Introduction
腎臓は、身体からの体液の恒常性、血圧調節および廃棄物のろ過のために不可欠です。哺乳動物は怪我が分化した上皮細胞1-4を使用した後、既存のネフロンを修復することができますが、それらは予約済みの幹細胞5のプールを欠いているように見えるし、新しいネフロンデノボを形成することができません。哺乳類とは対照的に、成魚魚の成長および傷害6,7に応答をサポートするために、成人期を通じて新しいネフロンを形成することができます。ゼブラフィッシュ、 ゼブラフィッシュは 、臓器再生8-10の研究のための貴重なモデル生物であり、ヒトの腎臓の修復を操作するためのアプリケーションに強力な洞察を提供する可能性があります。 Tgは（Lhx1a：EGFP）導入遺伝子11は、しかし、機構が損傷rにlhx1a +細胞の応答を制御する、大人のゼブラフィッシュの腎臓12にネフロン前駆細胞のプールを標識することが示されています不明emain。
アミノグリコシドゲンタマイシンは、ヒト13における既知の腎毒性及び聴器毒性効果と広く使用されている抗生物質です。ゲンタマイシンの腹腔内注射は、魚6に急性腎損傷を誘導する確立された方法です。魚の模倣でこの傷害細管上皮や過剰摂取14ゲンタマイシンした後、ヒトに起こる糸球体の瘢痕化の損失。多くの新しいネフロンが生成され、同時に形成、増殖および分化の段階を経て進んでゲンタマイシン注射によってゼブラフィッシュにおける傷害を誘導することは、強力な、同期再生応答を誘導する便利な方法です。
このプロトコルは、外れ値を最小化するために非侵襲的な視覚的なスクリーニングプロセスを利用して大人のゼブラフィッシュの腎臓における堅牢性と再現性の損傷のための私達の方法を詳述します。私たちは、ゲンタマイシンとの損傷が、上皮腎臓組織と形式の死につながるという事実を利用しますその後、中腎管および排出腔に塊に蓄積し、尿細管円柱、のイオン。これらは、魚に渡され、水中で視覚的に観察することができます。これは、私たちはその後、さらなる実験のためにプールすることができる強力な非致死傷害、と魚をスクリーニングすることができます。これらは、実験のエンドポイントは、より均一で効率的なデータ収集と分析につながる達する前に死亡無傷魚または魚の数を最小限に抑えます。また、特別な装置や試薬は、この方法の費用対効果や学術や指導設定で使用するための適切なを作り、必要ありません。私たちの方法を使用して、ここでは、腎臓の再生にゲンタマイシン投与量の増大効果だけでなく、上昇した温度の影響を示します。
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Protocol
注：倫理の声明：すべての実験は、研究における動物使用のためのマサチューセッツ総合病院のガイドラインに従って行いました。
1.事前準備
- どのように多くの大人のゼブラフィッシュの6-12ヶ月のを傷つけるために決定します。必要とされるよりも10〜20％より多くの魚を傷つけることを計画。それらはほぼ同じ大きさであり、以下の遺伝的多様性を有するように可変性を最小限にするために、使用年齢は同じタンクで一緒に飼育魚の兄弟に一致しました。女性の魚が原因腹部の大容量に、男性の魚に比べて注入する方がはるかに簡単です。しかし、男性および女性は同様の結果を与えます。
- 初めての実験を行うときに、魚の特定の株について適切なゲンタマイシン投与量を決定するために、用量曲線をプロットします。ゲンタマイシンの純度がバッチ毎に変化するため、実験で使用する前にゲンタマイシンの各新しいバッチをテストします。適切な用量はexpressiを評価することによって決定されるべきですこのようなlhx1aとして傷害マーカーの上。 （ - D図1Aを参照してください）。
- ゲンタマイシン溶液を調製します。ゲンタマイシンストック溶液を-20℃に保存し、後の使用のために解凍することができます。例えば、0.5グラムの重さの魚で80ミリグラム/ kgの投与量（体重の80mgのゲンタマイシン/ kg）のために、便利な使用液としてリン酸緩衝生理食塩水でのゲンタマイシンの2 mg / mlのを準備します。これは魚に腹腔内注射のためのゲンタマイシンの20μLを提供しています。
注：一般的に、80〜120ミリグラム/ kgで適切であるかもしれないの40mg / kgという低い良好な結果が、投与量を達成します。ゲンタマイシンはまた、研究室の人員への危険な暴露を最小限にするために、溶液中に購入することができます。
注：高用量でのゲンタマイシンは、毒性であり得ます。粉末を計量する際、手袋とマスクを着用してください。 - 魚を麻酔するための0.016パーセントのトリカインの100mlの水を準備します。使用するまで4℃でpHを7と店に調整し、滅菌ミリQ水に溶解しトリカイン（4グラム/ 1 L）の25倍の在庫を準備します。 4メートルを希釈0.016パーセントの作業濃度用の魚の水100mlでL。
