och deras dissektion linjer kommer alla bidra till framgång för cellisolering.
Figur 1.Dissection av atriell vävnad. (A) Ligger den främre delen av hjärtat, två kirurgiska sutures fixa proximala aorta till stubbe i slutet av en 21 G stålkanyl. (B) Utsikt mot hjärt grund visar återstående lungvävnad hindrar förmakskammar vyn under dissektion. LA, vänster förmak; RA, höger förmak. (C) Återstående lungtissue och stora fartyg togs bort för att komma åt förmakskamrarna. Fylld svart triangel, lungartären; tvärstrimmiga triangel, lungvenerna; fylld vit triangel, övre hålvenen; boxed triangel, lägre hålvenen. (D) För det första är den högra förmaksväggen dissekerade medan tången håller atriumbihanget. (E) Utsikt i höger förmakskammarutrymme. Den svarta triangeln markerar intakta interatriala septum. (F) Den dissekering fortsätter att komma in i vänster förmak kammarutrymme. (G) Efter fullständig dissekering av vänster och höger förmak, atrioventrikulärt ventilerna blir synliga. Fiberventilanordning dissekeras och kastas till subsequently skörda endast ventrikulär muskelvävnad. (H) Bakre vy över de isolerade vänster och höger förmak. LA, vänster förmak; RA, höger atrium.Scale barer: 700 ìm.
För att bestämma kvaliteten på cell isoleringar, Figur 2 ger typiska cell exempel under bedömning av avkastning och lönsamhet typiska stav eller tegel formad tvärstrimmiga intakta myocyter, både för AMS och VM. Lite skadad, visuellt diskret och allvarligt skadade celler med onormala alltför böjda morfologier, eller onormala sfäriska formade celler, kan lätt identifieras med trypanblåttuteslutning som beskrivs i avsnitt 1.11. Medan intakta myocyter förblir ljusa och homogent tvärstrimmig när de utsätts för extracellulärt trypanblått, skadade celler visar vanligtvis flera membran blebs och / eller snabbt ackumuleras trypanblått intracellulärt indikerar membranskador. Däremot kan trypanblått i sig skadar celler genom unnecessarily lång inkubation och omedelbar bedömning cellernas kvalitet är därför obligatoriskt. Exempel på mer uppenbara former av cellskador som myofilament kontraktur eller grov ytskador kompromissa cellernas integritet visas i figurerna 4C och 4D. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. trypanblåexklusion cellfärgning. Isolerade (A) AM och (B) VM cellerna blandas i suspension med trypanblått och visualiserades genom ett inverterat ljusmikroskop visas vid 40Xmagnification. Notera thatabnormal sfäriska celler i (A) och (B) tar upp trypanblått som indicatesmembrane leakaGE och strukturell skada. I motsats härtill centralAM och VM-celler med intakta membran utesluta trypanblått som visas. Vidare noterar att intakta AM och VM-celler visar sarcomere strimmor hela deras cellvolym, nomembrane blebs och skarpa kanter vid de båda sido sidorna och båda inskjutna skivor. Skalstrecken: 20 | im.
Efter framgångsrika isolering, cellutbyten av virtuella maskiner mellan 5 x 10 Maj - 10 Juni kan förväntas från en enda mus hjärta matsmältningen. Utbytet av ändringsförslagen är betydligt lägre i storleksordningen 3 x 03-03 Oktober x 10 4 stavformade, trypanblått exklusive celler. Till skillnad från VM, AM isoleringar ibland misslyckas även i erfarna händer. Steg 1.11 sammanfattar rutiner hur man kan uppskatta avkastningen av isolerade friska celler i suspension. Dessutom bestämmer de genomsnittliga celldimensioner genom steg 1,13 enligt figur 3 för individuell AM eller VM cell isolat eller jämföra AM kontra VM cellpopulationer sida vid sida (vid behov). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3.Bright fält morfometrisk analys av hjärtmuskelceller. VM konturen upptäcktes av bild analysverktyg som beskrivs under steg 1.13. Använd polygon markeringsverktyget att visuellt varumärke och definiera cellen cellulära gränsen definieras av den yttre ytan membranet för analys. Annons den valda regionen av intresse (ROI) till ROI chefen följt av 1D avståndsmätningar. För jämförande studier av AM vs VM dimensioner, är det bra att dokumentera cell längd, bredd, och området, och för att beräkna längd: bredd.
