Introduction
गुर्दे शरीर से तरल पदार्थ समस्थिति, रक्तचाप विनियमन और कचरे के छानने का काम के लिए आवश्यक है। स्तनधारियों चोट विभेदित उपकला कोशिकाओं 1-4 उपयोग करने के बाद मौजूदा नेफ्रॉन मरम्मत करने में सक्षम हैं, वे सुरक्षित स्टेम कोशिकाओं 5 का एक पूल की कमी करने लगते हैं और नए नेफ्रॉन डी नोवो फार्म करने में असमर्थ रहे हैं। स्तनधारियों के विपरीत, वयस्क मछली चोट 6,7 करने के लिए मछली की वृद्धि और जवाब में समर्थन करने के लिए वयस्क जीवन भर नए नेफ्रॉन बनाने में सक्षम हैं। zebrafish, देनियो rerio, अंग उत्थान 8-10 के अध्ययन के लिए एक अमूल्य मॉडल जीव है और मानव गुर्दे की मरम्मत इंजीनियरिंग के लिए आवेदन पत्र में शक्तिशाली अंतर्दृष्टि प्रदान करने की क्षमता है। टीजी (Lhx1a: EGFP) transgene 11 हालांकि, वयस्क zebrafish गुर्दे की 12 में चोट अनुसंधान करने के लिए + कोशिकाओं lhx1a की प्रतिक्रिया को नियंत्रित तंत्र नेफ्रॉन मूल कोशिकाओं का एक पूल लेबल करने के लिए दिखाया गया हैयह स्पष्ट नहीं emain।
aminoglycoside gentamicin मनुष्यों 13 में ज्ञात nephrotoxic और ototoxic प्रभाव के साथ एक व्यापक रूप से इस्तेमाल एंटीबायोटिक है। Gentamicin की intraperitoneal इंजेक्शन मछली 6 में तीव्र गुर्दे की चोट उत्प्रेरण की स्थापना की एक विधि है। मछली mimics में इस चोट ट्यूबलर उपकला और अधिक मात्रा 14 gentamicin के बाद मनुष्यों में पाया जाता है कि ग्लोमेरुली के scarring का नुकसान। Gentamicin इंजेक्शन द्वारा zebrafish में चोट उत्प्रेरण का उत्पादन कई नए नेफ्रॉन के साथ, एक मजबूत, तुल्यकालिक उत्थान प्रतिक्रिया उत्प्रेरण और एक साथ गठन, प्रसार और भेदभाव के चरणों के माध्यम से आगे बढ़ने का एक सुविधाजनक तरीका है।
इस प्रोटोकॉल outliers के लिए कम से कम करने के लिए एक noninvasive दृश्य जांच प्रक्रिया का उपयोग करके वयस्क zebrafish गुर्दे में मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चोट के लिए हमारे विधि का विवरण है। हम gentamicin साथ चोट उपकला गुर्दे ऊतक और प्रारूप की मौत हो जाती है कि इस तथ्य का लाभ उठाफिर मेसोनेफ्रिक नलिकाएं और क्लोअका में आम जनता में जमा है, जो गुर्दे ट्यूबलर डाले, के आयन। ये मछली द्वारा पारित कर रहे हैं और पानी में नेत्रहीन मनाया जा सकता है। यह हमें आगे तो प्रयोग के लिए जमा किया जा सकता है, जो मजबूत nonlethal चोट, साथ मछली के लिए स्क्रीन करने के लिए अनुमति देता है। वे प्रयोग के समापन बिंदु अधिक समान और कुशल डेटा संग्रह और विश्लेषण करने के लिए सुराग तक पहुंचने से पहले मर जाते हैं कि रिहाई मछली या मछली की संख्या कम से कम। इसके अलावा, कोई विशेष उपकरणों या अभिकर्मकों एक अकादमिक या शिक्षण की स्थापना में इस्तेमाल के लिए इस विधि लागत प्रभावी और उचित है, जिससे आवश्यक हैं। हमारे विधि का प्रयोग, यहाँ हम गुर्दे उत्थान पर gentamicin खुराक की बढ़ती प्रभाव के साथ ही तापमान में वृद्धि का असर दिखा।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
नोट: आचार कथन: सभी प्रयोगों अनुसंधान के क्षेत्र में पशु उपयोग के लिए मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल के दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया।
1. अग्रिम तैयारी