注：トリカインが取り扱う際は手袋を着用し、麻酔薬や皮膚刺激性です。 - 魚がスクープ形状に電球をカットし、水を排出するために底部に2つのスロットを切断することにより、プラスチック転送ピペットのかき出すことを確認します。準備されたゲンタマイシン溶液と負荷（10μlの階調の）1ミリリットルの注射器と30½G針を取り付けます。任意の気泡を除去。針の角度のついた先端が離れて直面していると、シリンジのマーキングが前進し、読み取り可能で直面していることを確認するために、注射器の針をねじります。コントロール注射のために、滅菌PBSで注射器と針を準備します。
- 清浄な表面でスケールを準備したり、魚を乾燥させるために、注入のために魚を保持するためのボートだけでなく、紙タオルの重量を量ります。
- 観測一夜ポスト噴射のために魚を保持するための蓋と各小0.5リットルの容器を準備します。小さな透明プラスチック交配ケージは、この目的のために有用です。これらの容器は白であってはならない - 魚に当てる白色上皮キャストが黒の作業台の上に観察できるように、理想的に、彼らは明確にする必要があります。快適に泳ぐ魚のための十分な魚の水で各容器を満たします。
ゲンタマイシンの2腹腔内注射
- 魚の水中の0.016パーセントのトリカイン溶液に魚を麻酔。遅くする鰓換気率のために、もはや触れること応答しないために魚を待ちます。
- えらやフィンが負傷しないようにするために、ヘッドからテイルに向かって移動し、魚のスコップを使って魚をすくい上げます。その側で静かに魚を回して余分な水分を吸収し、スクープから余分な水分を振り払うためにペーパータオルの上に魚を置きます。
- 再び魚をすくい上げると、ゼロ化された規模で秤量ボートに置き、魚の重量を量ります。最寄りの0.25グラムにラウンドし、注入するゲンタマイシンの適切な量を計算します。
注：0.5グラムの魚のために8で20μlの注入を使用します0ミリグラム/ kgの用量。 - 再び魚をすくい上げるとドライ折り畳まれた紙タオルの上に置きます。右手を使用して注入する場合は、左の手にペーパータオルを保持し、簡単にアクセス腹で、左向きの魚の頭を置きます。
- 排出腔への腹の皮膚、前方に45°の角度で針と注射器を持ちます。角度を減少させ、内臓を避け、皮膚の下に前方に針をスライドさせ、皮膚のすぐ下に針を押してください。その後、針を撤回、液体が針の周りに出ていないことを確認する一時停止、プランジャ適量を押します。安定した魚を保持することは問題である場合は、それらを安定させるために胴体に対して肘を引き締めます。
注：ゲンタマイシン溶液を取り扱う際は手袋を着用してください。 - 個々の容器にそれぞれの魚をドロップします。魚を観察し、麻酔からの回復を確実。 28.5℃で魚を一晩おいてください。
注：魚はすぐに復活しない場合は、プラスチック製のトランスを使用それを復活させるために、その鰓を横切って水を灌漑するFERピペット。 - ゲンタマイシンの同じ用量で複数の魚を注入する際、同じ注射器と針を使用してください。適切なバイオハザードシャープコンテナに使用される注射器と針を処分。
傷害の3ポスト噴射観測
- 次の日（1日後の傷害）、暗い表面に、その容器内に注入された魚を置きます。負傷した魚によって排泄死んだ上皮組織のホワイトキャストが表示されるはずです。 （ 図1Eを参照してください- H）。何のキャストがない場合は、どちらかの魚がゲンタマイシン注射によりけがはなかった（投与量のいずれかが低すぎた、または射出プロセス中に漏れたゲンタマイシンの一部）や魚がひどく尿管および総排泄腔の完全な遮断をもたらす負傷しました酔っぱらった組織と。
注：魚は、その本体からキャストをクリアすることができない場合は、通常2〜3日以内に死亡し、長く、したがって使用できないでしょうアッセイ。何のキャストが表示されていない場合は、鰓の動きが停止した後、少なくとも10分間浸漬することによりトリカイン水中で魚を安楽死させます。 - 白色組織キャストが表示されている場合は、別に魚を設定し、他の魚のチェックを続け。ゲンタマイシンの適切な用量は、魚が使用可能であることの80〜90％になります。負傷した魚をプールした後、必要に応じて、異なる処理群に分割して。
魚の回収4.ケア
- きれいな水と混雑環境で魚を保管してください。汚れた水と混雑は感染症や意図しない死につながります。これ以上6以下の魚/魚の水500mlを維持し、可能な場合は、毎日水を変更してみてください。
注：これは、空間の保全のための最小量であるか、または研究者は、高価な薬物治療を用いた実験を行いたい場合。 - 3日は、損傷後まで魚を餌を与えないでください。魚を回収すること、最初は食べないし、タンク内のすべての食品は、細菌グラムを分解し、推進していきますowth。 3日目に開始すると、損傷後、一日一回、少量を養います。