Figur 4.Live membranfärgning av intakt förmak och kammare myocyter. Motsvarande genomlysning och konfokala bilder levnads di-8-ANEPPS färgade intakt (A) AM och (B) VM-celler. I motsats härtill är en delvis contracted och potentiellt skadas AM med en sarcomere längd 1,2 | im som visas i (C). Kontrakte myocyter vanligtvis visar onormalt förkortas och distade tats strukturer, utesluts därmed från vidare analys. En annan viktig indikator för cellmembrandefekter är membran blebs (röda trianglar) som visas i ett VM i (D). Membran blebs representerar skadade ytan membranstrukturer och celler med blåsor bör uteslutas från vidare TATS analys. Vidare visar VM brutto skador tydligen saknade en hel del av dess nedre vänstra del (markerad med asterisk). Sammanfattningsvis genom att jämföra genomlysning och konfokala bilder, celler morfologi och yta intactness dokumenteras och kombineras med fluorescerande signalinformation. 'N' märken nuCLEI utelämnas från analysen av TATS membran fläcken. Gula staplar indikerar förstorade ROI från samma konfokala bilden som presenteras ovan. Skala barer:. 10 mikrometer klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Konfokala bilder av tats membran med ett tillräckligt signal-till-brus-förhållande, såsom visas i figurerna 4A och 4B är accepterade för ytterligare kvantitativ analys. Den TATS membran analys bygger på skeletonized data från de fluorescerande rätlinjiga signalkomponenter. Figur 5 visar arbetsflödet schema över de enskilda bildbehandlingssteg som beskrivs i detalj av steg från 4,3 till 4,5. Dessa steg producera skeletonized bilder som representerar rätlinjiga TATS membran nätverk såsom visas för varje isolerad VM (figur 5A) och AM-celler (Figur 5B).
Figur 5.Workflow för skeletonization av fluorescerande tats bilder. Image bearbetningssteg som leder till en skeletonized bild av TATS nätverket representeras av individuella steg-för-steg-bild exempel både för en di-8-ANEPPS färgades VM (A) och AM (B). För enskild bildbehandlingssteg, se avsnitt 4. Notera skillnaderna i skala barer:. 20 um (A) och 10 um (B) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Ett kritiskt steg under bildbehandling, bestämma lämplig tröskel för data binärisering som beskrivs i avsnitt 4.5.6. Den resulterande binära bilden bör omfatta enda sanna membransignaler från TATS nätet men inte falska strukturer som person med felaktiga tröskel från bakgrundssignalbruset. Ändå är det viktigt att tröskeln är låg nog för att upptäcka alla sanna tats strukturer så att riktiga tats komponenter som inte felaktigt förloras under bildanalys. Figur 6 illustrerar processen hur man väljer tröskeln under data binärisering. Medan en tröskel på 40 som visas i figurerna 6B och 6C förefaller lämpligt att upptäcka alla sanna tats strukturer för sig, välja en högre tröskel till exempel på 60 som visas i figur 6A hittar inte svagare axiella membranstrukturer (ATS) som indikeras av gula trianglar . Däremot väljer en lägre tröskel till exempel på 20 som visas i figur 6D leder till felaktig detektering av bakgrundsljud som falskt positiva tats strukturer som indikeras avgula trianglar.
Figur 6.How att bestämma signaltröskeln under skeletonizing av Tats bilddata. Exemplen visar tats skelett vardera fram för olika tröskelvärden under uppgifter binärisering (som beskrivs i steg 4,5). Övre bilder visar tröskeljusteringar med hjälp av Fiji. Lägre bilder lagring av skeletonized bilder med motsvarande ingångs fluorescens bild och förstorade regioner enligt markeringen. En hög tröskel t.ex. 60 tillämpas i (A) är uppenbarligen inte lämpligt att upptäcka alla sanna tats strukturer såsom anges av gula trianglar i den förstorade delen. En tröskel på 40 tillämpas (B) och (C) känner alla tats strukturer och korrekt detekterar inte bakgrundsljud, medan en låg tröskel, t.ex.., 20 i (D) felaktigt identifierar bakgrundsljud som tats strukturer och därmed ger falskt positiva signaler om icke-existerande membranstrukturer. Falskt positiva signaler indikeras med gula trianglar i den förstorade infällda. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den "Analysera Skeleton (2D / 3D)" plugin stöder detaljerad analys av skeletonized tats strukturer. När avrättades, plugin ger en datatabell med följande skelett parametrar: #branches, #junctions, # end-point voxlar, genomsnittliga grenlängd, #triple poäng, #quadruple poäng, och maximal grenlängd. För en detaljerad beskrivning av alla tänkbara utgångsparametrar finns påhttp: //fiji.sc/wiki/index.php/AnalyzeSkeleton och relaterade artiklar 29-31. En typisk datatabell utsignal visas i figur 7A.
Total skelett längd per ROI:
Σ (#branches x genomsnittliga grenlängd) = 5155 px = 515,5 um
Den totala längden på skelettet kan vara normaliserade till bildområdet. För den i fig 7 den normaliserade skelett längd 0.64μm exempel / um 2 och summan av alla korsningar beräknas enligt nedan:
Normaliserad skelett längd:
515,5 pm / 803,6 um 2 = 0,64 pm / xm 2
Normaliserad antal korsningar:
155 korsningar / 803,6 nm 2 2
Figur 7.Automated datautmatning från skeletonized bilder. (A) En typisk uppgifter kalkylblad genereras av "Analyze Skeleton (2D / 3D)" plugin från skeletonized bilden visas i (B). För en detaljerad beskrivning av möjliga utgångsparametrar se http://fiji.sc/wiki/index.php/AnalyzeSkeleton . Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bildbehandlingssteg som beskrivs i 4.5 och som visas i figur 5 kan automatiseras med hjälp av en Fiji makro anges som kompletterande Code fil 4.3 och 4.4. Makrot kan vara fördelaktigt för analys av kompletta databas grupper, till exempel genom att utarbeta individuella ingångsbildstaplar för varje oberoende behandlingsgrupp för automatiserad analys med hjälp av makrokommandon.
