Introduction
Los modelos murinos han sido utilizados ampliamente en la investigación del cerebro 1. Correlaciones genotipo-fenotipo han sido investigados en cerebros de ratón y de rata mediante el estudio de la expresión génica en el ARN y / o los niveles de proteína, por una parte, y fenotipos morfológicos, funcionales, electrofisiológicas y / o de comportamiento en el otro 2-6. Sin embargo, para entender completamente los mecanismos que vinculan fenotipo a genotipo, es imperativo investigar los eventos moleculares aguas abajo de la expresión de proteínas, es decir. el metabolismo de los sustratos bioquímicos sobre la que actúan las enzimas 7. Este requisito llevó, en los últimos 10 a 15 años, a un renacimiento de la investigación metabólica en muchas ramas de la biología 8,9. Mientras que los estudios metabólicos clásicos a menudo se han centrado en los detalles de las vías específicas, el nuevo enfoque de metabolómica está orientada a una investigación que todo lo abarca del perfil metabólico global del tejido en estudio.Una consecuencia de este concepto es evidente la necesidad de herramientas de análisis que minimizan el sesgo hacia las vías y / o clases de compuestos metabólicos específicos. Sin embargo, un ensayo bioquímico clásico se basa en una reacción química particular de un analito específico que necesita ser especificado antes de que se realiza el ensayo. Por el contrario, técnicas espectroscópicas tales como resonancia magnética (NMR) nuclear y espectrometría de masas (MS) (i) se basan en propiedades moleculares particulares (físicas) de compuestos bioquímicos, cada uno de los cuales da lugar a una o varias señales distintas en un espectro detectado en el transcurso de un experimento; y (ii) detectar un gran número de diferentes compuestos por experimento.
Por lo tanto, cada espectro contiene la información combinada de toda una gama de metabolitos. Por esta razón, métodos espectroscópicos son herramientas adecuadas para la metabolómica, como ninguna selección previa necesita ser hecha en cuanto a la naturaleza del analito a medir 8
Aunque la espectroscopia de RMN y MS se pueden utilizar indistintamente para el análisis de muchos metabolitos, cada método tiene ventajas y desventajas de que recientemente se han revisado 10 específicos. Brevemente, la espectroscopía de RMN se puede realizar generalmente a partir de extractos crudos y no requiere separación cromatográfica de los compuestos de la muestra antes del análisis. Por el contrario, MS funciona con gas o cromatografía líquida (GC o LC) de separación, a excepción de determinados acontecimientos recientes, como la imagen de espectrometría de masas. En unos pocos casos especiales, tales como el análisis de azúcares, separación de LC puede llegar a ser una necesidad para la espectroscopia de RMN, así, porque las líneas de resonancia de diferentes azúcares se solapan significativamente en protones (1 H) Los espectros de RMN. Sin embargo, 1 H RMN espectroscopía sin chrseparación omatographic sigue siendo el método de RMN metabolómico más popular, casi universalmente aplicada. En general, la preparación de muestras es más largo y complejo para la EM que para la espectroscopía de RMN. Los problemas graves debido a los efectos de matriz son mucho menos comunes en la espectroscopia de RMN que en MS en los que pueden dar lugar a señales considerablemente atenuadas. La cuantificación de metabolitos puede lograrse con cualquiera de los métodos. Sin embargo, se necesitan múltiples compuestos estándar para la EM, debido a las variaciones en los efectos de matriz y la eficiencia de ionización entre metabolitos. Por el contrario, sólo se necesita un estándar por muestra para un análisis espectroscópico de RMN porque bajo condiciones de medición adecuadas, el último método es intrínsecamente gracias cuantitativos a la respuesta RMN estrictamente lineal por los núcleos observados. Un inconveniente importante de RMN es su sensibilidad relativamente baja. MS, en particular, LC-MS, es más sensible que la RMN en varios órdenes de magnitud; por esta razón, MS es preferible más de RMN para elanálisis de compuestos que se producen a concentraciones muy bajas. Por otro lado, la naturaleza no destructiva del experimento de RMN es una clara ventaja sobre MS; de esta manera, RMN se puede realizar varias veces sobre la misma muestra, por ejemplo, para diferentes núcleos-RMN activo tal como 1 H, fósforo-31 (31 P), carbono-13 (C 13), flúor-19 (19 F) etc., ya que ningún material se consume por NMR en comparación con las mediciones de EM.
Tanto RMN y MS se pueden emplear en diferentes modos, cada uno de ellos sea óptima para la detección de compuestos con características químicas particulares. Por ejemplo, 31 P RMN es a menudo más adecuado que 1 H RMN para el análisis de compuestos fosforilados moderadamente concentradas, aunque casi todos los metabolitos fosforilados también contienen protones. Sin embargo, sus señales de 1 H RMN pueden ser oscurecidos por 1 H NMR señales de otros compuestos, no fosforilados, mientras que el segundoobviamente no causan señales de fondo en 31 P espectros de RMN. En una situación analógica, 19 F análisis de RMN es preferible para los compuestos fluorados, por ejemplo, medicamentos fluorados (no hay señales de fondo de metabolitos endógenos), mientras que el caso especial de 13 C RMN es de interés casi exclusivamente si el destino de 13 C precursores metabólicos exógenos marcados necesita ser seguido, debido a la extremadamente baja abundancia natural del isótopo 13 C (ca. 1%). Muchos espectrómetros de masas funcionan tanto en modo de ion negativo o modo de ion positivo. Por lo tanto, es importante saber de antemano el análisis de si los iones que se deben observar están cargados negativamente o positivamente. Nos centramos aquí en un protocolo para el análisis del metaboloma tejido cerebral por 1 H y 31 P espectroscopía de RMN ya que este método se obtiene un gran número de concentraciones de metabolitos importantes a bajo costo en términos de (i) el tiempo necesario para la preparación de muestras de unnd (ii) el esfuerzo requerido para la cuantificación de metabolitos. Todos los experimentos se pueden realizar utilizando el equipo de un laboratorio húmedo química estándar y una instalación de espectroscopia de RMN de alta resolución. Otros requisitos se describen en la sección Protocolo de abajo.
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Protocol
NOTA: ANIMAL ÉTICA DECLARACIÓN
Los estudios en animales con ratas siguieron las directrices vigentes en Francia, y fueron aprobados por el Comité de Ética local (# 40.04, Universidad de la Escuela de Medicina Aix-Marseille, Marsella, Francia).
1. recolección y congelación de cerebro de rata
- Preparar elementos necesarios: el nitrógeno líquido (N 2liq.) En Dewar que es lo suficientemente grande como para mantener una abrazadera de congelación (al menos 2-3 L de volumen); anestésico (por ejemplo, isoflurano, o ketamina / xilazina); cámara de la anestesia; herramientas de disección estériles: tijeras quirúrgicas, bisturí, fórceps; toallitas de tejido y botella con alcohol de limpieza (etanol); agujas (25 g); 1 ml y 10 ml jeringas. Hojas de etiquetas de aluminio (aproximadamente 10 x 10 cm) con cinta adhesiva. Utilice hojas para envolver los cerebros de ratas de congelación fijada individuales.
NOTA: Siempre utilice guantes protectores y gafas de protección ocular o máscara al manipular el nitrógeno líquido! - Rellene Dewar con N 2liq. Y coloque libreabrazadera zing en un Dewar. Asegúrese de que la cantidad de N 2liq en el Dewar es suficiente para los procedimientos de congelación-clamp repetidas (varios litros; la cantidad de N 2liq evaporación durante cada congelación de sujeción depende del tamaño de la pinza).
- Anestesie animal (por ejemplo, por isoflurano, o por inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina / xilazina mezcla). Proceder a la eutanasia por punción cardiaca para prevenir el sangrado cuando se quita el cuero cabelludo y se abre el cráneo. Pasos 1.4-1.7 continuación describen este procedimiento estándar.