- कितने वयस्क zebrafish 6-12 महीने पुरानी घायल निर्धारण करते हैं। योजना की जरूरत होगी की तुलना में 10-20% अधिक मछली को घायल करने के लिए। परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, उपयोग उम्र में वे लगभग एक ही आकार के होते हैं और कम आनुवंशिक परिवर्तनशीलता इतनी है कि एक ही टैंक में एक साथ पाला भाई मछली मिलान नहीं हुआ। महिला मछली की वजह से पेट की बड़ी क्षमता के लिए, नर मछली की तुलना में इंजेक्षन करने के लिए बहुत आसान कर रहे हैं। हालांकि, पुरुषों और महिलाओं को समान परिणाम दे।
- पहली बार के लिए प्रयोग कर रही है, मछली की एक विशिष्ट तनाव के लिए उपयुक्त gentamicin खुराक निर्धारित करने के लिए एक खुराक वक्र साजिश है। Gentamicin की पवित्रता बैच बैच से भिन्न होता है, क्योंकि प्रयोगों में उपयोग करने से पहले gentamicin के प्रत्येक नए बैच का परीक्षण करें। उचित खुराक expressi का आकलन करने से निर्धारित किया जाना चाहिएऐसे lhx1a के रूप में चोट मार्करों के पर। (- डी चित्रा 1 ए देखें)।
- Gentamicin समाधान तैयार है। Gentamicin शेयर समाधान -20 डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत और बाद में उपयोग के लिए thawed किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, 0.5 ग्राम वजन एक मछली में एक 80 मिलीग्राम / किग्रा खुराक (bodyweight के 80 मिलीग्राम gentamicin / किग्रा) के लिए एक सुविधाजनक काम समाधान के रूप में फॉस्फेट बफर खारा में gentamicin के 2 मिलीग्राम / एमएल तैयार करते हैं। इस मछली में intraperitoneal इंजेक्शन के लिए gentamicin के 20 μl प्रदान करता है।
नोट: सामान्य में, 80-120 मिलीग्राम / किग्रा उपयुक्त हो सकता है 40 मिलीग्राम / किग्रा के रूप में के रूप में कम अच्छा परिणाम है, लेकिन खुराक प्राप्त करने के। Gentamicin भी प्रयोगशाला कर्मियों के लिए खतरनाक जोखिम को कम करने के लिए समाधान में खरीदा जा सकता है।
नोट: उच्च मात्रा में Gentamicin विषाक्त हो सकता है। दस्ताने पहनें और पाउडर वजन जब मुखौटा। - मछली anesthetizing के लिए 0.016% tricaine पानी की 100 मिलीलीटर की तैयारी। उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर पीएच 7 और स्टोर करने के लिए समायोजित बाँझ MilliQ पानी में भंग tricaine (4 जी / 1 एल) के एक 25x स्टॉक तैयार करें। 4 मीटर पतला0.016% की एक काम एकाग्रता के लिए मछली पानी की 100 मिलीलीटर में एल।
नोट: जब से निपटने Tricaine एक संवेदनाहारी और त्वचा अड़चन है, दस्ताने पहनते हैं। - एक मछली एक स्कूप आकार में बल्ब काटने और पानी के निकास के लिए नीचे में 2 स्लॉट काटने से एक प्लास्टिक हस्तांतरण pipet के बाहर निकालना बनाओ। तैयार gentamicin समाधान के साथ (10 μl ग्रेडेशन के साथ) लोड 1ml सीरिंज और एक 30½ जी सुई देते हैं। किसी भी हवाई बुलबुले निकालें। सुई पर angled टिप दूर का सामना करना पड़ रहा है और सिरिंज चिह्नों आगे और पठनीय सामना कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए सिरिंज पर सुई ट्विस्ट। नियंत्रण इंजेक्शन के लिए, बाँझ पीबीएस के साथ एक सिरिंज और सुई तैयार करते हैं।
- एक साफ सतह के साथ पैमाने तैयार है या मछली सुखाने के लिए और इंजेक्शन के लिए मछली पकड़ के लिए नाव के रूप में अच्छी तरह से कागज तौलिए तौलना।
- अवलोकन रातोंरात पद इंजेक्शन के लिए मछली पकड़ के लिए lids के साथ अलग-अलग छोटे आधा लीटर कंटेनर तैयार करें। लघु पारदर्शी प्लास्टिक संभोग पिंजरों इस उद्देश्य के लिए उपयोगी होते हैं। इनकंटेनर सफेद नहीं होना चाहिए - मछली द्वारा बहाया सफेद उपकला डाले एक काले रंग की बेंच शीर्ष पर मनाया जा सकता है इतना है कि आदर्श रूप में वे स्पष्ट होना चाहिए। मछली आराम करने के लिए तैरने के लिए पर्याप्त मछली पानी के साथ प्रत्येक कंटेनर भरें।