Den skisserade programvaran strategi möjliggör ytterligare orienteringsanalys TATS nätverk för alla komponenter. För detta använder du "rikt" plugin (http://fiji.sc/Directionality) 29,31 som producerar histogramdata visar orienteringen distribution av alla TATS komponent inriktningar. Om x-axeln för den inmatade bilden motsvarar huvudaxel en given AM eller VM-cell, den axiella (longitudinella) tats komponenter kommer att representeras av 0 ° bin, medan de tvärgående komponenter kommer att representeras av 90 &# 176; bin. Figur 8 visar exemplariskt rikt histogram från skeletonized tats bilder för en VM (8A) kontra en AM (8B) cell. Medan riktnings histogram över en typisk VM visar en dubbeltopp-fördelningen vid 0 ° och 90 °, visar AM histogrammet en enda dominerande topp vid 0 °. Dessa exempel är i överensstämmelse med tidigare observationer att enskilda tats komponenter i VM nästan jämnt fördelade mellan T-tubuli och A-tubuli, medan tats komponenterna i AMS kan huvudsakligen bestå av A-tubuli.
Figur 8.Representative rikt histogram från tats nätverk av enskilda celler. Riktnings histogram genererades från skeletonized bilder av enskilda VM (A) jämfört med AM (B Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Perfusion buffert | mM |
| NaCl | 120,4 |
| KCl | 14,7 |
| KH 2 PO 4 | 0,6 |
| Na 2 HPO 4 | 0,6 |
| MgSO 4 | 1,2 |
| HEPES | 10 |
| NaHCOs 3 | 4,6 |
| Taurin | 30 |
| 2,3-butandion-monoxim | 10 |
| Glukos | 5,5 |
| pH 7,4 | |
| Digestion buffert | mM (om det inte anges) |
| NaCl | 120,4 |
| KCl | 14,7 |
| KH 2 PO 4 | 0,6 |
| Na 2 HPO 4 | 0,6 |
| MgSO 4 | 1,2 |
| HEPES | 10 |
| NaHCOs 3 | 4,6 |
| Taurin | 30 |
| 2,3-butandion-monoxim | 10 |
| Glukos | 5,5 |
| Kollagenas typ II | 600 U / ml |
| pH 7,4 | |
| Stop-buffert | mM (om det inte anges) |
| NaCl | 120,4 |
| KCl | 14,7 |
| KH 2 PO 4 | 0,6 |
| Na 2 HPO 4 | 0,6 |
| MgSO 4 | 1,2 |
| HEPES | 10 |
| NaHCOs 3 | 4,6 |
| Taurin | 30 |
| 2,3-butandion-monoxim | 10 |
| Glukos | 5,5 |
| CaCl2 | 0,0125 |
| bovint kalvserum | 10% |
| pH 7,4 | |
Tabell 1.Buffer solutjoner. Innehållet i tre olika fysiologiska buffertlösningar för cellisolering och bildhantering sammanfattas.
Discussion
Även hjärtmuskelceller har isolerats och studerats i årtionden 32, ingått ett senaste omdömet att konsekventa högkvalitativa myocyt cell isoleringar fortsatt utmanande 27. Detta återspeglar relativt komplexa protokoll för isolering av primära hjärtmyocyter gentemot en brist på gemensamma standardmetoder, delade metadata, och öppen cellkvalitetsdokumentation. Cellisoleringsprotokoll brukar anpassas av enskilda grupper, ge olika utfall i cell isolat, är beroende av enskilda modellinställningar (t.ex. arter, ålder, samexisterar hjärtsjukdomar), och är vanligtvis justerat för särskilda experimentella förhållanden. Inom ramen för den kvantitativa TATS membranstudier och protokoll som presenteras här, en viktig kvalitetsnivå vid bedömning och dokumentation gäller konfokala eller Superresolution mikroskopi av enskilda cellmembranstrukturer utsatta för metabola och isolering protokollberoende förändringar, bådei AM eller VM. Viktigt är även om höga utbyten av cell isolat tyder friska intakta myocyter, utredare behöver dokumentera och kritiskt bedöma varje enskild cell försiktigt mot morfologiska kriterier för yta och TATS membranintegritet kontra icke-specifik skada på grund av isoleringsförfaranden kontra specifika förändringar på grund av olika typer av interventioner jämfört med kontrollförhållanden. En viktig variabel under hjärtcellisolering är den specifika aktiviteten hos en given kollagenas mycket. För att välja en ny massa kollagenas, bör den enzymatiska aktiviteten av flera kollagenas proverna testas mot varandra genom att utvärdera hjärt myocyte avkastning och kvalitet, och enligt tillverkarens anvisningar. Idealt är en ny mycket kollagenas identifieras med kollagenas aktivitet liknande tidigare framgångsrikt använts partier (för utökad utvärdering av möjliga enzymaktiviteter finns i "kollagenas mycket markeringsverktyg" i tabellen material och metoder). TAken tillsammans, kvantitativa metoder för TATS membran visualisering beror kritiskt på cellisolering kvalitet och vice versa, hjärtcell isoleringar som leder till ospecifik membranskada som dokumenterats av TATS mikroskopi bör utlösa kritisk granskning och korrigering av isoleringsförfaranden. Eftersom cellisolering kvalitet och TATS membran visualisering och kvantifiering är nära förbundna, de protokoll som diskuteras i denna artikel omfattar alla viktiga aspekter som en kontinuerlig strategi.