NOTA: En los protocolos especiales que requieren la máxima preservación de la glucosa y los metabolitos de alta energía, rata sacrificio mediante un embudo de congelación el cerebro del animal anestesiado con N 2liq 11 después de la retracción del cuero cabelludo. Entonces, diseccionar el cerebro fuera del cráneo bajo 2liq N intermitente para reducir al mínimo el metabolismo post-mortem 12. - Humedezca la cabeza de rata con alcohol de limpieza. Con unas tijeras quirúrgicas a (i) remove cuero cabelludo, y (ii) el cráneo abierto a lo largo de las suturas craneales.
- Utilice unas pinzas para abrir aún más el cráneo, y de quitar toda cerebro por debajo del cráneo abierto, colocando la cabeza hacia abajo. Quite rápidamente los rastros visibles de sangre utilizando toallitas de tejido. Si hemisferios cerebrales son metabólicamente y morfológicamente simétrica, es conveniente utilizar uno de los hemisferios para el análisis metabólico después de que lo separa del otro hemisferio por incisión con el bisturí. Si es necesario, utilice el hemisferio restante para otros estudios del cerebro tales como la histología.
- Rápidamente eliminar congelación pinza de N 2liq, repleto Dewar, coloque todo o la mitad de cerebro de rata en una superficie interna, abrazadera e inserte inmediatamente congelación abrazadera en N 2liq, repleto Dewar mientras sostiene la abrazadera firmemente comprimido. Asegúrese de que los pasos 1.3-1.6 no puede durar más de 60 segundos.
- Después de 1-2 min remove pinza congelación del Dewar, pinza abierta, aflojar el tejido cerebral congelado de pinza, y envolturatejido congelado en chapa de aluminio debidamente etiquetados (ver 1.1). Asegúrese de que la etiqueta sea legible y se mantiene firmemente en su lugar después de que se envuelve la muestra. Colocar rápidamente la muestra envuelta en N 2liq. Realice todo el procedimiento lo más rápidamente posible para evitar la descongelación del tejido cerebral congelado.
- Guarde muestra congelada en N 2liq o en un congelador a -80 ° C hasta la extracción de metabolitos.
NOTA: Siempre que una muestra biológica se va a almacenar durante más de un año, el almacenamiento a temperatura N 2liq es preferible a -80 ° C. Esto también se aplica al resto de este protocolo.
2 Preparación del procedimiento de extracción de metabolitos
- Preparar homogeneizador de tejidos y los tubos de ensayo con las características determinadas (por ejemplo, 10 mm de diámetro interior, dependiendo del diámetro del eje de homogeneizador, por lo general de plástico). Utilice homogeneizadores eléctricos en lugar de los homogeneizadores impulsados manualmente (molinillos de tejido). Prepare vórtice y balanza de laboratorio.
- Preparar cubo lleno de hielo picado. Mantenga quantitites suficiente de metanol, cloroformo y agua en hielo (4 ml cada uno por 250-350 mg de tejido cerebral congelado).
- Preparar pipetas de transferencia y viales.
- Preparar viales de vidrio (volumen ≥20 ml) con tapones de rosca y el lugar en el hielo (un vial al extracto de tejido). Coloque el tornillo tapas con un septum de teflón resistente a cloroformo.
- Preparar 5 ml pipetas de plástico para la distribución de metanol y agua, y pipetas de vidrio o jeringuillas Hamilton para la dispensación de cloroformo. Preparar pipetas de plástico adicionales (5 o 10 ml de volumen) para transferir las mezclas de homogeneizado de tejido y metanol.
- Asegúrese de que todos los objetos de vidrio se enjuaga a fondo con agua destilada y se seca cuidadosamente antes de su uso para eliminar trazas de impurezas, en particular formiato de RMN-detectable y acetato.
- Rellene mortero de porcelana con N 2liq, lugar porcelana maja en el mortero y vuelva a llenar con N 2liq. El nitrógeno se evapore hasta que la temperatura del mortero y la maja es suficientemente baja. Mantenga pequeña cantidad de N 2liq en el mortero.
3. Extracción de metabolitos
- Retire muestra de tejido cerebral congelado de almacenamiento (N tanque 2liq o -80 ° C congelador). Luego, transferir inmediatamente muestra de tejido al mortero parcialmente lleno con N 2liq.
- Utilice la N 2liq maja -Frío para romper el tejido cerebral congelado en trozos más pequeños que caben fácilmente en los tubos de ensayo utilizados para la homogeneización de los tejidos. Para evitar que las piezas de tejido congelado de ser proyectada fuera del mortero en el proceso, romper el tejido sin dejar de ser envuelto en lámina de aluminio. No muela tejido congelado a polvo ya que esto haría que la transferencia al tubo de ensayo más difíciles (aumento del riesgo de condensación de agua). IMPORTANTE: A lo largo de todo el procedimiento, agregue N 2liq al mortero, según sea necesario para mantener la muestra ultracongelado.
- Mix spiezas de centros comerciales de tejido cerebral congelado a fondo, pesan 250-350 mg y transfieren a un tubo de ensayo lleno de helado de metanol (4 ml para el tejido cerebral 250-350 mg). Se agregan cada vez que piezas de tejido congelado, homogeneizar estos de inmediato con el homogeneizador de tejidos.
NOTA: completar todo este procedimiento rápidamente para evitar (i) la condensación significativa de agua en la muestra que daría lugar a una sobreestimación de la peso de la muestra, y (ii) calefacción y descongelación de la muestra. Individuales piezas de tejido deben estar en un estado congelado en el comienzo del proceso de homogeneización. - Después de la última pieza de la muestra de cerebro de rata congelado se ha añadido al tubo de ensayo y se homogeneizaron, transferir el homogeneizado a un vial de vidrio de volumen ≥20 ml, cerca de tapón de rosca y dejar reposar en hielo durante 15 min. Si el volumen del tubo de ensayo no es suficientemente grande para ≥4 ml de metanol, utilizar un volumen más pequeño de metanol para homogeneizar una parte del tejido cerebral congelado, transferir la mezcla a lavial de vidrio y continuar homogeneizando las piezas de tejido residuales con metanol fresco. Asegúrese de que el volumen total de metanol es de 4 ml por 250-350 mg de tejido cerebral.
- Añadir el mismo volumen de cloroformo enfriado con hielo (es decir, 4 ml por 250-350 mg de tejido cerebral) al homogenado, mezclar bien y dejar reposar en hielo durante 15 min.
NOTA: Utilice siempre la campana química ventilada al manipular disolventes volátiles, especialmente cloroformo! - Añadir el mismo volumen de agua (es decir, 4 ml por 250-350 mg de tejido cerebral homogeneizado a), mezclar bien y dejar reposar a -20 ° C durante la noche.
4 Preparación de separación de fases y evaporación del disolvente
- Preparar centrífuga frío (4 ° C, 13.000 xga radio máximo) y tubos de centrífuga. Asegúrese de que estos últimos son ≥20 ml de volumen, resistente al cloroformo, y puede soportar fuerzas centrífugas de 13.000 x g. Utilice tubos de centrífuga de vidrio dedicados pero enjuague (como toda la vajilla de vidrio) con agua destilada seruso tanto (ver 2.3).
- Preparar bien enjuagados pipetas Pasteur de vidrio y un propipettor apropiada (bombilla, bomba manual de pipeta, pipetas ayuda / pipeta automática, etc.).
- Preparar dos tubos adicionales se aclararon a fondo (volumen ≥15 ml) por muestra de cerebro, uno de los cuales tiene que ser resistente a cloroformo (de vidrio o teflón), el otro a metanol (hecha de resistente a metanol, o de vidrio de plástico).