Gentamicin 2. intraperitoneal इंजेक्शन
- मछली पानी में 0.016% tricaine समाधान में मछली anesthetize। धीमा करने के लिए गिल वेंटिलेशन दर के लिए और अब छूने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए मछली के लिए प्रतीक्षा करें।
- गहरे नाले या पंख घायल से बचने के क्रम में पूंछ की ओर सिर से चलती है, मछली स्कूप का उपयोग कर मछली निकालना। उसकी तरफ से धीरे मछली बाहर मोड़ से अतिरिक्त पानी को अवशोषित और स्कूप से अतिरिक्त पानी बंद मिलाने के लिए कागज तौलिए पर मछली रखें।
- फिर मछली स्कूप और चुना पैमाने पर तौलना नाव में जगह और मछली का वजन। निकटतम 0.25 छ दौर, और इंजेक्षन करने के लिए gentamicin की उचित राशि की गणना।
नोट: एक 0.5 ग्राम मछली के लिए 8 बजे एक 20 μl इंजेक्शन का उपयोग0 मिलीग्राम / किग्रा खुराक। - फिर मछली स्कूप और एक सूखी मुड़ा हुआ कागज तौलिया पर जगह है। दाहिने हाथ का उपयोग इंजेक्शन लगाने हैं, बाएं हाथ में कागज तौलिया पकड़ और पेट आसानी से सुलभ के साथ मछली के सिर, बाएं ओर इशारा करते हुए जगह है।
- क्लोअका को पेट की त्वचा, पूर्वकाल करने के लिए एक 45 डिग्री के कोण पर सुई के साथ सिरिंज पकड़ो। सिर्फ त्वचा के नीचे सुई धक्का, तो कोण कम होती है और आंतरिक अंगों से परहेज है, त्वचा के नीचे आगे सुई स्लाइड। फिर सुई वापस लेने, कोई तरल सुई के आसपास बाहर आ रहा है सुनिश्चित करने के लिए रोकते हैं, सवार उचित मात्रा में दबाना। मछली स्थिर रखने के लिए एक समस्या है, तो धड़ के खिलाफ ब्रेस कोहनी उन्हें स्थिर करने के लिए।
नोट: gentamicin समाधान जब से निपटने के दस्ताने पहनें। - एक व्यक्ति के कंटेनर में प्रत्येक मछली गिरा। मछली पालन और संज्ञाहरण से इसकी वसूली करता है। 28.5 डिग्री सेल्सियस पर मछली रात भर रखें।
नोट: मछली तुरंत पुनर्जीवित नहीं करता है, एक प्लास्टिक ट्रांस का उपयोगअपने गहरे नाले इसे फिर से जीवित करने के लिए भर fer pipet का पानी सिंचाई के लिए। - Gentamicin की एक ही खुराक के साथ कई मछली इंजेक्शन लगाने के लिए जब एक ही सिरिंज और सुई का प्रयोग करें। उपयुक्त Biohazard तेजधार कंटेनर में इस्तेमाल किया सिरिंज और सुई के निपटान के।
चोट के 3. पोस्ट इंजेक्शन अवलोकन
- अगले दिन (1 दिन के बाद चोट), एक अंधेरे सतह पर अपने कंटेनर में इंजेक्शन मछली जगह है। घायल मछली द्वारा उत्सर्जित मृत उपकला ऊतक के व्हाइट डाले दिखाई जानी चाहिए। (- एच चित्रा 1E देखें)। कोई डाले, अगर वहाँ रहे हैं या तो मछली gentamicin इंजेक्शन से घायल नहीं था (खुराक या तो बहुत कम था, या इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान लीक gentamicin से कुछ) या मछली गंभीर रूप से मूत्रवाहिनी और क्लोअका का पूर्ण रुकावट जिसके परिणामस्वरूप में घायल हो गया था sloughed ऊतक के साथ।
नोट: मछली यह आम तौर पर 2-3 दिनों के भीतर मर जाते हैं अपने शरीर से डाले साफ करने में असमर्थ है और लंबे समय तक के लिए इसलिए व्यर्थ हैassays के। कोई डाले दिखाई दे रहे हैं, तो गिल आंदोलन बंद हो जाता है के बाद कम से कम 10 मिनट के लिए डुबो कर tricaine पानी में मछली euthanize। - सफेद ऊतक डाले दिखाई दे रहे हैं, एक तरफ मछली सेट और अन्य मछली की जाँच जारी है। Gentamicin का एक उचित खुराक प्रयोग करने योग्य जा रहा है मछली का 80-90% का परिणाम देगा। घायल मछली पूल और फिर अगर वांछित अलग उपचार समूहों में विभाजित है।
उबर मछली 4. केयर