Ytterligare en utmaning och vanligt problem av hjärtstudier, cellskada och / eller cellförlust uppstå på grund av metaboliskt komprometterande interventioner t.ex. efter hjärtinfarkt 9, men måste bedömas mot potentiell oavsiktlig skada t.ex. efter obemärkt luftemboli under cellisolering. Isolering av hjärtmuskelceller från sjuka hjärtan kan leda till ytterligare, betydande cellförlust och minskad cellutbyten. Därför comparIson av det totala antalet isolerade intakta celler mellan kontroll och sjuka hjärtan kan vara meningsfullt om cellisolering och räkning tillämpas konsekvent genom standardiserade protokoll. Därför är det viktigt att bedöma cellintegritet genom en lämplig kontrollgrupp, vilket återspeglar den bästa möjliga myocyt cellisolering kvalitet. Viktigt enskilda cellernas kvalitet och levande cell mikroskopi av friska kontra sjuka kontra myocyter oavsiktligt skadas av isoleringsförfarandet kan avsevärt påverka analysen av Tats membrannätverk. De protokoll som presenteras här betonar därför integriteten och stabiliteten i fysiologiska membrankomponenter under cellisolering och levande cell mikroskopi av oskadade hinnor. Hela arbetsflödet är utformad som en kontinuerlig strategi för att uppnå och bevara intakt TATS membrankomponenter medan exklusive skadade celler, eftersom dessa kommer att ställa ut isolering beroende membran artefakter som störda membran tubuli, membrane blebs och förändrade tats nät felaktigt enligt kontrollförhållanden och äventyra ytterligare kvantitativ analys. Vice versa, samma strategier är avgörande för interventionsstudier med potential att störa miljöer membran, som beror kritiskt på meningsfulla jämförelser kontroller mellan sant friska kontra sant sjuka cellen med tats membranförändringar.
Dessutom har vi itu med förfaranden för att uppnå den tekniskt mycket mer utmanande isolering av AM-celler. Trots framsteg och förbättrade protokoll, är det viktigt att betona att det inte är trivialt att återge högkvalitativa cell isoleringar av virtuella maskiner och ännu mindre tillförlitlig för ändringsförslagen. Detta beror på att den totala lägre utbyte av AM-celler, där till och med små fel eller variationer under cellisolering kan leda till fullständigt misslyckande av AM cellisolering, medan en mild grad av VM cellskada kan vara mindre uppenbar i cellsuspensionen på grund av relativt hög cell siffror jämfört med AM. Eftersom AM celler kan bli curved efter isolering, kan analyser genom flera ROI vara fördelaktigt som det beskrivs i steg 4.3. Efter ett detaljerat förfarande för cellisoleringssteg, ger vi ett protokoll för direkt integrerad membranfärgning och konfokala eller STED Superresolution avbildning av Tats nät för både virtuella och äf. Dessa protokoll möjliggör både kvantitativ analys och differentiering av utvalda komponenter i Tats membran genom tidigare fastställda parametrar. Jämfört med virtuella datorer, 3D-organisation och funktionella beteenden förmaks TATS nätet i AMS för närvarande mindre förstås.
Procedurerna till bildtatueringar membran i levande celler (steg från 3,1 till 3,7) utvecklades med kommersiella konfokala (Table of Materials / utrustning) och skräddarsydda sted fluorescensmikroskop 9. För att optimera mikroskop inställningarna för fluorescerande bildgenerering och kvantitativ TATS analys, följande punkter är av allmän betydelse:
- Syfte För att lösa små detaljer i Tats membranstrukturer, empiriskt testa vilken målsättning ger högsta bildkvalitet samtidigt som fokus flera mikrometer djupa i cellen. Vissa konfokala mikroskop kan prestera bättre med vatten eller glycerol mål, i motsats till 63X 1,4 NA olja mål används här. Mål med 100 gångers förstoring används för Superresolution STED mikroskopi, handel utanför ett mindre synfält för nanometrisk upplösning 34.