- Preparar aparato de evaporación del disolvente (disponible comercialmente o de construcción casera). Asegúrese de que este dispositivo proporciona una corriente finamente controlada de gas nitrógeno seco que se dirige sobre la superficie de una solución de extracto que contiene disolventes volátiles (metanol, cloroformo).
- Preparar dos bandejas adicionales o cubos llenos de hielo: una para el transporte de muestras en hielo, y otro para mantener las muestras frías durante el proceso de evaporación.
- Preparar liofilizador (liofilizador) y los materiales necesarios para la liofilización: (i) un 50tubo de centrífuga ml o vacío matraz de fondo redondo por extracto, y (ii) 2liq N para congelar la fase acuosa de muestras (≤0.3 L por muestra). Si se utiliza tubo de centrífuga, también preparar en todo el cuello de la botella filtro de vacío adecuado para liofilizador.
5. separación de fases y evaporación del disolvente
- Para la separación de fases completa, transferir el homogeneizado de tejido metanol / cloroformo / agua / cerebro (ver 3.6) a un tubo de centrífuga de cloroformo-resistente (volumen ≥20 ml) y se centrifuga a 13.000 xg y 4 ° C durante 40 min.
NOTA: Dos fases se formarán, separadas por una capa de proteína precipitada. La fase inferior (más pesado) consta de metanol, cloroformo y lípidos disueltos, mientras que la fase superior (más ligero) consiste en agua, metanol y metabolitos solubles en agua disueltos. - Utilizar una pipeta Pasteur para transferir la fase superior a un tubo apropiado ≥15 ml (resistente a metanol plástico, o vidrio). Mantener en ice.
- Utilizar una pipeta Pasteur fresco para transferir la fase inferior a un tubo ≥15 ml adecuado (vidrio o teflón). Mantener en hielo.
- Almacenar la capa de proteína precipitada a -80 ° C si se va a utilizar para la determinación de proteína total; o de lo contrario desechar.
- Mantenga el tubo con la fase agua / metanol (véase 5.2) en hielo y se evapora el metanol dirigiendo una corriente de nitrógeno seco sobre la superficie de la solución del extracto. Alternativamente, suavemente burbujear nitrógeno a través de la solución de extracto. Terminar el proceso de evaporación cuando burbujeo de nitrógeno ya no provoca la reducción del volumen de la solución del extracto. En este momento, continuar con la liofilización (véase 5.7), o congelar y mantener la muestra a -80 ° C con el tubo cerrado (tapón de rosca o Parafilm) hasta que esté listo para liofilización.
- Colocar el tubo con la fase de metanol / cloroformo (ver 5.3) en hielo y se evapora el metanol dirigiendo una corriente de nitrógeno seco sobre la SUrface de la solución del extracto. Cuando se evaporó todo el disolvente, terminar el proceso y mantener la muestra a -80 ° C con el tubo cerrado (tapón de rosca o Parafilm) hasta que esté listo para el análisis de RMN.
- Preparar fase acuosa para liofilización
- Después del final del proceso de evaporación de metanol (ver 5.5), transferir la muestra a un tubo de centrífuga de 50 ml completamente enjuagados (si la muestra se congela, descongelar antes de la transferencia). Alternativamente, transferir a un matraz de fondo redondo de vacío.
- Congelar solución de extracto girando tubo de centrífuga (o matraz de fondo redondo) parcialmente insertado en N 2liq de tal manera que la superficie interna del tubo o matraz se cubrió progresivamente por líquido congelado. Asegúrese de no 2liq N. Puede entrar en el receptáculo.
- Cuando se congela todo el líquido, cubrir el tubo con una tapa perforada o tapón de rosca para permitir que el vapor se escape, y colocar el tubo en un filtro de vacío botella de cuello ancho.
- Iniciar liofilización después attaChing el matraz o botella a la liofilizador.
- Terminar el proceso de liofilización cuando la muestra es totalmente seco. Mantener la muestra a -80 ° C en un tubo cerrado (con una tapa apretada!) Hasta que se usaron para el análisis de RMN.
NOTA: Por lo general no más de 24 horas se necesitan para la liofilización. Varias muestras se pueden liofilizar simultáneamente, dependiendo del diseño del liofilizador, y de si se usan tubos de centrífuga en botellas de cuello ancho o matraces de fondo redondo.
6. Preparación de las muestras de RMN
- Tienda extractos se secaron y se liofilizó a temperatura muy baja (≤-80 ° C). Re-disolver liofilizados para la preparación de muestras de RMN inmediatamente antes de RMN experimento.
NOTA: El almacenamiento de muestras en solución y / o cerca de la temperatura ambiente puede resultar en la degradación de la muestra! - Preparar una solución acuosa 200 mM del agente quelante, el ácido trans-1,2-cyclohexyldiaminetetraacetic (CDTA), como sigue:
- Añadir el agua pura (por ejemplo, 20 ml) a un tubo o tubo de ensayo de centrífuga, y añadir la cantidad de polvo CDTA necesario para generar una solución 200 mM.
NOTA: Una proporción sustancial de CDTA no será soluble, debido a que el pH es muy bajo desde que se utiliza una forma ácida de CDTA en lugar de una sal de CDTA. - Añadir con cuidado, paso a paso, el aumento de cantidades de polvo CsOH a la solución CDTA, y mezclar bien después de cada adición.
NOTA: La fracción soluble CDTA aumentará con el aumento del contenido de CsOH en la solución acuosa. Evitar "overtitration", es decir, añadir menos de la cantidad estequiométrica de CsOH a la solución CDTA. - Cuando se disuelve casi todo el polvo de CDTA, comenzar a medir el pH después de cada adición CsOH y agitación en vórtex a fondo. Terminar Además CsOH cuando el pH final se alcanza (Tabla 1).
NOTA: En este momento, todo el CDTA se disolverá. El uso de Cs + como un contraión para CDTA es Generaliado preferido sobre Na + o K +. Cs + es un ácido de Lewis suave debido a su gran radio iónico, a diferencia de Na + y K + que tienen radios iónicos pequeños y son ácidos duros. En consecuencia, Cs + forma complejos con fosfatos (bases duros) con menos facilidad que hacer Na + y K +. Esto es ventajoso para 31 P espectroscopía de RMN de metabolitos fosforilados porque tiende a aumentar la formación de complejos anchos de línea de RMN, especialmente en condiciones de lento a intercambio iónico intermedio.
- Añadir el agua pura (por ejemplo, 20 ml) a un tubo o tubo de ensayo de centrífuga, y añadir la cantidad de polvo CDTA necesario para generar una solución 200 mM.
- Para 31 P RMN análisis de fosfolípidos (PL), se disuelven lípidos secos (ver 5.6) en 700 l de una mezcla de disolventes que consiste en cloroformo deuterado (CDCl3), metanol y la solución CDTA preparado como se describe en 6.2 (5: 4: 1 relación de volumen). Transferir la muestra a un tubo de microcentrífuga. Utilice-desplazamiento directo (o de desplazamiento positivo) micropipeta con cloroformo-resistirconsejos de hormigas en ambos pasos.
NOTA: Tenga en cuenta que la modificación de cualquiera de los siguientes parámetros afectará a la apariencia (desplazamiento químico y anchos de línea) de PL 31 P espectros de RMN de 13 a 17:
(I) relación de volumen CDCl3: solución CDTA: MeOH
(Ii) el volumen total de disolvente utilizado
(Iii) el pH del componente acuoso del disolvente
(Iv) la concentración CDTA del componente acuoso del disolvente.
