Использование белковых микрочипов, содержащих почти всю С. Cerevisiae протеом зондируют для быстрого объективной допроса тысяч белок-белковых взаимодействий в параллель. Этот метод может быть использован для белка-малая молекула, посттрансляционной модификации, и других анализов в высокой пропускной.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Исследование высокой плотности белковых Функциональные Microarrays для обнаружения белок-белковых взаимодействий
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Функциональный белок-микрочипов высокой плотности, содержащие ~ 4200 рекомбинантные белки дрожжей проверяются на киназы белок-белковых взаимодействий с использованием гибридного белка аффинной очистке дрожжи киназы, содержащий тег V5-эпитоп для считывания. Очищенный киназа получена через культуры штамма дрожжей, оптимизированной для производства белка с высоким копирования содержащего плазмиду, содержащую слитый киназы-V5 построить под GAL индуцируемого промотора. Дрожжи выращивали в средах с ограничительной нейтрального источника углерода в течение 6 ч, затем по индукции с 2% галактозы. Далее, культура собирают и киназы очищают с использованием стандартных аффинных хроматографических методов для получения высокоочищенного протеинкиназу для использования в анализе. Очищенный киназы разбавляют киназного буфера с соответствующим диапазоном для анализа и белковых чипов заблокированы до гибридизации с белком микрочипов. После гибридизации, массивы зондируют моноклональное V5 АнтибODY для идентификации белков, связанных с протеинкиназой V5. Наконец, массивы будут отсканированы с использованием стандартных микрочипов сканер, и данные извлекаются для анализа вниз по течению информатики 1,2, чтобы определить высокое доверие набор белковых взаимодействий для последующего утверждения в естественных условиях.
Введение
Необходимость проведения глобальных анализов биохимии белков и активность связывания в естественных условиях привело к разработке новых методов профилирования белок-белковых взаимодействий (ИЦП) и пост-трансляционные модификации целых протеомов 1,3-8. Белковые микрочипы изготавливаются в качестве функциональных белковых микрочипов с использованием полноформатных функциональные белки 4-6,8,9 или аналитических белковых микрочипов, содержащих антитела 10,11. Они разработаны, чтобы содержать высокой плотности белков, выстроенных на предметных стеклах с различными поверхностных химических для облегчения различных экспериментальных....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Зонд Подготовка
- Культура и очистить V5-киназы фьюжн зондов, используемых для изучения взаимодействий с другими белками следующим образом:
- Используйте недавно прожилками деформации Y258 дрожжей (MATa pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112), содержащий V5-слитый белок (выраженное с GATEWAY векторных pYES-DEST52). Используйте изолированный белок в качестве зонда на микрочипов. Плита дрожжи на синтетические полная-урацил (SC-Ура) / 2% декстроза / агар и растут при температуре 30 ° С в течение 3 дней с замороженной культуры (-80 ° С глицерин фондовом).
- Посев закваски (5-20 мл) от одной колонии и расти в течение ночи в Sc-Ura / 2% декстрозы ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Активность белок-белковое взаимодействие наблюдалось с помощью стандартного считывателя чип оценить Tda1-V5 протеинкиназы слитой конструкции в качестве приманки против белка функциональной микрочипов белка дрожжей, содержащего приблизительно 4,200 уникальную S. Cerevisiae GST-слитые белки. Кроме того допрос с программным обеспечением GenePix показал множество связывания события с различной интенсивностью. Сродство судить по градуированной интенсивности сигнала, полученного из моноклонального V5-флуорофора конъю.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол, представленные первоначально был выполнен с использованием 85 уникальных дрожжей белка белки киназы-V5 фьюжн сравнить активность связывания через отдельных и связанных семей дрожжи протеинкиназ в результате идентификации новых сетей киназы взаимодействия в естественных условиях 1. Как новая технология профилирования протеомного, развитие Высокая пропускная способность (ПВТ) скрининга с использованием белка протеомов микрочипов полагались на пептидных библиотек, и эукариотических и прокариот.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом от NIH. Анализы, показанные на рисунке 1, были выполнены доктором Джозефом Фазоло. Мы благодарим доктора Руи Чена за полезные комментарии.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Чашки Петри | VWR | NC-10747 | или аналогичная |