- Excitation och Gain
De optimala inställningarna för excitation makt och detektor förstärkning beror på mikroskopljusets bana, laserprestanda och exempel egenskaper. Helst är lasereffekt och förstärkningen justeras för att utnyttja hela skalan av detektorn, men undvik bild mättnad. Kommersiella mikroskopi programpaket vanligtvis åstadkomma uppslagstabeller som visualiserar den nedre och övre gränsen för det dynamiska området. Vidare för att minimera färgblekning använder lägsta möjliga lAser makt som fortfarande ger tillräckliga strukturella TATS membran detaljer. Dessutom bör excitation makt vara tillräckligt låg för att undvika kumulativa fotoskador som leder till myocyt kontrakturer och död. - Pixelstorlek
Använd en pixelstorlek kompatibel med Nyquist provtagning, ungefär halva upplösningen uppnås med de givna inställningarna. För konfokala imaging en pixelstorlek på 100 nm x 100 nm är kompatibel, vilket också kommer att begränsa blekning. För Superresolution mikroskopi betydligt mindre storlekar pixel används t.ex. 20 nm x 20 nm för STED mikroskopi 9. - Dwell Time
Konfokala mikroskop tillhandahålla en medelvärdesfunktion. I allmänhet använder kortast möjliga pixel uppehållstid för att undvika blekning i kombination med signalmedelvärdes t.ex. linje genomsnitt ≥ 8 för att förbättra signal-brus-förhållande. - Dokumentera Mikroskopi inställningar tillämpas genom Meta-uppgifter
När inställningarna hur manbilduppgifter Tats membranstrukturer optimerades på en viss konfokalmikroskop, säkra och / eller dokumentera inställningarna (protokoll meta-data). Förvärva alla bilder i en (eller mellan) grupp (er) av celler med samma syfte, excitation makt, förstärkning, pixelstorlek, bildpunkt uppehållstid, och medelvärdesfunktion. Lika avbildningsbetingelser medge direkt jämförelse och kvantifiering inom ett (eller mellan) grupp (er) av celler. - För allmän vägledning och mer information om principer och tillämpningar av konfokalmikroskopi hänvisas till handboken för biologisk konfokalmikroskopi (Pawley JB, 3rd Edition, 2006, Springer Science + Business Media, LLC).
Till skillnad från de direkta strategierna analys som presenteras här, tidigare publikationer som beskriver tats membran och sjukdomsrelaterade förändringar, har använt regionala aggregerade avläsning av T-tubuli täthet som kvantitativ strategi 16,17 eller indirekta regionala strategier baserade på Fourier transfFörnyelsen analys av tvärstrimmiga membransignaler för att bedöma T-tubuli komponentregel 7. Däremot är de kvantitativa metoder som beskrivs här direkt relaterade till enskilda tats komponenter och ger ett antal ytterligare parametrar, bland annat fastigheter membran nätverk och specifika komponenter som andelen A-tubuli. Vidare kan TATS nätdensitet kvantifieras som den normaliserade längden på hela extraherade skelettet per ROI området. Antalet trippel korsningar av tre enskilda kan kontinuerligt anslutna tubuli komponenter användas som ett mått på förgrenings komplexitet TATS membrannätverk. Vi noterar att varje analys av minsta tats komponenter beror på färgningsförfaranden. Enligt vår erfarenhet, 800 | il av en 50 | iM di-8-ANEPPS lösning är tillräcklig för att färga kompletta tats nätverk i en cellpellet innehållande 50.000 VM celler 9. Men om cellpelleten innehåller ett lägre antal hjärtmyocyterOm kraftfulla fluorescensdetektorer finns tillgängliga, och om konfokal avbildning av den totala fördelningen TATS nätverket än minsta membran detaljer och kvantitativa förändringar är av intresse, lägre färgämneskoncentrationer kan användas utifrån empiriska tester. Slutligen kan en programvara makro skriven för den beskrivna analysen användas för att automatisera bildbehandlings åtgärder för att underlätta analys av större datamängder, vilket är särskilt användbart för jämförelse mellan olika behandlingsgrupper (t.ex. läkemedel), celltyper (t.ex. AM kontra VM ), och patofysiologiska insatser (t.ex. bluff kontra hjärtinfarkt).
För bildanalys av Tats nätverk, är följande sekvens av principi steg tillämpas: 1) rullande boll bakgrund-subtraktion (4.5.1) för att avlägsna rumsliga variationer i bakgrunden intensitet; 2) lokal kontrastförbättring (4.5.2). 3) bildutjämning (4.5.3); 4) statistisk region sammanslagning (4.5.4); 5) som definierartröskel Bildens binärisering (4.5.6); och 6) beräkning av de skelett uppgifter (4.5.8). Ett kritiskt steg under skeletonization av fluorescerande tats bilder är bild binärisering visas i figur 6. Intressetröskelsteg slutligen definiera vilka sanna membranstrukturer upptäcks att representera de underliggande tats komponenter kontra potentiellt falska strukturer identifierats av misstag från bakgrundsljud. Identifiering av rätt tröskeln för binär bildanalys bör motsvara de verkliga TATS membranstrukturer, vilket beror på en tillräckligt hög signal-till-brus (SNR) förhållandet var för konfokala och Superresolution mikroskopi metoder. Därför bör en tillräcklig bildkvalitet etableras först och därefter kombineras med kritisk bedömning av enskilda cellernas kvalitet inklusive dokumentation av ljusa fält bilder som beskrivs. Alternativa möjligheter att anpassa bildsegmente protokoll för en given objektdatautgång och / eller fysiological frågor är bild deconvolution och andra tröskel förfaranden som "Otsu" eller "Iso-data" finns som ImageJ plugins. Oavsett den slutliga segmenteförfarandet anser vi jämförelsen mellan extraherade och rådata från bildöver ett obligatoriskt kvalitetskontroll steg. Sammanfattningsvis kommer morfologiska och membranintegritet enskilda isolerade myocyter, tillräcklig färgning av intracellulära tats membran, parameteroptimering för fluorescens avbildning, och overlay kontroll av extraherade skelett uppgifter bidrar till kvaliteten på fluorescerande tats bilder och kvantitativa resultat.