NOTA: En general, ajuste fino de estos parámetros de la muestra (Tabla 1) no es necesario, y se debe realizar con sumo cuidado si se desea en casos especiales. Cambio de la relación de volumen entre los disolventes fácilmente da como resultado la formación de un sistema que consta de dos fases en lugar de una fase homogénea! El sistema de una sola fase se encontró que era más práctico que el sistema de dos fases en la mayoría de las aplicaciones de 13,14. - Para análisis de 1H RMN de los metabolitos solubles en agua, disolver liofilizado (ver 5.8) en 700 l de óxido de deuterio (D2O) que contiene de 3 (trimetilsilil) sal sódica del ácido propiónico-2,2,3,3-d4 (TSPD 4) en el intervalo milimolar (D 2 O que contiene 0,05% TSPD 4 está disponible en el comercio) . Transferir la muestra a un tubo de microcentrífuga.
- Ajustar el pH de la solución de extracto acuoso resultante a 7,3 mediante la adición de pequeñas cantidades (aproximadamente 2 l) de cloruro de deuterio (DCI) y soluciones de deuteroxide de sodio (NaOD). En primer lugar, comenzar con 0,02 N soluciones DCL o NaOD. Si 2 o 3 adiciones posteriores no causan cambio de pH suficiente, continúe con 0.2 N soluciones DCL o NaOD. Tenga cuidado de no overtitrate.
NOTA: La cantidad total de solución DCl o NaOD necesario depende de la cantidad de tejido cerebral extraído; nota de este valor para la cuantificación de metabolitos precisa. En la mayoría de los casos los volúmenes combinados de las soluciones DCL y NaOD agregados deben ser prácticamente insignificante (cerca del 1% del volumen de la muestra de RMN).
- Para obtener los mejores resultados, utilice un espectrómetro de RMN de alta resolución multinuclear (≥9.4 Tesla intensidad de campo, lo que corresponde a 162 MHz 31 P, o 400 MHz 1 H frecuencias de resonancia). Además de la bobina 31 P, asegúrese de que la sonda 31P RMN posee una bobina de 1H para el desacoplamiento de protones. Establecer regulación de la temperatura de la sonda de RMN de valor objetivo deseado (normalmente 25 ° C).
NOTA: la temperatura de la sonda puede necesitar 10-20 min para estabilizar! - Centrifugar la solución PL extracto en tubo de microcentrífuga (ver 6.3) a 4 ° C y 11.000 xg durante 30 min a girar hacia abajo residuos sólidos en la muestra. Transferir 600 l del sobrenadante a un tubo de RMN de alta calidad (5 mm de diámetro exterior).
- Preparar apropiado vástago de inserción coaxial lleno de un metilendifosfonato acuosa 20 mM de solución (MDP) a pH 7,0 para la referencia de desplazamiento químicoy cuantificación. Coloque esta inserto en el tubo de RMN lleno de solución de extracto de PL.
- Montar el tubo de RMN con la ruleta y una transferencia apropiada al imán RMN. Ahora girar la muestra a 15-20 Hz y esperar hasta que la muestra se ha ajustado a la temperatura establecida (aproximadamente 10 min).
- Cuidadosamente minimizar la falta de homogeneidad del campo magnético a través de la muestra mediante el ajuste en el eje y fuera del eje corrientes de bobina cuña 18.
- Establezca los parámetros de adquisición de espectro de RMN de valores óptimos, que pueden variar en función de la intensidad de campo magnético (para un sistema 9.4 T, consulte la Tabla 1 para los valores de los parámetros recomendados).
- Establecer el número de transitorios por experimento (= NS).
- Establecer NS a unos 80 (duración total de la adquisición de datos ca. 20 min) si sólo los PLs más frecuentes deben ser cuantificado con precisión (fosfatidilcolina (PtdCho), fosfatidiletanolamina (PtdEtn), plasmalógeno etanolamina).
- Establecer NS a unos 100-200 (duración total de dadquisición ata 1-2 hr) si PLs menos concentradas están a cuantificarse (alquil-acil-fosfatidilcolina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico).
- Conjunto NS a aproximadamente 1,500-2,000 (duración total de adquisición de datos 7-10 hr; experimento durante la noche) si PLs de muy baja concentración son para ser cuantificado, por ejemplo, mono y difosfatos fosfatidilinositol (PtdIP y PtdIP 2), cardiolipina, liso-PLs , alquil-acil-fosfatidiletanolamina, y ocasionalmente otros.
- Tras el final de la adquisición de espectro, proceso de decaimiento de inducción libre (FID) utilizando parámetros optimizados. Los valores de estos parámetros varían como una función de la fuerza del campo magnético, la calidad de cuña, y la señal de PL a ser cuantificada.
- Para obtener los mejores resultados para toda la gama de PLs, repetir de procesamiento utilizando múltiples (al menos dos) diferentes procedimientos de filtrado. Utilice mejora de resolución fuerte para señales fuertemente superpuestos, por ejemplo., Por PtdCho y PtdEtnregiones.
- Utilizar el filtro fuerte (débil o ninguna mejora de la resolución) para señales débiles.
- Filtra señales muy débiles y amplios sin solapamiento significativo por apodización (por ejemplo, LB = 3 Hz) para aumentar la relación señal a ruido, por ejemplo PtdIP y PtdIP 2. Ver Tabla 1 para los parámetros de procesamiento característicos.
- Cuantificar el área de cada señal de PL con respecto al área bajo la señal del compuesto de referencia (MDP) en el mismo espectro.
- Calibrar la señal del compuesto de referencia (MDP) en un experimento separado, utilizando un tubo de RMN de 5 mm lleno de (i) un compuesto de fósforo de concentración conocida, y (ii) el mismo tallo inserto coaxial utilizado en PL 31 experimentos de RMN P ( ver 7.3 y 7.9).
- Calcular las concentraciones individuales PL basado en las áreas relativas de las señales de PL por un lado (véase 7.9), y en el valor de calibración obtenida para MDP desdeinserción coaxial en el otro (véase 7.10). Tener en cuenta que el número de núcleos de fósforo que contribuyen a una señal de RMN 31 P particular puede variar en función del origen molecular de esa señal.
NOTA: La señal de fosfonato MDP (generalmente referenciado a 19,39 ppm) representa dos núcleos de fósforo, al igual que la señal de fosfato de cardiolipina. Todas las demás señales de RMN PL 31 P detectadas en extractos cerebrales representan un núcleo de fósforo cada uno. - Utilice software de estadísticas, según sea necesario para comparar los niveles cerebrales PL entre grupos de animales.
8. Realización del experimento 1 H RMN para el análisis de agua-soluble metabolitos cerebrales
- Establecer regulación de la temperatura de la sonda de 1 H RMN de valor objetivo deseado (normalmente 25 ° C). Ver también las observaciones en 7.1.
- Centrifugar la solución de extracto acuoso en tubo de microcentrífuga (ver 6.5) a 4 ° C y 11.000xg durante 30 min se detenga por residuos sólidos en la muestra. Transferir 600 l del sobrenadante a un tubo de RMN de alta calidad (5 mm de diámetro exterior).
- Tubo de RMN Traslado al imán RMN, cuña y establecer los parámetros de adquisición de espectro RMN a valores óptimos como se explica en 7.4 a 7.6. Ver también la Tabla 1 para valores de los parámetros recomendados.
- Establecer el número de transitorios por experimento a cerca NS = 32 (duración total de la adquisición de datos a aproximadamente 13 min). Para obtener una buena relación señal-ruido para señales muy débiles, en particular en la región aromática, utilice NS = 64 (duración total de adquisición de datos ca. 26 min) o más.
- Tras el final de la adquisición de espectro, proceso de decaimiento de inducción libre (FID) utilizando parámetros optimizados. Los valores de estos parámetros varían ligeramente en función de la fuerza del campo magnético, la calidad de cuña, y la señal de metabolito a ser cuantificada.