| Бакто дрожжевой экстракт | Difco | 0217-17 | |
| Бакто пептон | Difco | 0118-17 | |
| Бакто агар | Difco | 0140-01 | |
| Декстроза | Сигма | D9434 | |
| Рафиноза | Сигма | R0514 | |
| Галактоза | Sigma | G0750 | |
| Sc-Ura Пробирки | MP Bio 114410622 | ||
| для малых культур | VWR/Fisher | ||
| Большая колба Эрленмейера | VWR/Центрифуга Фишера | ||
| JA-10 роторная | |||
| центрифуга (500 мл) | |||
| Пробирка Falcon (50 мл) | VWR/Fisher | 21008-951 | |
| PBS Таблетки | Sigma | P4417 | |
| FastPrep Tubes (2 мл пробирка с завинчивающейся крышкой) | |||
| FastPrep Machine | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Цирконовые бусины | BioSpec | 11079105 | |
| Triton X100 | Sigma | P4417 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| Имидазол (рН = 7,4) | Sigma | I5513 | |
| PMSF | Sigma | 93482 | |
| Полный коктейль ингибиторов (без ЭДТА) | Roche | 11873580001 | |
| Коктейль ингибиторов фосфатазы 1 | сигма | P2850 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Твин-20 | Sigma | P1379 | |
| ATP | Sigma | A1852 | |
| Встряхивающий инкубатор (30&�; C) | |||
| Nickel Affinity Resin | Life Technologies | R901-01 | |
| G25 колонка | GE Life Sciences | 27-5325-01 | |
| Nutator | VWR/Fisher | ||
| SDS-PAGE Gel (NuPage) | Life Technologies | ||
| Coomassie Blue Stain | Life Technologies | ||
| Моноклональные антитела V5 | Life Technologies | R960-25 | |
| Alexa647 Меченые моноклональные антитела V5 | Life Technologies | 451098 | |
| белковые микрочипы Kit | Life Technologies | PAH0525013 | |
| Genepix Scanner | Molecular Devices | ||
| Lifter Slips | Thomas Scientific | http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/ | |
| Лизисный буфер: 0,1% Triton X-100, 0,5 мМ DTT, 2 мМ MgCl2, 500 мМ NaCl, 50 мМ имидазола (pH 7,4), полный коктейль ингибиторов протеазы; ЭДТА-free, Коктейль ингибиторов фосфатазы 1, 1 мМ PMSF (добавить непосредственно перед использованием) | Добавьте реагенты в 1x PBS (0,01 М фосфатный буфер, 0,0027 М хлорид калия, 0,137 М хлорид натрия; pH 7,4) для получения желаемого объема раствора лизиса | ||
| Блокирующий буфер: 1% бычий сывороточный альбумин (BSA), 0,1% Tween-20 | Добавьте реагенты в 1x PBS для получения желаемого объема блокирующего буфера | ||
| Зондовый буфер: 2 мМ MgCl2, 0,5 мМ DTT, 0,05% Triton X-100, 50 мМ NaCl, 500 мкм; М АТФ (для киназ), 1% БСА | Добавьте реагент к 1x PBS для получения желаемого объема зондового буфера | ||
| Промывочный буфер: 0,1% Triton X-100, 500 мМ NaCl, 0,5 мМ DTT, 50 мМ имидазол (pH 7,4), 2 мМ MgCl<суб>2 | Добавьте реагент в 1x PBS для получения желаемого объема зондового буфера | ||
| Буфер для элюирования: 0,1% Triton X-100, 0,5 мМ DTT, 2 мМ MgCl2, 500 мМ NaCl, 50 – 500 мМ имидазола (pH 7,4), Полный коктейль ингибиторов протеазы; ЭДТА-free, Коктейль ингибиторов фосфатазы 1, 1 мМ PMSF (добавить непосредственно перед использованием) | Прежде чем начать, важно отметить градиент концентрации имидазола (50 – 500 мМ) и создать отдельные пробирки для каждой концентрации (желательно создавать интервал с шагом 50 мМ). Добавьте реагент в 1x PBS для получения желаемого объема зондового буфера | ||
| 3x YEP +6% галактозы: Растворите 30 г дрожжевого экстракта и 60 г пептона в 700 мл H2O и автоклав. Добавьте 300 мл стерилизованной фильтром 20% галактозы (масс./об.) | Галактозу нельзя автоклавировать |
Ссылки
- Fasolo, J., et al. Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes. Genes. 25, 767-778 (2011).
- Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. ProCAT: a data analysis approac....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