Om större arter än mus används för cellisolering, kan protokollen lätt anpassas på lämpligt sätt. För de kommande större arter kan råtthjärtan att kanyl med en trubbig 14 G kanyl (ytterdiameter 2,1 mm) och perfusion vid 8 ml / min. Betydligt äldre eller sjuka hjärtan kan kräva ännu större kanylstorlekar. I-genenral, kan hjärt perfusion utföras antingen genom konstant tryck t ex med hjälp av en 1 meter hög vattenpelare mellan reservoar och aorta eller med konstant flöde med hjälp av en peristaltisk pump. För cellisolering från små gnagar hjärtan som möss och råttor konstant flöde kan vara fördelaktigt eftersom kollagenasdigestion småningom kommer att störa koronara resistenskärlen som leder till överdrivna perfusion natt från läckande kärl bäddar som kommer att kontrolleras i viss utsträckning av konstanta flödesprotokoll. Däremot är konstant tryck perfusion fördel om övervakning av flödet och korrekt kanyle är en prioritet, vilket är fördelaktigt för interventionsmodeller med förändrad blodkärlet motståndsbeteenden samt för utbildning av cellisoleringsförfaranden.
Som beskrivits ovan, är mycket viktigt för kvantitativa studier av endogena membransystem tillräckligt cellernas kvalitet. Under hjärt perfusion och kollagenasdigestion flertal faktorer kan spitically påverka kvaliteten på cellisolering, som aldrig bör underskattas vid protokolloptimering eller felsökning 27. I synnerhet bör aktiviteten av en viss kollagenas mycket bestämmas för den specifika vävnaden av intresse t.ex. förmaken eller kamrarna före verkställandet av de experimentella god tro studier för att fastställa isoleringskrav som skall bibehållas under resten av studien. Dessutom kommer vattenkvalitet, pH, temperatur, optimering och rengöring av perfusion installationen minimera risken för oavsiktlig skada från föroreningar och emboli, och potentiellt ytterligare faktorer måste övervakas för att fastställa optimala homeostatiska förhållanden under cellisolering. BDM (2,3-butandion-monoxim) en reversibel hämmare av myosin ATPas tvärbryggor används vanligen vid vävnads dissekering och matsmältning att upprätthålla hjärtmuskelavslappning, vilket ökar utbytet av cell isoleringar. Ändå utredare behöver to vara medveten om att BDM kan utöva ospecifika fosfatas verksamhet som leder till off-target effekter, t.ex., hämning av Na + / Ca2 + valutaströmmar under vissa villkor 33. För vissa experiment kan det vara fördelaktigt att ersätta BDM genom blebbistatin som kardioplegisk lösning, en hämmare med hög affinitet för myosin vid mikromolära koncentrationer, som är emellertid toxiska och relativt dyra och kan ha andra ej åsyftade effekter. Vilande friska hjärtmuskelceller skall inte förete några sammandragningar i frånvaro av elektrisk stimulering och sådana celler bör undantas från vidare analys. Å andra sidan, hjärt myocyte kontraktion och avslappning som svar på elektrisk stimulering vid fysiologiska extracellulära Ca2 + koncentrationer kan användas för att fastställa normal kontraktila beteende som en ytterligare åtgärd för att bedöma funktionella cellernas kvalitet och / eller onormalt beteende i hjärtsjukdom kontra frisk kontroll celler.
