Summary
物品を効率よく選択的に集団の均質性および同一性を評価するための基準マーカーのフローサイトメトリー分析を行っWnt経路を変調することにより、心筋細胞へのヒト多能性幹細胞を分化するための詳細な方法論を記載している。
Abstract
、損傷した心臓を修復する心臓毒性作用を持っていない新しい治療薬を発見し、かつ正確に心臓病をモデル化するための戦略を改善するためのアプローチを開発する緊急の必要性がある。これらのアプリケーションのための「皿に「心臓の筋肉を生成するために、人間の人工多能性幹細胞（hiPSC）技術を悪用する可能性が高い熱意を生成し続ける。近年、効率的にヒト多能性幹細胞（hPSCs）から心筋細胞を生成する能力が大幅にくれないそうでなければアクセス可能な人間の心臓の開発の非常に初期段階をモデル化するための新たな機会を提供し、改善された。多くの以前の方法とは対照的に、心筋細胞分化プロトコルは、ここに記載した細胞凝集またはアクチビンAまたはBMP4の添加を必要とし、確実に心臓トロポニンIとT（TNNI3、TNNT2）のために非常に陽性である細胞の培養物を生成し、iroquois-ていませんクラスホメオドメインタンパク質IRX-4（IRX4）、ミオシン調節軽鎖2、心室/心筋アイソフォーム（MLC2v）とミオシン調節軽鎖2、すべてのヒト胚性幹細胞（hESCの）とhiPSC系統全体で一日10による心房アイソフォーム（MLC2aは）まで試験日付。細胞は、培養中で90日以上継代し、維持することができる。戦略は、技術的に実施が簡単で費用効果的である。多能性細胞由来の心筋細胞の特徴付けは、多くの場合、mRNAおよびタンパク質レベルの両方で、基準マーカーの分析を含む。タンパク質分析のために、フローサイトメトリー、培養中の細胞の質を評価し、亜集団の均一性を決定するための強力な分析ツールである。しかし、試料調製技術的変化が大幅にフローサイトメトリーデータの品質に影響を与えることができる。このように、染色プロトコルの標準化は、さまざまな差別化戦略間で比較を容易にするはずである。したがって、IRX4、MLC2v、MLC2a、TNNI3、およびTNNの分析のための染色プロトコルを最適化フローサイトメトリーによるT2が記載されている。
Introduction
ヒトES細胞およびhiPSC含むhPSCsから心筋細胞の生成は、機械論的研究のための他の方法でアクセスすることはできませんのステージへの洞察を提供する、非常に初期のヒトの心臓の発生過程のin vitroモデルとして機能することができる。このモデルシステムは、心臓系統のコミットメントと細胞運命の仕様を制御する分子経路を研究するためのユニークな機会を提供しています。近年、効率的hPSCsから心筋細胞を生成する能力が大幅1-15を改善した。しかしながら、プロトコルの中の細胞がチャンバ特異的マーカー（ 例えば 、心室および心房）を発現れる心筋細胞およびタイミングを生成する効率に対する細胞株の変動がある。理想的には、このモデルシステムの将来の応用のために、機能的に定義された細胞のより均一な集団が望まれている。以前の方法とは対照的に、ここで説明する心筋細胞分化プロトコルは、CEのを必要としないロバストLL集約またはアクチビンAまたは骨形成タンパク質4（BMP4）の添加とは、これまでに試験されたすべてのhESCおよびhiPSC行に渡って10日までに細胞TNNI3、TNNT2、IRX4、MLC2v、およびMLC2aための非常に肯定的な文化を生成します。戦略は、特に三次元の文化、大衆文化、または胚様体ベースの戦略4-9と比較して、実装するのは技術的に簡単であり、最近ではhPSCsに対する選択的な毒性を有する小分子（Boheler らを記述する研究で定義した。 ）65。このプロトコルの特徴は、Wntシグナル伝達（同様の、まだ1,2,7,13とは異なる）を調節するために小分子を用いて修飾されたhESCマトリックス（マトリゲル）の単層を用いて単層培養におけるhPSCsの分化、十分に規定された培地を含み、かつ分化効率及びセル識別の評価のための染色方法、最適化フローサイトメトリー。要約すると、これまでの報告に比べて、このプロトコルの利点は、その費用対effectivを含むeness、再現性、ヒトES細胞およびhiPSCラインを含む複数のHPSC線のうち心筋細胞を生成するための高効率。