NOTA: En la mayoría de los casos, es suficiente para procesar cada espectro una vez, Empleando un conjunto de parámetros de procesamiento que presentan un buen compromiso para todas las señales de metabolitos. Ver Tabla 1 para los parámetros de procesamiento característicos. - Cuantificar el área de cada señal de metabolito (a menudo un multiplete, a veces se superponen con otros singletes o multipletes derivados de diferentes moléculas) con respecto al área bajo la señal del compuesto de referencia (TSP-4 d) en el mismo espectro.
- Calcular las concentraciones de metabolitos individuales basados en TSP-d4 concentración (ver 6.4). Tener en cuenta que el número de protones que contribuyen a una señal de RMN 1 H particular puede variar en función del origen molecular de esa señal. La señal de trimetil TSP-d4 (referenciado a 0,0 ppm) representa nueve protones.
- Utilice software de estadísticas, según sea necesario para comparar los niveles de metabolitos cerebrales entre los grupos de animales.
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Representative Results
Para obtener mejor resolución en los espectros de RMN metabólica de cerebro y otros extractos de tejidos, se ha sido durante mucho tiempo una práctica común para eliminar iones o máscara de metal (lo más importante: iones paramagnéticos) presentes en soluciones de extracto. Esto se ha logrado ya sea mediante la adición de un agente quelante tal como EDTA o CDTA al extracto 19, o haciendo pasar el extracto a través de una resina de intercambio iónico tal como Chelex-100 20. Los resultados presentados en la Figura 1 demuestran que este paso no es necesario para 1 H análisis espectroscópico de RMN si los extractos de cerebro se preparan cuidadosamente de acuerdo con el protocolo anterior. Aquí, las líneas espectrales muy estrechas se obtuvieron para todas las regiones espectrales analizadas. Incluso en regiones muy llena, por ejemplo, para la glutamina / glutamato y myo -inositol / glicina, picos a una distancia de <0,01 ppm son casi completamente separable a 400 MHz (Figura 1, abajo). Como consecuencia, cualitativa,y el análisis cuantitativo de las numerosas pequeñas, pero actualmente no asignados, picos visibles en los paneles centrales e inferiores de la Figura 1 se puede prever en el futuro.
Figura 1. subregiones de un típico espectro de RMN 1 H (400 MHz) de la fase acuosa de un extracto de tejido cerebral de una rata Lewis hembra. Los tres paneles demostrar la extremadamente alta resolución que se puede obtener utilizando el protocolo presentado en este documento. Resina Ni agente quelante ni de intercambio iónico se ha usado durante la preparación de la muestra. Paneles inferiores Center y muestran la existencia de muchos picos de baja intensidad no asignadas que hacen alusión a la enorme gama dinámica cubierto por alta resolución 1H NMR espectroscopia de extractos de tejidos si se realiza usando parámetros experimentales optimizadas. Estos débil pero bienseñales detectables potencialmente pueden ser identificados y cuantificados en el futuro. Varios metabolitos detectados son específicos del tejido cerebral, por ejemplo, el marcador de NAA neurona o el neurotransmisor GABA.; Sin embargo, la mayoría de los compuestos están implicados en un amplio espectro de las rutas metabólicas que son comunes a las células de mamíferos, tales como el ácido amino, ácido orgánico de cadena ramificada, poliol, (fosfo) lípidos y metabolismo de la energía, así como en la glucólisis y glutaminolysis, y en funciones tales como la osmorregulación, el crecimiento celular y la proliferación. El asterisco indica la resonancia metil derivado de una impureza de metanol. Abreviaturas: Ala, alanina; lac, lactato; treo, treonina; BHB, β-hidroxibutirato; Val, valina; Ile, isoleucina; Leu, leucina; AAB, α-aminobutirato; AHB, α-hidroxibutirato; tau, taurina; scy -Ins, escilo -inositol; myo -Ins, -inositol mio; GPC, glicerofosfocolina; PC, fosfocolina; cho, colina; crn, creatinina; Cr, creatina; GABA,47; aminobutirato; asp, aspartato; NAA, N -acetylaspartate; Gln, glutamina; glu, glutamato; Suc, succinato; NANA, N -acetylneuraminate; ac, acetato; Gly, glicina. Los pequeños picos en la base del tallo ala doblete de doblete satélite 13 C lactato (panel superior). Reproducido bajo la licencia Creative Commons License (CCAL) términos de Lutz NW et al (2013) rutas bioquímicas cerebrales en la encefalomielitis autoinmune experimental y la artritis adyuvante:. Un estudio metabolómica comparativa. PLOS ONE 8 (2):. E56101 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En 31 de espectroscopia de RMN P, enmascarar o eliminar cationes paramagnéticos (principalmente hierro) es sin duda una necesidad porque los fosfatos forman fácilmente complejos con iones divalentes y trivalentes. La adición de CDTA a los extractos afecta tanto anchos de una línea espectrald desplazamientos químicos; comparar la figura 2, la parte superior e inferior izquierda. Línea estrechamiento eligiendo 1,000 mM (parte inferior izquierda) en lugar de 200 mM (parte superior izquierda) CDTA se deseaba, pero dio lugar a la superposición de las señales de PL que deben ser cuantificadas por separado (parte superior izquierda). Por lo tanto, mM CDTA 200 se recomienda para el componente acuoso del disolvente PL, todos en igualdad de condiciones. Además, la temperatura de la muestra durante la medición afecta anchos de línea espectrales y los desplazamientos químicos; comparar Figura 2, arriba y abajo a la derecha. Línea estrechamiento eligiendo 277 K (parte inferior derecha) en lugar de 297 K (arriba a la derecha) se deseaba, pero dio lugar a la superposición de las señales de PL que deben ser cuantificadas por separado (parte superior derecha). Por lo tanto, 297 K se recomienda como medida de la temperatura, todos en igualdad de condiciones. Comparación entre los dos paneles superiores muestran que una disminución en la concentración de 200 mM CDTA (parte superior izquierda) a 50 mM (parte superior derecha) sólo resulta enun modesto aumento en el ancho de línea, y en casi ningún cambio en los desplazamientos químicos. Sin embargo, tenga en cuenta que la concentración en el tejido en el extracto mM CDTA 50 es un medio tan alta como lo es en el extracto 200 mM CDTA, explicando las líneas relativamente estrechas en el panel superior derecho 13.