9 och AM celler 21 samt för kvantitativ analys av mikrotubuli nätverk fasta hjärtmyocyter (data visas ej). Dessa och framtida tillämpningar av protokollen kan öppna vägar för en mängd olika experimentella frågor som karakterisering av Tats membran i olika utvecklingsstadier eller analys av membranassocierade proteiner eller organell strukturer som kontaktar TATS nätverk för att utöva mycket lokal, domänspecifik signalering funktionerna i AM och VM-celler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and Enzymes | |||
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | B0753 | |
| Bovine calf serum | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | SH30073 | Triple 0.1 µm sterile filtered. |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | 21115 | Diluted 1:10 in MQ water to obtain 100 mM CaCl2 stock concentration. |
| Collagenase type II | Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Germany | on request | Enzymatic activity depends on individual collagenase batches. Collagenase II and other enzyme activities (Caseinase, Clostripain, Tryptic) can be assessed in the "collagenase lot selection tool". Determine cell yield and quality individually for each new lot of collagenase. |
| Glucose | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HN06.1 | |
| Heparin | Rotexmedica, Trittau, Germany | PZN-03862340 | Diluted in 0.9% NaCl and injected subcutaneuosly in abdominal skin. |
| HEPES | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 9105.4 | |
| Forene 100% (V/V) | Abbott, Libertyville, IL, USA | B506 | Active agent: isoflurane, 250 ml. Use approximately 2 Vol% in air/oxygen dispenser instrument. |
| KCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6781.3 | |
| KH2PO4 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3904.2 | |
| Laminin (2 mg/ml) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 354232 | Lamination is described under step 2.1. |
| MgCl2·6H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2189.2 | |
| MgSO4·7H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8283.2 | |
| Na2HPO4·2H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4984.2 | |
| NaHCO3 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HN01.1 | |
| Taurin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4721.2 | |
| Dyes | |||
| Di-8-ANEPPS | Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Germany | D-3167 | Stock solution 2 mM in DMSO |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | T8154 | Trypan blue is gently mixed 1:1 via tip-cut 1 ml plastic pipette with cell suspension prior to cell counting in Neubauer cytometer. |
| Langendorff Perfusion Setup | |||
| Circulation thermostat | Lauda, Lauda-Königshofen, Germany | Please refer to Louch et al. (JMCC 2011). Heat up thermostat und buffers in perfusion tubing to 37 °C 15 min prior to use. | |
| Flexible silicone tubing Tygon for peristaltic pump | VWR, Darmstadt, Germany | 224-2252 | Tubing needs to be changed regularly. |
| Flexible silicone tubing Tygon for thermostat | VWR, Darmstadt, Germany | 228-4340 | |
| Heating coil surroundung perfusion tubing | Rettberg, Göttingen, Germany | custom-made | Heating coil and tubing needs to be cleaned thoroughly via MQ water after using. Do not use detergents. Glass components should be bathed regularly in 10 mM NaOH overnight. |
| Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim, Germany | ISM830 | |
| Three way stop cock Discofix C Luer Lock 10 cm | Braun, Melsungen, Switzerland | 16500C | |
| Three way stop cock Discofix 3SC | Braun, Melsungen, Switzerland | 4095146 | |
| Instruments | |||
| 42 mm glass coverslips | Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany | on request | 0.13-0.16 mm thickness |
| Cannula 21 G | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA | 304432 | Cut to a length of ~5 mm, roughened with sandpaper. |
| Coverslips for Neubauer cytometer 24 x 24 mm | Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany | on request | 0.38-0.42 mm thickness |
| Graefe forceps, 0.5 mm tips, slight curve | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11151-10 | |
| LSM 710 NLO | Carl Zeiss, Jena, Germany | 63X 1.4 NA oil objective | |
| Neubauer improved cytometer | Labor Optik, Friedrichsdorf, Germany | 1100000 | Counting procedure: Wipe cytometer and coverslip provided with the counting chamber with 70 % ethanol. Press coverslip gently on the counting chamber so that the two glass surfaces are in contact and Newton's rings can be observed. Subsequently, 10-20 µl cell suspension can be applied to the edge of the coverslip to be sucked into the void by capillary action. Count the intact vs. defect myocytes using the squares of the cytometer grid which reflects 100 nl. Repeat counting procedure on the second grid provided on the cytometer. Calculate the density of cells in your original cell suspension by taking account of any dilutions and counting shortcuts. |
| POC-R2 Imaging Chamber | Pecon, Erbach, Germany | Cell suspension volume: 800 µl; desired plating density: ~1,000 AM and ~10,000 VM | |
| Spring scissors, 8 mm blades straight, blunt | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15025-10 | |
| Student dumont #7 forceps, inox | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91197-00 | |
| Student iris scissors, curved, 11.5 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91461-11 | |
| Student iris scissors, straight, 11.5 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91460-11 | |
| Student surcigal scissors, straight, sharp, 12 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91402-12 | |
| Tissue forceps, 1 x 2 teeth, slim, 10 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11023-10 | |
References
- Prosser, B. L., Ward, C. W., Lederer, W. J. Subcellular Ca2+ signaling in the heart the role of ryanodine receptor sensitivity. J Gen Physiol. 136 (2), 135-142 (2010).
- Wehrens, X. H., Lehnart, S. E., Marks, A. R. Intracellular calcium release and cardiac disease. Annu Rev Physiol. 67, 69-98 (2005).
- Cheng, H., Cannell, M. B., Lederer, W. J. Propagation of excitation-contraction coupling into ventricular myocytes. Pflugers Arch. 428 (3-4), 415-417 (1994).
- Williams, G. S., Chikando, A. C., Tuan, H. T., Sobie, E. A., Lederer, W. J., Jafri, M. S. Dynamics of calcium sparks and calcium leak in the heart. Biophys J. 101 (6), 1287-1296 (2011).