フローサイトメトリー、培養中の細胞の質を評価し、亜集団の均一性を決定するための強力な分析ツールであり、適切な実験計画で、定量的測定を提供することができる。すべての抗体ベースの戦略と同様に、実験結果の正確な解釈は、準最適条件が著しく抗体の効率に影響を与えるような抗体濃度と固定および透過処理条件（細胞内抗原を標的とする）を含む、アッセイ設計の要素を慎重に各抗体について試験することを必要と、結果の解釈を結合し、したがって。定量が必要な場合、ポリクローナル抗体は、複数のエピトープを認識し、バッチ間の変動を受けやすいことができるように重要なのは、モノクローナル抗体は、不可欠である。現在、抗体の多様性（経口lyclonalおよびモノクローナル）および染色プロトコルが困難プロトコル1,2,9,11間の心筋の効率を比較すること、in vitroでの分化の評価のために記載されている。そのため、モノクローナル抗体は、すべてのフローサイトメトリー分析のために利用可能な場合に使用される。今後は、特に定量に関して、これらの染色プロトコルの標準化が、より良い差別化戦略間で比較を可能にするはずであることが期待される。
in vitroでの心筋の純度を評価するために使用されるマーカーの選択、およびその対応する抗体は、レポート間で変化する。 TNNT2は心筋運命にコミットした細胞の指標とみなされており、日常的に心臓分化プロトコルの効率を評価するために使用される。しかし、TNNT2も早くニワトリおよびラットの開発16,17の間に骨格筋で発現され、それはヒト平滑筋18中に存在するインビトロでヒト心筋の特異的なマーカーではありません。 MLC2vとMLC2a、日常それぞれ、心室と心房のサブタイプの代理マーカーとして使用されている。しかし、in vitroでの分化との関連で心筋細胞サブタイプを決定するために、MLC2vとMLC2aに頼るとの課題はこれらの遺伝子産物が心臓チューブから成人を通して、心臓の開発を通じて特定の室に限定されないかもしれないという事実から生じる。げっ歯類では心をループし、MLC2a mRNAは、心房/流入路エリアで支配的とMLC2v mRNAは心室/流出路領域において支配的である。ループ状の中心部に位置し、MLC2aとMLC2v mRNAの共発現は、流入管、房室運河、および流出路19,20において観察される。生後3日までに、MLC2v mRNAは、脳室に制限され、生後10日までに、MLC2aは新生児ラット心臓19の心房に制限されています。したがって、解釈心筋効率とサブタイプのアイデンティティに関するデータの参照マーカーレベルの存在と量を考慮しなければならないだけでなく、分析される分化の時点で対応するに発達段階（複数可）を考慮する必要があります。これはhPSCs のin vitro分化によって生成された心筋細胞の成熟段階が最も密接に、胚/胎児発生21〜25のものに類似していることを考えると、特に重要である。このように、出生後の心臓におけるマーカーの空間表現に頼ることは、少なくともいくつかのケースでは、HPSC由来細胞の評価に適しているとは限りません。
それは、ニワトリとゼブラフィッシュ15,20に胚発生を通して心筋に制限されているように、in vitroで心筋細胞のアイデンティティを定義するためのより具体的な基準の開発を促進するための努力では、TNNI3は、インビトロで心筋を評価するための貴重なマーカーであると考えられているそしてヒト胎児骨格筋26には存在しない。 TNNI1が人間の胎児の心臓に存在しているが、TNNI3は正常な成体心臓27,28で唯一TNNIアイソフォームが存在する。心筋細胞サブタイプの同一性に関して、IRX4 29-31は、心室の運命を有する細胞の有益なマーカーである。タンパク質レベルで、IRX4は最近、マウス32における新生児の段階を経て直線状の心臓チューブから心室に限定されることが示されている。従って、フローサイトメトリーによるTNNI3とIRX4の分析のための最適化された染色プロトコルが記載されている。われわれの知る限り、これはフローサイトメトリーによるヒト心筋細胞におけるIRX4レベルの効率的な抗体ベースの染色および分析のための方法の最初の記述である。
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Protocol
1。ソリューションとメディアの準備
- hESCの適格マトリックスコーティング原液
- ゆっくりと、4℃で一晩、氷上でのhESC資格のマトリックス（5ml）に解凍。予備冷却し、1.5ミリリットル滅菌マイクロチューブにアリコートを分配し、直ちに-20ºCで保管してください。
注：一定分量の体積を多くに基づいており、一般的に270から350μlの範囲によって異なります。メーカーは、ステップ2.1で説明したように25ミリリットルに希釈すると1倍濃度を達成するために必要な分量のボリュームに関する詳細を提供します。
- ゆっくりと、4℃で一晩、氷上でのhESC資格のマトリックス（5ml）に解凍。予備冷却し、1.5ミリリットル滅菌マイクロチューブにアリコートを分配し、直ちに-20ºCで保管してください。