負傷腎臓の5分析
- lhx1a mRNA発現のためのin situハイブリダイゼーションのために、腎臓は、所望の時点で魚から採取することができます。鰓の動きが停止するまで、次にかみそりの刃でヘッドを取り外して、体腔を開き、鉗子で内臓を除去し、氷、少なくとも10分にトリカイン水に魚を安楽死させます。
- 代わりに腎臓を残す（背側体壁に取り付けられた着色された臓器）、一晩PBS中の4％パラホルムアルデヒド中で魚を修正。腎臓15を解剖し、in situハイブリダイゼーション標準に進みます。
- 簡単に説明すると、室温で1時間、PBST中でプロテイナーゼK（10μg/ ml）で透過処理PBST（リン酸緩衝生理食塩水、0.5％のツイーン20）で腎臓を洗浄します。 4％パラホルムアルデヒドで後固定し、PBSTで再度洗浄しました。
- その後、68で一晩腎臓を事前ハイブリダイズ、ハイブリダイゼーション緩衝液（50％ホルムアミド、5×SSC、50μg/ mlのヘパリン、500 / mlのtRNAを、0.1％のTween20、pH6.0）で中°C。
- ハイブリダイゼーション緩衝液中でジゴキシゲニン標識プローブとサンプルをインキュベートし、その後、100％、75％、50％、68℃、25％ハイブリダイゼーション緩衝液で各々5〜10分間洗浄し、次いで、室温に移動しながら30分間、二回洗浄0.1％Tween20でSSCを2倍、0.1％Tween20で0.2×のSSCで30分間、二回洗浄します。
- MABのサンプル3×5分（0.1 Mマレイン酸、0.15 M塩化ナトリウム、pHは7.5）を平衡化し、10％ヤギ血清とMABに4℃で一晩ブロッキングしました。その後、抗ジゴキシゲニンAPのFab 1で一晩試料をインキュベート：MABで5,000。
- MABで1時間サンプル5回洗浄し、NTMTで15分（0.1MトリスpH9.5、0.05 MのMgCl 2、0.01 MのNaCl、50μLのトゥイーン20）のために3回平衡化。
- その後、信号を検出するためにNBT / BCIPで腎臓を治療します。 4％パラホルムアルデヒドで腎臓を修正し、レモするジメチルホルムアミド中でインキュベート脱イオン水に一晩漂白、過剰NBT / BCIP VEの。腎臓を洗浄した後、カバーガラス下で50％グリセロールでPBSTで撮影。
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Representative Results
ゲンタマイシン損傷は水に腎上皮キャストの観察（ 図1）によって視覚的に確認することができます。ゲンタマイシンの異なる投与量は、再生腎臓（ - D図1A）にlhx1a +細胞凝集体の数を増加させることで、その結果、成体野生型TuABゼブラフィッシュを傷つけるために使用されました。ホワイトキャストが容易に損傷後の水1日（ - H図1E）で見ることができます。高用量は、キャスト（ 図1I）を有する魚の75％をもたらしながら、ゲンタマイシンの低用量は、何のキャストを有していない、ほとんどの魚をもたらしました。すべてのグループでは、キャストと魚を選択することは、より高い平均損傷レベル（ 図1J）をもたらしました。
損傷の目視確認した後、魚をプールすることができ、その後の実験（ 図2）の制御および治療 群に分割します。野生型TuAB大人のゼブラフィッシュは80で負傷しましたゲンタマイシンのミリグラム/ kgの用量。損傷後のある日は、キャストとの魚は、選択されたプールされた後、熱ショックなし熱ショック群に分けました。ヒートショックの魚は16時間の一晩と28.5℃で、毎日で8時間の休息期間を37℃に曝露しました。 4日と7日後に損傷の魚でin situハイブリダイゼーションホールマウントのために固定し、損傷レベルはlhx1a +凝集体の密度によって評価しました。熱ショックだけでは傷害応答（ 図2A、D）を生成しませんが、熱ショックはない熱ショックのコントロール（ 図2B、C、G）に比べて損傷した魚のレスポンスを高速化します。 7日後損傷によって損傷した群（ 図E、F、H）との間に有意な差はもはやありませんでした。