- Sperelakis, N., Rubio, R. orderly lattice of axial tubules which interconnect adjacent transverse tubules in guinea-pig ventricular myocardium. J Mol Cell Cardiol. 2 (3), 211-220 (1971).
- Soeller, C., Cannell, M. B. of the transverse tubular system in living cardiac rat myocytes by 2-photon microscopy and digital image-processing techniques. Circ Res. 84 (3), 266-275 (1999).
- Song, L. S., et al. et al. ryanodine receptors in the failing heart. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (11), 4305-4310 (2006).
- Oort, R. J., et al. Disrupted junctional membrane complexes and hyperactive ryanodine receptors after acute junctophilin knockdown in mice. Circulation. 123 (9), 979-988 (2011).
- Wagner, E., et al. Stimulated emission depletion live-cell super-resolution imaging shows proliferative remodeling of T-tubule membrane structures after myocardial infarction. Circ Res. 111 (4), 402-414 (2012).
- Asghari, P., Schulson, M., Scriven, D. R., Martens, G., Moore, E. D. Axial tubules of rat ventricular myocytes form multiple junctions with the sarcoplasmic reticulum. Biophys J. 96 (11), 4651-4660 (2009).
- Lukyanenko, V., Ziman, A., Lukyanenko, A., Salnikov, V., Lederer, W. J. Functional groups of ryanodine receptors in rat ventricular cells. J Physiol. 583 (Pt 1), 251-269 (2007).
- Shacklock, P. S., Wier, W. G., Balke, C. W. Local Ca2+ transients (Ca2+ sparks) originate at transverse tubules in rat heart cells. J Physiol. 487 (Pt 3), 601-608 (1995).
- Reynolds, J. O., et al. Junctophilin-2 is necessary for T-tubule maturation during mouse heart development. Cardiovasc Res. 100 (1), 44-53 (2013).
- Di Maio, A., Karko, K., Snopko, R. M., Mejia-Alvarez, R., Franzini-Armstrong, C. T-tubule formation in cardiac myocytes two possible mechanisms. J Muscle Res Cell Motil. 28 (4-5), 231-241 (2007).
- He, J., et al. Reduction in density of transverse tubules and L-type Ca(2+) channels in canine tachycardia-induced heart failure. Cardiovasc Res. 49 (2), 298-307 (2001).
- Heinzel, F. R., et al. Remodeling of T-tubules and reduced synchrony of Ca2+ release in myocytes from chronically ischemic myocardium. Circ Res. 102 (3), 338-346 (2008).
- Lyon, A. R., et al. Loss of T-tubules and other changes to surface topography in ventricular myocytes from failing human and rat heart. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6854-6859 (2009).
- Crossman, D. J., Ruygrok, P. N., Soeller, C., Cannell, M. B. Changes in the organization of excitation-contraction coupling structures in failing human heart. PLoS One. 6 (3), e17901 (2011).
- Kemi, O. J., et al. The effect of exercise training on transverse tubules in normal, remodeled, and reverse remodeled hearts. J Cell Physiol. 226 (9), 2235-2243 (2011).
- Sachse, F. B., et al. Subcellular structures and function of myocytes impaired during heart failure are restored by cardiac resynchronization therapy. Circ Res. 110 (4), 588-597 (2012).
- Arakel, E. C., et al. Tuning the electrical properties of the heart by differential trafficking of KATP ion channel complexes. J Cell Sciences. 127 (Pt 9), 2106-2119 (2014).
- Richards, M. A., et al. Transverse tubules are a common feature in large mammalian atrial myocytes including human. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H1996-H2005 (2011).
- Trafford, A. W., Clarke, J. D., Richards, M. A., Eisner, D. A., Dibb, K. M. Calcium signalling microdomains and the t-tubular system in atrial mycoytes potential roles in cardiac disease and arrhythmias. Cardiovasc Res. 98 (2), 192-203 (2013).
- Greiser, M., Schotten, U. Dynamic remodeling of intracellular Ca2+ signaling during atrial fibrillation. J Mol Cell Cardiol. 58, 134-142 (2013).
- Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents. J Vis Exp. (77), 10-3791 (2013).
- Kaestner, L., et al. Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging. J Vis Exp. (31), (2009).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).
- King, N. M., et al. Mouse intact cardiac myocyte mechanics cross-bridge and titin-based stress in unactivated cells. J Gen Physiol. 137 (1), 81-91 (2011).
- Schindelin, J., et al. Fiji, an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. 3D reconstruction of histological sections Application to mammary gland tissue. Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).
- Liu, Z. Q. Scale space approach to directional analysis of images. Appl Opt. 30 (11), 1369-1373 (1991).
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochem Biophys Res Commun. 72 (1), 327-333 (1976).
- Watanabe, Y., et al. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).
- Kohl, T., Westphal, V., Hell, S. W., Lehnart, S. E. Superresolution microscopy in heart - cardiac nanoscopy. J Mol Cell Cardiol. 58, 13-21 (2013).