Figura 2. Fosfatidiletanolamina (PtdE) regiones del fosfolípido 31 P espectros de RMN (162 MHz) de extractos de tejidos cerebrales de ratas Lewis hembra (panel superior izquierdo) concentración en el tejido cerebral, 236 mg / ml.; CDTA concentración y el pH en el componente acuoso del disolvente, 200 mM y 7,33, respectivamente; temperatura de medición, plasm y SM señales 297 K. PtdE están bien resueltos (izquierda inferior) concentración en el tejido cerebral, 236 mg / ml.; CDTA concentration y el pH en el componente acuoso del disolvente, 1000 mM y 7,36, respectivamente; temperatura de medición, plasm y SM señales 297 K. PtdE solapan por completo; que no se pueden resolver a pesar de reducida anchura de la línea, en comparación con el espectro superior izquierda (parte superior derecha) concentración en el tejido cerebral, 118 mg / ml.; CDTA concentración y el pH en el componente acuoso del disolvente, 50 mM y 7,14, respectivamente; temperatura de medición, 297 señales K. PtdE y SM están bien resuelto-concentración (inferior derecha) El tejido cerebral, 118 mg / ml.; CDTA concentración y el pH en el componente acuoso del disolvente, 50 mM y 7,14, respectivamente; temperatura de medición, 277 señales K. PtdE y SM se solapan por completo; que no se pueden resolver, a pesar de reducida anchura de la línea en comparación con el espectro de arriba a la derecha. Abreviaturas: PtdE plasma, plasmalógeno etanolamina; PtdE, fosfatidiletanolamina; SM, esfingomielina; PTD, phosphatidylserine; PTDC, fosfatidilcolina. Reproducido con permiso del NW Lutz et al. (2010) optimización Multiparámetrico 31 P análisis espectroscópico de RMN de fosfolípidos en extractos de tejido crudo. 1. Desplazamiento químico y la separación de la señal. Anal Chem 82 (13): desde 5.433 hasta 5.440. Copyright 2010 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Usando el protocolo anterior (sistema de una sola fase 14; la Figura 3, parte superior izquierda), se detectaron un gran número de PLs cuantificables (Figura 3, parte superior derecha), cubriendo un considerable intervalo de concentración (nota señales de alta intensidad truncadas). Algunas de estas señales son aún sin asignar (U1, U2, U6). Si no se realiza la preparación de muestras, medición de RMN y procesamiento de espectro, como se indica en este protocolo, la resolución espectral es aún suficiente para d rutinariamenteetect escisión parcial de ciertos picos (PTD, PtdE, plasm PtdE, AAPtdE; abajo a la izquierda). . Como consecuencia de ello, cualitativo y análisis cuantitativo de subgrupos adicionales PL pueden preverse en el futuro la Figura 3, abajo a la derecha, ilustra el poder de los parámetros de procesamiento juiciosamente elegidas a parcialmente señales separadas de compuestos de baja concentración (en este caso: PtdC1u, un PL derivan desde PTDC que no está plenamente identificado, y PTDC plasma) que resuena cerca de señales muy fuertes (aquí: PTDC).
Figura 3. de fosfolípidos 31 P espectroscopía de RMN (162 MHz) de los extractos de tejido cerebral de ratas Lewis hembra. (Panel superior izquierdo) Un sistema de una sola fase (a la izquierda) se prefiere más de un sistema de dos fases (derecha). El sistema comúnmente utilizado en dos fases dificulta correctaPL cuantificación porque la mayor parte de la fase superior se encuentra fuera del volumen sensible de la bobina. (Panel superior derecho) Completo espectro 31P RMN PL de cerebro de rata. Para una mejor visibilidad de las señales débiles (PtdIP, PtdG), línea exponencial ensanchamiento (LB = 3 Hz) se aplicó. En esta representación, varias señales PL no están bien resueltos-, sobre todo en las regiones PTDC y PtdE. Para PLs generando más de una señal de 31 P RMN, se subrayan los núcleos observados (P TDIP, PTDI P, P TDIP 2, PTDI P 2). Actualmente no asignadas señales se indican mediante "U n" (donde n = 1, 2, ...). (Panel izquierdo inferior) y PtdE PTD regiones del mismo espectro. Para una mejor resolución de los picos, se aplicó la transformación de Lorentz-forma de la línea de Gauss (LB = -1 Hz, GB = 0,3). Debido a estos parámetros de procesamiento, muchas señales muy débiles PL son difíciles de detectar. Sin embargo, al menos dos picos puedediscernir para cada PtdE, PtdE plasma, AAPtdE y PTD. (panel inferior derecho) región PTDC obtenido con los mismos parámetros de procesamiento como la región PtdE. Varias señales en la base de la resonancia dominante PTDC se detectaron de forma inequívoca, mientras que no se pueden discernir en el espectro superior generada con ampliación de la línea exponencial (plasma AAPtdC, PTDC, PtdC1u). Además de la analógica PTDC actualmente sin asignar, PtdC1u, otras resonancias menores puede estar presente fuera del campo de PTDC. Abreviaturas: PtdIP, fosfato fosfatidilinositol; PtdIP 2, difosfato de fosfatidilinositol; PTDA, ácido fosfatídico; PtdG, fosfatidilglicerol; CL, cardiolipina; PtdE .., suma de PtdE, PtdE plasma y AAPtdE; PTDI, fosfatidilinositol. Para más abreviaturas ver leyenda de la Figura 2. Reproducido con permiso del NW Lutz et al. (2010) optimización Multiparámetrico 31 P análisis espectroscópico de RMN de phospholipids en extractos de tejido crudo. 1. Desplazamiento químico y la separación de la señal. Anal Chem 82 (13): desde 5.433 hasta 5.440. Copyright 2010 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| La recolección y congelación de cerebro de rata | |||
| Dewar para N 2liq.; congelación de sujeción (por ejemplo., pinzas Wollenberger caseras, referencias 1 y 2, parte inferior de la tabla); cámara de la anestesia; tijeras quirúrgicas; bisturí; Botella de 500 ml con alcohol de limpieza | 1 de cada | ||
| Pinzas | 2 | ||
| 1 ml de la jeringa, 10 ml jeringa | 1 de cada por animal | ||
| 25 G agujas | 2 por animal | ||
| Prepar Muestraación | |||
| Cantidad típica de tejido cerebral por extracción | 250-350 mg | ||
| Volumen de MeOH utilizado en la homogeneización de 250 - 350 mg de tejido cerebral | 4 ml | ||
| 5 ml de pipeta de plástico | 3 por extracto | ||
| 10 ml de pipeta de plástico | 1 por extracto | ||
| Vial de vidrio (volumen ≥20 ml) | 1 por extracto | ||
| Tubo de centrífuga Cloroformo resistente | 1 por extracto | ||
| Período de espera después de la homogeneización del tejido en MeOH (mezcla a 4 ° C) | 15 min | ||
| Agua y CHCl3 volumen añadido al tejido cerebral se homogeneizó en 4 ml de MeOH | 4 ml cada uno | ||
| Período de espera después de mezclar tejido homogeneizado con agua y CHCl3 (mezcla a -20 ° C) | durante la noche | ||
| La centrifugación para la separación of acuosa de la fase extracto orgánico (tubo de centrífuga de vidrio) | 13000 × g, durante 40 min a 4 ° C | ||
| Concentración de la solución CDTA (fase acuosa de la mezcla de disolvente para disolver lípidos extraídos) | 200 mM | ||
| pH de la fase acuosa de la mezcla de disolvente para disolver lípidos extraídos | 7.4 | ||
| Relación de volumen de lípidos en disolvente A utilizó para el análisis PL 31 P (CDCl3: MeOH: solución CDTA) | 5: 4: 1 | ||
| Una cantidad de disolvente utilizado para disolver los lípidos extraídos de 250 - 350 mg de tejido cerebral | 700 l | ||
| La centrifugación de desacelerándose partículas sólidas en la muestra de RMN (tubo de microcentrífuga) | 11.000 xg, durante 30 min a 4 ° C | ||
| pH de la muestra de RMN que contiene los metabolitos solubles en agua | 7.3 | ||
| Volumen de la muestra transferida al tubo de RMN, después de Centrifugation | 600 l | ||
| Concentración de MDP en potencia inserte coaxial para 31 P RMN | 20 mM | ||
| Los experimentos de RMN | |||
| Temperatura de la muestra durante el experimento de RMN (que ser ajustada para minimizar el pico de solapamiento) | 25 ° C | ||
| Spinning frecuencia durante el experimento de RMN | 15-20 Hz | ||
| 1 Parámetros H RMN de adquisición | |||
| Solvente proporcionando 2 señal de bloqueo H | D 2 O | ||
| Ancho de pulso de excitación, P1 | 11 microsegundos | ||
| Pulso de excitación, la atenuación del amplificador, PL1 | 0 dB | ||
| Tamaño FID, TD | 32 k | ||
| FID adquisición time, AQ | 3.283 sec | ||
| Retraso Relajación, D1 | 15 seg | ||
| Retardo de supresión de disolvente, D4 | 6 sec | ||
| Tiempo total repetición, TR | 24,3 seg | ||
| Ancho espectral en ppm, SWP | 12.47 ppm | ||