<強い>図1：ゲンタマイシンによる急性腎障害に応じて、再生が用量依存性である（A - D）LHX 1 mRNAの発現は、新しいネフロン前駆細胞である細胞凝集体を、マーク。 （A）は 7日、制御腹腔内注射した後、野生型TuAB大人のゼブラフィッシュは、通常、腎臓全体で0-2 LHX 1aの +の細胞凝集体を持っています。 （B - D）7日ゲンタマイシン注入魚の表示後、多くのLHX 1aの +細胞凝集体、堅牢neonephrogenesis.This応答はよりLHX 1 A +クラスターの結果ゲンタマイシンの高い濃度で、用量依存的であることを示します。 （E - H）ゲンタマイシンの注射後1日、魚は腎臓から死んだ上皮組織からなる白キャストを排泄します。 （E）、様々な例を示す12、魚の合計からキャストのコレクション形や大きさ。赤橙色消化ブラインシュリンプに比べ損傷を示す白色のキャストの違いに注意してください。 （F - H）は、個々の魚から損傷後の1日を集めキャストの例として、タンク内の水を沈降させることにより、沈殿物をピペッティングし、顕微鏡下で観察します。 40ミリグラム/ kgの用量で処理した魚からの損傷がないことを示していないキャストと（F）糞、。 60ミリグラム/ kgの用量で処理した魚からの損傷を示す（G）中規模のキャスト。 （H）80ミリグラム/ kgの用量で処理した魚からの傷害を示す追加酔っぱらった組織と大きなキャスト。 （I）のキャストと負傷魚の割合は、60ミリグラム/ kgおよび80 mgの/ kgで増加しています。 7日後（J）は 、魚が損傷を評価するためのin situハイブリダイゼーションホールマウント用に処理した注射。lhx1a +凝集体は最も広い経口で撮影した単一の5倍の画像でカウントしました各腎臓および腎臓領域のINTは、ImageJのを使用して測定しました。凝集体の平均数は、/ mm 2で、各用量について示されています。それぞれのケースでは、キャストとの魚は各用量における全群よりも高い平均を持っていました。 P <80ミリグラム/ kgのに比べて40ミリグラム/ kgのための0.5。 AD = 0.2ミリメートル、E = 1ミリメートル、FH = 2ミリメートルでスケールバー。
図2：キャストとの温度依存再生ゲンタマイシン注射後24時間、負傷した野生型TuAB大人のゼブラフィッシュをプールした後、熱ショック群と無熱ショック群に分けました。魚は毎日中28.5℃で8時間の休息期間とその後毎晩16時間の一晩37℃で維持しました。 （A、D）制御が熱シ ョック後lhx1aを発現しなかった魚を無傷。 （B、C）熱SHOCKは複数のクラスタがすでに熱ショック（P <0.5、スチューデントのt検定）することなく、負傷した魚に比べ、損傷後4日目に登場すると、再生応答を高速化します。 （E、F）は、7日後に、熱ショックなしヒートショックで処理された損傷した魚の間に有意差は存在しません。 lhx1a + 1mm 2当たりの凝集体をカウントすることにより損傷の（G、H）の定量。各点は、個々の魚を表します。魚と平均応答の数は、各グループの上に示されています。スケールバー= 0.2ミリメートル。
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Discussion
ゼブラフィッシュは、大人の中腎腎臓6を含む成人の臓器の再生を研究するための理想的です。最近の研究では、より良いネフロンの再生中に発生するステップを特徴づけるために分子マーカーと新しいトランスジェニックレポーターラインを利用しているとどのような細胞が7,12責任を負うことがあります。尿円柱の観察は、ヒト16における腎疾患を診断するために一世紀以上にわたって使用されてきました。ここでは、ゲンタマイシン注射後の急性腎障害の程度を、簡単に非侵襲的かつ早期の指標としてキャストの存在を使用しています。私たちは、キャストはどちらかだけ穏やかに負傷している生成されません（と新しいネフロン形成していない）を回収したり、あまりにも負傷したが、通常は最初の3日以内に死亡している魚を観察します。そのため、プロトコル内の重要なステップは、損傷後の魚の個々の観測であり、尿の存在は、適切な損傷レベルの指標としてキャストします。また、lhx1a式を参照してください。骨材に損傷後4日目から始まります。これは、損傷後最初の3日間は、回復のための重要な時期であることを示しています。
魚の数が多い損傷していない場合、またはあまりにも多くの魚が実験の過程で死んでいる場合は、腹腔内注射が適切に行われていることを確認してください。これは、注入時の漏れを可視化するためにゲンタマイシン溶液に、フェノールレッドなどの無毒の染料を追加するのを助けることができます。永久マーカーまたは先端からテープ2mmの切れ端で針をマークすると、魚にすぎ針を押す防止するためのガイドとして機能することができます。さらに、ゲンタマイシンの投与量を調整する必要があるかもしれません。ゲンタマイシン投与量の範囲で魚を注入し、in situハイブリダイゼーションや定量的RT-PCR のいずれかによりlhx1a mRNA の発現のために腎臓をテストします。