- साफ पानी और uncrowded वातावरण में मछली रखें। गंदे पानी और भीड़ में संक्रमण और अनायास ही मौत का कारण बन जाएगा। यदि संभव हो तो दैनिक पानी की कोई अधिक से अधिक 6 मछली / मछली पानी की 500 मिलीलीटर रखने के लिए और बदलने की कोशिश।
नोट: यह अंतरिक्ष के संरक्षण के लिए या अन्वेषक महंगी दवा उपचार का उपयोग प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए चाहता है तो एक न्यूनतम मात्रा है। - 3 दिन चोट पोस्ट तक मछलियों को खाना खिलाना मत करो। उबर मछली पर पहले खाने के लिए नहीं होगा, और टैंक में किसी भी खाद्य घुलना और बैक्टीरिया जीआर को बढ़ावा देंगेowth। 3 दिन में चोट पोस्ट शुरू, एक दिन में एक बार एक छोटी राशि खिलाओ।
घायल गुर्दे के 5. विश्लेषण
- Lhx1a mRNA अभिव्यक्ति के लिए स्वस्थानी संकरण में के लिए, गुर्दे वांछित timepoints पर मछली से काटा जा सकता है। गिल ने आंदोलन बंद हो जाता है जब तक बर्फ पर tricaine पानी में कम से कम 10 मिनट मछली Euthanize, तो एक धार के साथ सिर को हटाने और शरीर गुहा खुला और संदंश के साथ आंतरिक अंगों को हटा दें।
- जगह (पृष्ठीय शरीर दीवार से जुड़ी पिगमेंटड अंग) में गुर्दे छोड़ दो और रातोंरात पीबीएस में 4% paraformaldehyde में मछली तय कर लो। गुर्दे की 15 काटना और सीटू संकरण में मानक के साथ जारी है।
- संक्षेप में, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए PBST में proteinase कश्मीर (10 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ permeabilized PBST (फॉस्फेट बफर खारा 0.5% बीच 20), में गुर्दे धो लें। 4% paraformaldehyde के साथ पोस्ट-ठीक है, और PBST के साथ फिर से धोया।
- तब 68 में रात भर गुर्दे पूर्व संकरण; संकरण बफर (50% Formamide, 5x एसएससी, 50 माइक्रोग्राम / एमएल हेपरिन, 500 माइक्रोग्राम / एमएल टीआरएनए, 0.1% Tween20, पीएच 6.0) में डिग्री सेल्सियस।
- संकरण बफर में digoxigenin लेबल जांच के साथ नमूने सेते हैं, तो 68 डिग्री सेल्सियस पर 100%, 75%, 50%, 25% संकरण बफर के साथ 5-10 मिनट के लिए प्रत्येक धोने, तो कमरे के तापमान में ले जाया गया और 30 मिनट के साथ के लिए दो बार धोने 2x 0.1% Tween20 साथ एसएससी, और 0.1% Tween20 साथ 0.2x एसएससी के साथ 30 मिनट के लिए दो बार धो लें।
- एमएबी में नमूना 3x 5 मिनट (0.1 एम Maleic एसिड, 0.15 एम NaCl, पीएच 7.5) और 10% बकरी सीरम के साथ एमएबी में 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात अवरुद्ध कर संतुलित करना। तो फिर विरोधी digoxigenin-एपी फैब 1 में रात भर नमूने सेते: 5,000 एमएबी में।
- एमएबी में 1 घंटे के लिए नमूना 5x धो लें, और NTMT में 15 मिनट (0.1 एम Tris pH9.5, 0.05 एम 2 MgCl, 0.01 एम NaCl, 50 μl Tween20) के लिए 3x संतुलित करना।
- तो संकेत का पता लगाने के लिए एनबीटी / BCIP साथ गुर्दे का इलाज। 4% paraformaldehyde के साथ गुर्दे को ठीक करें और रेमो को Dimethylformamide में incubatedविआयनीकृत पानी में रात भर प्रक्षालित एनबीटी / BCIP, अतिरिक्त कर दिया है। गुर्दे धो लें और फिर एक coverslip के तहत 50% ग्लिसरॉल के साथ PBST में तस्वीर।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gentamicin चोट पानी में गुर्दे की उपकला डाले अवलोकन (चित्रा 1) द्वारा नेत्रहीन पुष्टि की जा सकती है। Gentamicin के विभिन्न खुराकों regenerating गुर्दे में lhx1a + सेलुलर समुच्चय (- डी चित्रा 1 ए) की संख्या बढ़ती जा रही है, जिसके परिणामस्वरूप वयस्क wildtype TuAB zebrafish को घायल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। व्हाइट डाले आसानी से चोट के बाद पानी 1 दिन (- एच चित्रा 1E) में देखा जा सकता है। उच्च खुराक मछली होने डाले (चित्रा 1 मैं) के 75% से अधिक में हुई है, जबकि gentamicin के एक कम खुराक, कोई डाले होने सबसे मछली में हुई। सभी समूहों में डाले, साथ मछली के लिए चयन करने के लिए एक उच्च औसत चोट स्तर (चित्रा 1J) में हुई।