| Ancho espectral en Hz, SW | 4.990 Hz | ||
| Ganancia del receptor, RG | 512 | ||
| Supresión de disolvente (onda continua) | CW | ||
| Supresión de disolvente, la atenuación del amplificador, PL9 | 50 dB | ||
| Número de transitorios, NS | 32 o 64 | ||
| 31 Parámetros P RMN de adquisición | |||
| Solvente proporcionando 2 señal de bloqueo H | CDCl3 | ||
| Excitación wi pulsodth, P1 | 9,5 microsegundos | ||
| Pulso de excitación, la atenuación del amplificador, PL1 | 4 dB | ||
| Tamaño FID, TD | 16 k | ||
| FID tiempo de adquisición, AQ | 2.019 sec | ||
| Retraso Relajación, D1 | 15 seg | ||
| Tiempo total repetición, TR | 17 seg | ||
| Ancho espectral en ppm, SWP | 25 ppm | ||
| Ancho espectral en Hz, SW | 4058 Hz | ||
| Ganancia del receptor, RG (máximo) | 16384 | ||
| Desacoplamiento de protón (disociación pulso compuesto) | CPD | ||
| Desacoplamiento de protones, la atenuación del amplificador, PL13 | 19 dB | ||
| Número de transitorios, NS | 1500 o 2000 | ||
| Procesamiento de datos de RMN | 1 H de resolución mejorada, Gauss-Lorentzian forma lineal Transformación | ||
| Evaluación global de espectro (si es necesario, optimizar por separado para las regiones espectrales individuales, utilizando 0,1 <GB <0,4 y -0,6 <LB <-0,2 Hz) | GB = 0,15, LB = -0,2 Hz | ||
| Señales muy débiles, por ejemplo, ácidos aromáticos (como alternativa a apodización con LB ≥ 0,5 Hz) | GB = 0,015, LB = -0,3 Hz | ||
| Las áreas bajo los picos: Uso forma lineal se ajusta para resonancias superposición | |||
| Resolución mejora 31 P, la transformación de Gauss-Lorentzian forma lineal | |||
| Evaluación global de espectro (optimizar por separado para las regiones espectrales individuales, utilizando 0,05 <GB <0,2 y -3,0 <LB <60; -1,0 Hz) | GB = 0,05, LB = -1,0 Hz | ||
| Señales muy débiles, por ejemplo, PtdIP 2, PTDA: apodización | LB = 3 Hz | ||
| Las áreas bajo los picos: Uso forma lineal se ajusta para resonancias superposición | |||
| Referencias | |||
| 1. Palladino GW, Madera JJ, Proctor HJ. Técnica de fijación de congelación de modificación para el ensayo de tejido. El Diario de la investigación quirúrgica 289, 188-190 (1980). | |||
| 2. Wollenberger A, Ristau O, Schoffa G. [Una técnica simple para la extremadamente rápida congelación de las grandes piezas de tejido]. Pflugers Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere 270, 399-412 (1960). | |||
Tabla 1. parámetros experimentales para alta resolución 1 H y 31 P espectroscopía de RMN de cerebrose presentan los extractos de tejido. Los valores típicos para relaciones de volumen y las concentraciones de disolventes y reactivos utilizados en la extracción de tejido cerebral y preparación de la muestra de RMN. Valores adicionales recomendadas se refieren a la muestra de pH y temperatura de medición, así como los parámetros de adquisición y procesamiento de RMN. Pequeños ajustes pueden ser necesarios, en particular, si el protocolo se aplica a los tejidos distintos de cerebro. Parámetros de RMN se han optimizado para mediciones a 9,4 T, y deben ajustarse según sea necesario para espectrómetros que operan en diferentes puntos fuertes campos magnéticos.
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Discussion
Espectroscopía de RMN es un método eficiente para la medición de concentraciones de compuestos químicos en solución de una manera muy reproducible y precisa. Sin embargo, para obtener datos de alta calidad, es necesario cumplir con ciertas normas relativas a la preparación y análisis de muestras. En la determinación de las concentraciones de metabolitos por espectroscopía de RMN, ni la generación ni la recepción de la señal de RMN domina el error de cuantificación, a menos que la intensidad de una señal observada se acerca al umbral de detección (señal particularmente débil). En todos los demás casos la variabilidad biológica, la técnica de preparación de la muestra (eficacia de la extracción, la estabilidad física y química de los compuestos, y un peso de errores de pipeteo, etc), y / o la elección de los parámetros de adquisición de la señal y de procesamiento va a determinar la precisión y la exactitud de los resultados. Obviamente, los cambios metabólicos que ocurren durante la cosecha de tejidos también se reflejarán en el metabolito concentraciones obtienened. Por lo tanto, es muy importante para completar la cosecha de tejidos tan rápido como sea posible, y en particular para aplicar técnicas de congelación tejido, tal como embudo de congelación si precisa las concentraciones in vivo de compuestos que metabolizan rápidamente son importantes (en particular, glucosa, lactato, ATP y su catabolitos, ADP y AMP).
Incluso en la fuerza de campo magnético intermedio (9,4 T) de un espectrómetro de alta resolución RMN excelente espectros de rutina puede ser obtenida. Por ejemplo, en 1 H espectros de RMN de la fase acuosa de extractos de cerebro de rata, señales cuya diferencia de desplazamiento químico, Δδ, asciende a aproximadamente 0.005 ppm (correspondiente a 2,0 Hz a 400 MHz frecuencia de resonancia) se puede discernir y se cuantificó por separado. Esto se ilustra por la separación parcial de (i) el lactato y dobletes treonina, y (ii) el doblete de alanina a partir de los picos pequeños en su base (lactato 13 C doblete satélite; la Figura 1,superior). Espectrómetros que operan a campos más altos (14,1 o incluso 18,8 T) aumentaría resolución y sensibilidad más, aunque estos instrumentos son menos comunes en los laboratorios de RMN debido a su alto coste de compra.
Usando espectroscopía 1 H RMN, una amplia gama de metabolitos puede analizarse simultáneamente, es decir, en una sola adquisición. La sensibilidad del experimento se puede mejorar aumentando el número de transitorios acumulados, aunque esta elección aumenta proporcionalmente el tiempo de medición. (La relación señal-ruido es proporcional a la raíz cuadrada del número de transitorios.) Sin embargo, el tiempo de adquisición total de máxima dada en el protocolo anterior (20 - 30 min) debe ser suficiente para prácticamente todos los efectos, a menos que la cantidad de tejido disponible para la extracción es muy limitada. Además de hacer uso del núcleo más RMN-sensibles (protón), metabolomic 1 espectroscopia de RMN H tiene la ventaja de la ampliaestar disponible para diferentes intensidades de campo de bases de datos y valores de pH de la muestra 10. Además, el software para la evaluación automática o semi-automática espectro se ha convertido en disponible 10.
Mientras 1 H espectros de RMN de extractos de tejido puede ser bien resuelto sin la adición de agentes quelantes, esto ya no es cierto para 31 P espectros de RMN. De hecho, la concentración del agente quelante utilizado (por ejemplo, EDTA o CDTA) tiene una influencia significativa tanto en ancho de línea y desplazamiento químico de 31 señales de RMN P derivados de metabolitos fosforilados. El aumento de la concentración CDTA en un extracto disminuye 31 P NMR anchos de línea, pero esta ventaja puede ser compensado por menores diferencias entre los desplazamientos químicos, Δδ, de los picos vecinos. Por lo tanto, la cantidad de agente quelante usado tiene que ser optimizado para tanto ancho de línea y desplazamiento químico juntos. En los extractos de lípidos, estos dos parámetros espectrales son SIGNIFICAntly influenciado por la concentración total de la muestra, es decir, la cantidad de tejido extraído, sino también por el valor del pH y la temperatura de la muestra durante la medición de RMN. En consecuencia, cualquier optimización de las condiciones de medición debe tener en cuenta los efectos combinados de todos los parámetros experimentales implicados, algunos de estos no es aditivo. La complejidad de esta situación se ilustra por el comportamiento de los espectros de PL 31 P RMN muestra en la Figura 2. Aunque la concentración en el tejido más baja (118 mg / ml), la temperatura más baja (277 K) y la concentración más alta CDTA (1,000 mM) probaron daría como resultado más bajo ancho de línea, el protocolo sugerido recomienda el uso de concentración moderada de tejido (236 mg / ml), concentración intermedia CDTA (200 mM) y la temperatura ambiente (297 K) para evitar la superposición de la señal.