この手法の限界は、それがために負傷した魚を選択する前に、ハウジングの個々の魚の一夜を必要とすることです実験。 （損傷後最初の24時間以内）の再生に非常に初期の事象を調査するために魚があっても、個々の観察期間中、継続的な実験的治療を受ける必要があるかもしれません。薬物との個々の魚の治療のコストは、例えば、非常に高くてもよいです。それは研究者は、非侵襲的、視覚的スクリーニング法を利用して異常値を除去することができるので、我々の技術は、ゲンタマイシンを用いた急性腎障害の既存の方法の改良です。この強固な、均一かつ再現可能な損傷モデルは、現在効果的に成体ゼブラフィッシュにおいて腎臓の再生についての仮説をテストするために使用することができます。
我々は、再生がオスとメスのゼブラフィッシュ（ここに示されている全てのデータは、女性からのものである）の両方で発生するが、男性のゲンタマイシン注射に応答して再生がはるかに可変であることを観察しました。女性ははるかに大きいBを持っていながら、自分の体は、長く薄く、より筋肉質であるので、これは、技術的な理由が原因である可能性がありエリー緩い、薄い皮膚に、漏れなく注入量を収容するために容易に注入し、大きな腹腔を可能にします。別の可能性は、男性によって生成アンドロゲンは、再生プロセス17に何らかの影響を有し得ることです。 Nachtrab らアンドロゲンの効果は、遺伝的背景は、アンドロゲンレベルを調節する可能性があることを示す、歪みに依存することを見出しました。我々の研究で使用されTuAB魚の遺伝的背景のわずかな変動は、男性に見られる多様性を説明するかもしれないが、おそらくアンドロゲンは、損傷に応答して、不均一性に寄与し得る変動や他の遺伝子座の唯一の情報源ではありません。また、ゼブラフィッシュの異なるトランスジェニック系統は、ゲンタマイシン傷害に対して異なる応答を得ることを見出しました。例えば、Tgは（Lhx1a：GFP）私たちの手の中に12行が傷害の効率的な誘導に120ミリグラム/ kgのを必要とする（データは示さず）。これらの観察は、同性の同胞を使用することの重要性を強調しますリングは、実験の変動を最小限にするために、損傷試験で制御します。
多くのゼブラフィッシュのトランスジェニック系統は、導入遺伝子の発現を誘導するための手段として、熱ショック感受性プロモーターを使用しています。ゼブラフィッシュは、変温であり、それらの体温を調節していないので、それらは、それらの環境の温度の生理的機能を実行するように強制されます。再生応答を調節する支配的な導入遺伝子を発現するためにHSP70プロモーターを用いた実験の文脈では、我々は、予想外に、再生反応は、より高い温度で加速されたことを観察しました。したがって、与えられたシステムで再生応答に対する温度の影響を決定する（例えば再生応答のピークを捕捉）した実験のタイミングを計画するために重要となり、問題の常温での再生との比較を行います。導入遺伝子の誘導のためにインスタンスCreERTとタモキシフェンのために使用して他の誘導システムは、より適しTであってもよいです成人の腎臓再生のOの研究。同様に、細菌ニトロレダクターゼ/メトロニダゾール18,19を使用して、このような毒性の導入遺伝子または誘導性傷害のCreERTの活性化などの損傷誘導の新しい遺伝的方法は、より良いneonephrogenesisと腎臓の再生を把握することが可能と実験の範囲を広げるだろう。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentamicin sodium sulfate | Sigma | G1264 | TOXIC, purity varies from batch to batch |
| plastic transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | |
| 1 ml Norm-Ject syringes | Electron Microscopy Sciences | 72520 | green plastic syringes, ordinary 1 ml syringes are OK, but harder to read accurately |
| 30 G1/2 needles | Becton Dickinson | 305106 | |
| ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine) | Sigma | A5040 | IRRITANT |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make 4% in 1x PBS for working solution |
References
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