चोट के दृश्य पुष्टि के बाद, मछली जमा किया जा सकता है और उसके बाद के प्रयोगों (चित्रा 2) के लिए नियंत्रण और उपचार समूहों में विभाजित है। Wildtype TuAB वयस्क zebrafish एक 80 के साथ घायल हो गए थेमिलीग्राम / gentamicin किलो खुराक। चोट के बाद एक दिन, डाले के साथ मछली, चयनित जमा और फिर गर्मी सदमे और कोई गर्मी झटका समूहों में विभाजित किया गया। गर्मी झटका मछली 16 रातोंरात घंटा और 28.5 डिग्री सेल्सियस प्रत्येक दिन पर एक 8 घंटा बाकी अवधि के लिए 37 डिग्री सेल्सियस से अवगत कराया गया। 4 दिन और 7 दिनों के बाद चोट मछली पर सीटू संकरण में पूरे माउंट के लिए तय किया गया है और चोट स्तर lhx1a + समुच्चय के घनत्व के द्वारा मूल्यांकन किया गया था। गर्मी झटका अकेले एक चोट प्रतिक्रिया (2A चित्रा, डी) का उत्पादन नहीं करता है, लेकिन गर्मी झटका कोई गर्मी झटका नियंत्रण (चित्रा 2 बी, सी, जी) की तुलना में घायल मछली में प्रतिक्रिया accelerates। 7 दिनों तक चोट पद घायल समूहों (चित्रा ई, एफ, एच) के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर नहीं रह गया था।
<मजबूत> चित्रा 1: gentamicin द्वारा तीव्र गुर्दे की चोट के जवाब में पुनर्जनन खुराक पर निर्भर करती है (ए - डी) LHX 1 एक mRNA अभिव्यक्ति नई नेफ्रॉन पूर्वज हैं जो सेलुलर समुच्चय, निशान।। (ए) के नियंत्रण आईपी इंजेक्शन, wildtype TuAB वयस्क zebrafish के बाद 7 दिनों आम तौर पर 0-2 LHX 1 ए + पूरे गुर्दे में सेलुलर समुच्चय है। (बी - डी) 7 दिनों gentamicin इंजेक्शन मछली प्रदर्शन कई LHX 1 ए + सेलुलर समुच्चय के बाद, मजबूत neonephrogenesis.This प्रतिक्रिया का संकेत अधिक LHX 1 A + समूहों में जिसके परिणामस्वरूप gentamicin के उच्च सांद्रता के साथ, खुराक पर निर्भर करती है। (ई - एच) gentamicin के इंजेक्शन के बाद 1 दिन, मछली गुर्दे से मृत उपकला ऊतक से मिलकर सफेद डाले उगलना। (ई) किस्म दिखा 12 मछली की कुल से डाले का एक संग्रहआकृति और आकार के। लाल-नारंगी पचा नमकीन चिंराट की तुलना में चोट का संकेत सफेद डाले के बीच के अंतर पर ध्यान दें। (एफ - एच), व्यवस्थित करने के लिए टैंक में पानी की अनुमति के तलछट बाहर pipetting और एक खुर्दबीन के नीचे देख कर 1 दिन की चोट के बाद अलग-अलग मछली से एकत्र डाले के उदाहरण हैं। 40 मिलीग्राम / किग्रा खुराक के साथ इलाज एक मछली से कोई चोट का संकेत कोई डाले के साथ (एफ) मलमूत्र,। (जी) मध्यम 60 मिलीग्राम / किग्रा खुराक के साथ इलाज एक मछली से चोट का संकेत डाले आकार। (एच) के अतिरिक्त sloughed ऊतक 80 मिलीग्राम / किग्रा खुराक के साथ इलाज एक मछली से चोट का संकेत के साथ बड़ा डाले। (मैं) डाले के साथ घायल मछली का प्रतिशत 60 मिलीग्राम / किग्रा और 80 मिलीग्राम / किग्रा में वृद्धि हुई है। 7 दिनों के बाद (जे), मछली चोट का आकलन करने के लिए सीटू संकरण में पूरे माउंट के लिए प्रोसेस किया गया इंजेक्शन। Lhx1a + समुच्चय व्यापक पीओ पर लिया एक भी 5x चित्र में गिना रहे थेप्रत्येक गुर्दे और गुर्दे क्षेत्र के इंट ImageJ का उपयोग मापा गया था। समुच्चय की औसत संख्या / 2 मिमी प्रत्येक खुराक के लिए दिखाया गया है। प्रत्येक मामले में डाले, साथ मछली प्रत्येक खुराक पर कुल समूह की तुलना में एक उच्च औसत था। 80 मिलीग्राम / किलो की तुलना में पी <0.5 40 के लिए मिलीग्राम / किग्रा। ई = 0.2 मिमी में स्केल बार, ई = 1 मिमी, एफ एच = 2mm।