Aunque las condiciones de preparación de la muestra y la adquisición de espectro son de suma importancia, lapapel de los parámetros de procesamiento de espectro en extraer el máximo de información a partir de los datos brutos adquiridos no se debe subestimar. Un conjunto particular de parámetros de procesamiento de mi ser ideal para detectar y cuantificar PLs que se producen a bajas concentraciones; sin embargo, el mismo conjunto de parámetros puede oscurecer los picos individuales en regiones espectrales 'hacinamiento' (Figura 3, parte superior derecha). Por el contrario, los parámetros de procesamiento que ofrezcan una mejora de resolución óptima en las regiones de resonancias fuertemente superpuestos (Figura 3, parte inferior) harían que los picos de baja intensidad indetectable. Los acontecimientos recientes, entre ellos también un PL 31 P amplia base de datos de RMN 13,14, facilitan en gran medida el análisis de los espectros de RMN de 13,14.
En última instancia, los objetivos de la aplicación subyacente deben definir los criterios para la optimización, es decir, el equilibrio deseado de resolución espectral, sensibilidad, precisión de quantif metabolitoicación, velocidad, y otros factores. Por ejemplo, el sistema de una fase de análisis recomendado para PL permisos más fiable y eficiente de cuantificación PL de sistemas de dos fases (Figura 3, parte superior izquierda), y proporciona una alta resolución espectral, así como la sensibilidad suficiente para la cuantificación de menos abundantes PLs . Sin embargo, en los casos en que la mejor separación de la señal es de mucha mayor prioridad que la cuantificación eficaz y precisa, el uso de un mayor porcentaje de cloroformo-d en la mezcla disolvente se puede intentar, aunque esto conduce fácilmente a la separación de fases en la muestra. Si este es el caso, el volumen de la fase inferior se debe determinar para obtener cantidades absolutas PL (PL mg, por g de tejido o mg de proteína total).
En heteronucleares experimentos de RMN de protón desacoplado, intensidad de la señal pueden ser alterados por efectos Overhauser nuclear (NOE), además de la saturación debido a los planes de adquisición de los rápidos. Si no se corrige estos efectos resultan en qua metabolitoerrores ntitation. Hay dos estrategias alternativas para hacer frente a este desafío. En el primer enfoque, los transitorios individuales de una adquisición están separados por largas demoras. Este método evita cualquier saturación o NOE pero los resultados en experimentos relativamente largos; se debe utilizar si se requieren resultados precisos y exactos. En algunos casos, puede tener prioridad que debe darse a la adquisición de espectro rápido, en particular para muestras muy diluidas que sólo se pueden medir usando un alto número de transitorios. En tales casos, la adición de agentes de relajación paramagnéticas a la muestra permitiría la adquisición de datos rápida y sin saturación o NOE. Alternativamente, la adquisición de datos rápida y sin adición de agentes paramagnéticos se puede emplear. Este último método requiere la corrección de áreas de señal a través de los factores de corrección que deben determinarse para cada resonancia RMN, mientras que la presencia de agentes de relajación provoca cierta ampliación de señales de RMN que pueden reducir la precisión de la cuantificación de metabolitos deregiones espectrales de hacinamiento. Generalmente, la elección óptima de las condiciones experimentales no sólo está determinada por el tipo de muestra, sino también por la información que se extrae de un experimento 13. Si tiene alta prioridad que debe darse a un análisis rápido de más abundantes metabolitos, sin la necesidad de una alta precisión y exactitud, puede ser adecuada para medir muestras altamente concentradas y emplear tiempos de repetición cortos, posiblemente con agente de relajación paramagnética añade a la muestra. Por el contrario, si la cuantificación precisa de un gran número de metabolitos es más importante que la velocidad, es preferible utilizar extractos menos concentradas y aceptar largos tiempos de adquisición de RMN, como se demuestra por el protocolo presentado aquí. Además, si un proyecto de investigación particular, hace hincapié en metabolitos específicos, condiciones experimentales se pueden ajustar para lograr la resolución espectral óptimo para las regiones espectrales en cuestión. El protocolo y la discusión presentada aquí pueden servir como una guía para la Optimization de análisis metabolómico de extractos de tejido crudo por espectroscopía de RMN.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Virbac | Vetflurane | Anesthetic for animals |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda | Isotec 3 | Newer model available: Isotec 4 |
| Scalpel, scissors, forceps, clamps | Harvard Apparatus Fisher Scientific |
various various |
Surgical equipment for animals |
| Freeze-clamp tool | homebuilt | n/a | Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling |
| Dewar | Nalgene | 4150-4000 | |
| Liquid nitrogen | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen gas | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen evaporator | Organomation Associates | N-EVAP 111 | Can be replaced by homebuilt device |
| Mortar | Sigma-Aldrich | Z247472 | |
| Pestle | Sigma-Aldrich | Z247510 | |
| Tissue homogenizer | Kinematica | Polytron | With test tubes fitting homogenizer shaft |
| Electronic scale | Sartorius | n/a | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M3641 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 366910 | |
| Glass centrifuge tubes | Kimble | 45500-15, 45500-30 | Kimax 15 ml, 30 ml tube |
| Microcentrifuge tubes | Kimble | 45150-2 | Kimax 2 ml tube; should replace "Eppendorf" tube if compatible with centrifuge rotor |
| Polystyrene pipettes | Costar Corning | Stripettes | 5 and 10 ml volumes |
| Deuterochloroform | Sigma-Aldrich | 431915 | 99.96% deuterated |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 423459 | 99.96% deuterated |
| Deuterium chloride | Alpha Aesar | 42406 | 20% in deuterium oxide |
| Sodium deuteroxide | Sigma-Aldrich | 164488 | 30% in deuterium oxide |
| Lyophilizer | Christ | Alpha 1-2 | |
| Cold centrifuge | Heraeus | Megafuge 16R | |
| pH meter | Eutech Cybernetics | Cyberscan | |
| CDTA | Sigma-Aldrich | D0922 | |
| Cesium hydroxide | Sigma-Aldrich | 516988 | |
| NMR tubes | Wilmad | 528-PP | |
| NMR stem coaxial insert | Sigma-Aldrich | Z278513 | By Wilmad |
| NMR pipettes | Sigma-Aldrich | Z255688 | |
| Pipettes | Eppendorf | Research | With tips for volumes from 0.5 to 1,000 μl |
| Pipet-Aid | Drummond | XP | |
| NMR spectrometer | Bruker | AVANCE 400 | including probe and other accessories |
| NMR software | Bruker | TopSpin 1.3 | newer version available: Topspin 3.2 |
| Water-soluble standard compounds | Sigma-Aldrich | various | |
| Phospholipid standard compounds | Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich |
various various various |
Source for plasmalogens, but may be <70 - 80% purity |
| Methylenediphosphonate | Sigma-Aldrich | M9508 | |
| TSP-d4 | Sigma-Aldrich | 269913 |
References
- Manger, P. R., et al. Is 21st century neuroscience too focused on the rat/mouse model of brain function and dysfunction. Front Neuroanat. 2, 5 (2008).
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