चित्रा 2:। डाले के साथ तापमान निर्भर उत्थान gentamicin इंजेक्शन के बाद 24 घंटा, घायल wildtype TuAB वयस्क zebrafish जमा और फिर एक गर्मी झटका समूह और एक नहीं, गर्मी झटका समूह में विभाजित किया गया था। मछली प्रत्येक दिन के दौरान 28.5 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटा रात भर के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के बाद एक 8 घंटा आराम की अवधि के साथ प्रत्येक रात में बनाए रखा गया। (ए, डी) नियंत्रण गर्मी सदमे के बाद lhx1a व्यक्त नहीं किया मछली रिहाई। (बी, सी) हीट श्रीock अधिक समूहों को पहले से ही घायल गर्मी झटका बिना मछली (पी <0.5, छात्र के टी परीक्षण) की तुलना में चोट के बाद 4 दिन पर प्रदर्शित होने के साथ उत्थान प्रतिक्रिया, accelerates। 7 दिनों के बाद (ई, एफ), गर्मी सदमे और कोई गर्मी के झटके के साथ इलाज किया घायल मछली के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर है। 2 मिमी प्रति lhx1a + समुच्चय की गणना के द्वारा चोट के (जी, एच) मात्रा। प्रत्येक बिंदु एक व्यक्ति मछली का प्रतिनिधित्व करता है। मछली और औसत प्रतिक्रिया की संख्या प्रत्येक समूह से ऊपर संकेत कर रहे हैं। स्केल बार = 0.2 मिमी।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
zebrafish वयस्क मेसोनेफ्रिक गुर्दे 6 सहित वयस्क अंगों के उत्थान के अध्ययन के लिए आदर्श है। हाल के अध्ययनों से बेहतर नेफ्रॉन उत्थान के दौरान हो कि चरणों चिह्नित करने के लिए आणविक मार्कर और नए ट्रांसजेनिक संवाददाता लाइनों का लाभ ले लिया है और 7,12 जिम्मेदार क्या कोशिकाओं हो सकता है। मूत्र डाले के अवलोकन से मनुष्य के 16 में गुर्दे की बीमारी का निदान करने में एक सदी से भी अधिक के लिए इस्तेमाल किया गया है। यहाँ हम gentamicin इंजेक्शन के बाद तीव्र गुर्दे की चोट की हद तक का एक आसान, noninvasive और जल्दी संकेतक के रूप में डाले की उपस्थिति का उपयोग करें। हम डाले या तो केवल हल्का घायल हो गए हैं उपज नहीं है (और नई नेफ्रॉन फार्म नहीं है) को ठीक करने के लिए या भी घायल हो गए और आम तौर पर पहले 3 दिनों के भीतर मर जाते हैं कि मछली पालन। इसलिए, प्रोटोकॉल के भीतर एक महत्वपूर्ण कदम चोट के बाद मछली की व्यक्तिगत टिप्पणी है, और मूत्र की उपस्थिति उचित चोट के स्तर के एक संकेतक के रूप में डाले। हम यह भी lhx1a अभिव्यक्ति देखनासमुच्चय में चोट के बाद 4 दिन में शुरू। इस चोट के बाद पहले 3 दिनों वसूली के लिए एक महत्वपूर्ण अवधि रहे हैं कि इंगित करता है।
मछली की एक बड़ी संख्या रिहाई कर रहे हैं, या बहुत अधिक मछली प्रयोग के दौरान मर रहे हैं, intraperitoneal इंजेक्शन ठीक से किया जा रहा है कि सुनिश्चित करने के लिए जाँच करें। यह इंजेक्शन के दौरान किसी भी रिसाव कल्पना करने के लिए gentamicin हल करने के लिए इस तरह के फिनोल लाल के रूप में एक nontoxic डाई जोड़ने के लिए मदद मिल सकती है। एक स्थायी मार्कर या सिरे से टेप 2 मिमी के एक टुकड़े के साथ सुई चिह्नित मछली में भी अभी तक सुई धकेलने को रोकने के लिए एक गाइड के रूप में सेवा कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, gentamicin की खुराक को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। Gentamicin खुराक की एक सीमा के साथ मछली इंजेक्षन और सीटू संकरण या मात्रात्मक आरटी पीसीआर में या तो द्वारा lhx1a mRNA की अभिव्यक्ति के लिए गुर्दे का परीक्षण करें।
इस तकनीक की एक सीमा है रात भर के लिए मछली घायल को चुनने से पहले यह आवास व्यक्ति मछली की आवश्यकता हैप्रयोग। मछली भी व्यक्ति अवलोकन अवधि के दौरान, निरंतर प्रयोगात्मक उपचार से गुजरना पड़ सकता है (चोट के बाद पहले 24 घंटे के भीतर) उत्थान में बहुत जल्दी घटनाओं की जांच करने के लिए। दवाओं के साथ अलग-अलग मछली के इलाज का खर्च, उदाहरण के लिए, बहुत अधिक हो सकती है। यह शोधकर्ता एक noninvasive दृश्य जांच प्रक्रिया का उपयोग करके outliers के खत्म करने के लिए अनुमति देता है, क्योंकि हमारी तकनीक, gentamicin का उपयोग करते हुए तीव्र गुर्दे की चोट की मौजूदा पद्धति पर एक सुधार है। यह मजबूत वर्दी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चोट मॉडल अब प्रभावी रूप से वयस्क zebrafish में गुर्दे उत्थान के बारे में परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
हम उत्थान (यहाँ दिखाए गए सभी डेटा महिलाओं से हैं) दोनों पुरुष और महिला zebrafish में होती है, हालांकि पुरुषों में gentamicin इंजेक्शन के जवाब में उत्थान और अधिक परिवर्तनशील है कि मनाया। महिलाओं के लिए एक बहुत बड़ा ख है, जबकि उनके शरीर, लंबे पतले और अधिक मांसपेशियों रहे हैं, क्योंकि यह तकनीकी कारणों की वजह से हो सकता हैआसान इंजेक्शन और रिसाव के बिना इंजेक्शन संस्करणों को समायोजित करने के लिए एक बड़ा पेरिटोनियल गुहा की इजाजत दी पराजित, पतली त्वचा के साथ Elly,। एक वैकल्पिक संभावना पुरुषों द्वारा उत्पादित एण्ड्रोजन उत्थान प्रक्रिया 17 पर कुछ असर पड़ सकता है। Nachtrab एट अल। एण्ड्रोजन के प्रभाव आनुवंशिक पृष्ठभूमि एण्ड्रोजन के स्तर मिलाना हो सकता है कि जो इंगित करता है, तनाव निर्भर था पाया। हमारे अध्ययन में इस्तेमाल TuAB मछली की आनुवंशिक पृष्ठभूमि में मामूली बदलाव पुरुषों में देखा परिवर्तनशीलता व्याख्या हो सकती है, लेकिन शायद एण्ड्रोजन चोट के जवाब में विविधता के लिए योगदान कर सकते हैं भिन्नता और अन्य आनुवंशिक लोकी का एकमात्र स्रोत नहीं हैं। हम यह भी zebrafish के विभिन्न ट्रांसजेनिक लाइनों gentamicin चोट करने के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया हो सकती है कि मिल गया है। उदाहरण के लिए, टीजी (Lhx1a: GFP) के हमारे हाथ में 12 लाइन चोट के कुशल शामिल करने के लिए 120 मिलीग्राम / किग्रा की आवश्यकता है (डेटा) नहीं दिखाया। इन टिप्पणियों ही सेक्स एसआईबी का उपयोग कर के महत्व पर प्रकाश डालालिंग प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को कम करने की चोट के अध्ययन में नियंत्रित करता है।
कई zebrafish ट्रांसजेनिक लाइनों एक transgene की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए एक साधन के रूप में एक गर्मी झटका संवेदनशील प्रमोटर का उपयोग करें। Zebrafish poikilothermic कर रहे हैं और उनके शरीर के तापमान को नियंत्रित नहीं करते हैं, वे अपने वातावरण के तापमान पर शारीरिक कार्य करने के लिए मजबूर कर रहे हैं। उत्थान प्रतिक्रिया मिलाना प्रमुख ट्रांसजीन व्यक्त करने के लिए hsp70 प्रमोटर का उपयोग करते हुए प्रयोगों के संदर्भ में, हम अप्रत्याशित रूप से उत्थान प्रतिक्रिया उच्च तापमान के द्वारा त्वरित किया गया था कि मनाया। इसलिए, एक दिया प्रणाली में उत्थान प्रतिक्रिया पर तापमान के प्रभाव का निर्धारण करने के प्रयोगों के समय (उदाहरण के लिए उत्थान प्रतिक्रिया के शिखर पर कब्जा) योजना के लिए महत्वपूर्ण हो जाता है और समस्याग्रस्त सामान्य तापमान पर उत्थान की तुलना में आता है। Transgene शामिल करने के लिए उदाहरण CreERT के लिए उपयोग कर और tamoxifen अन्य inducible सिस्टम बेहतर अनुकूल टी हो सकता हैवयस्क गुर्दे उत्थान के हे अध्ययन करता है। इसी तरह, संभव प्रयोगों की श्रृंखला व्यापक होगा बैक्टीरियल nitroreductase / metronidazole 18,19 का उपयोग करते हुए इस तरह के जहरीले ट्रांसजीन या inducible चोट के CreERT सक्रियण के रूप में चोट प्रेरण के नए आनुवंशिक तरीकों को बेहतर neonephrogenesis और गुर्दे उत्थान को समझने के लिए।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentamicin sodium sulfate | Sigma | G1264 | TOXIC, purity varies from batch to batch |
| plastic transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | |
| 1 ml Norm-Ject syringes | Electron Microscopy Sciences | 72520 | green plastic syringes, ordinary 1 ml syringes are OK, but harder to read accurately |
| 30 G1/2 needles | Becton Dickinson | 305106 | |
| ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine) | Sigma | A5040 | IRRITANT |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make 4% in 1x PBS for working solution |
References
- Humphreys, B. D., et al. Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).
- Humphreys, B. D., et al. Repair of injured proximal tubule does not involve specialized progenitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9226-9231 (2011).
- Guo, J. K., Cantley, L. G. Cellular maintenance and repair of the kidney. Annu Rev Physiol. 72, 357-376 (2010).
- Cirio, M. C., de Groh, E. D., de Caestecker, M. P., Davidson, A. J., Hukriede, N. A. Kidney regeneration: common themes from the embryo to the adult. Pediatr Nephrol. , (2013).
- Little, M. H., Bertram, J. F. Is there such a thing as a renal stem cell. J Am Soc Nephrol. 20, 2112-2117 (2009).
- Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T.
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Dev Biol. 320, 161-174 (2008).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124, 218-229 (2007).
- Swanhart, L. M., et al. Characterization of an lhx1a transgenic reporter in zebrafish. Int J Dev Biol. 54, 731-736 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-100 (2011).
- Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2011).
- Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288, F923-F929 (2005).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A.
- Fogazzi, G. B., Cameron, J. S. Urinary microscopy from the seventeenth century to the present day. Kidney Int. 50, 1058-1068 (1996).
- Nachtrab, G., Czerwinski, M., Poss, K. D. Sexually dimorphic fin regeneration in zebrafish controlled by androgen/GSK3 signaling. Curr Biol. 21, 1912-1917 (2011).
- Zhou, W., Hildebrandt, F. Inducible podocyte injury and proteinuria in transgenic zebrafish. J Am Soc Nephrol. 23, 1039-1047 (2012).
- Huang, J., et al. A zebrafish model of conditional targeted podocyte ablation and regeneration. Kidney Int. 83, 1193-1200 (2013).