- HPSCメディア証券ソリューション
- 特に断らない限り、希釈剤として超純水を使用してください。 0.22μmフィルターを使用してすべてのコンポーネントを滅菌する。 4ºCでバルク溶液として次のように格納します。重炭酸ナトリウム（75 mg / ml）を;クエン酸（10ミリモル、をpH = 3）。
- 0.2μmシリンジフィルターを使用してすべてのコンポーネントを滅菌し、-20ºCでアリコートとしてそれぞれ格納しますRhoキナーゼ（ROCK）阻害剤Y-27632（10DPBS中mMの、100μlのアリコート）; L-アスコルビン酸2 - リン酸（64 mg / mlの、500μlのアリコート）;亜セレン酸ナトリウム（70 / mlの、100μlのアリコート）;トランスフェリン（50 mg / mlで、107μlのアリコート）;線維芽細胞成長因子2（FGF2; DPBS、250μlのアリコート中の200 ngの/μl）を;トランスフォーミング増殖因子ベータ1（TGFβ1、冷たい10mMのクエン酸中に100ng /μL、10μlのアリコート）。
- HPSCメディアE8液組成
- 、L-アスコルビン酸2 - リン酸（500μL;最終：（; 500ミリリットルのL-グルタミンおよびHEPESを含む）、重炭酸ナトリウム（543 / mlの3.62ミリリットル最終）DMEM / F12：ステップ1.2で調製した一定分量を使用してメディアを準備します：64μg/ ml）を、亜セレン酸ナトリウム（100μL;最終：140 ng / mL）を、トランスフェリン（107μL;最終：10.7μg/ ml）を、インスリン（1ミリリットル;最終：20μg/ ml）を、FGF2（250 μlの;最終100 ng / mL）を、TGFβ1（10μlを、最後の2 / mlの）。
- 最大2週間、4℃で、すべてのコンポーネント、フィルター滅菌し、店舗を組み合わせる。
- ROCK阻害剤HPSCメディアE8
- 上記のように調製E8メディアの12ミリリットルに15μlのROCK阻害剤を加え、よく混ぜる。最終濃度がステップ3.7における細胞/培地の添加後に、10μMであることを確認してください。
- Wntシグナル調節因子の原液
- -20ºCで次のように分注して保管してください。 CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1 H -imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile; DMSO中の10mM、15μlのアリコート）。 IWR-1（4 - （ザインデン、4,7,7aヘキサヒドロ-1,3 - ジオキソ - 4,7 - メタノ-2H-イソインドール-2 - イル）-N-8-キノリニル - ベンズアミド; DMSO中の10mM、6μlのアリコート）。
- 分化培地
- 2％B27マイナスインスリンサプリメント（L-グルタミン）RPMI1640で分化培地＃1を準備します。
- 2％のB27を加えたインスリンサプリメント、2％FBSを（L-グルタミン）を含むRPMI 1640で分化培地＃2を準備します。
- 細胞洗浄溶液Fまたは細胞培養
- カルシウムまたはマグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）を使用します。
- フローサイトメトリー用の細胞洗浄液
- リン酸緩衝生理食塩水（カルシウムまたはマグネシウムを含まないPBSを、）を1％FBSを使用してください。 4ºCで保管してください。
- フローサイトメトリー用の細胞のメンテナンスソリューション
- 5％FBSを、ハンクス液（カルシウムまたはマグネシウムを含まないHBSS）を使用します。 4ºCで保管してください。
- フローサイトメトリー用固定ソリューション
- TNNI3とIRX4抗体に対する固定液としてのCytofixバッファを使用してください。
- TNNT2とMLC2a抗体に対する固定液として（新鮮にする）1×PBS中の4％パラホルムアルデヒドを使用してください。
- MLC2v抗体についての固定液として70％メタノール/ 30％アセトンを使用してください。
- 4ºCにすべてのソリューションを保存してください。
- フローサイトメトリー用透過処理ソリューション
- 透過処理液fとしてPhosflowパーマバッファーIIIを使用してくださいまたはTNNI3とIRX4抗体。室温（25℃）で保存してください。
- TNNT2、MLC2v、およびMLC2a抗体について透過処理液として1×PBS中の0.2％トリトンX-100を使用してください。 4ºCで保管してください。
- ブロッキング溶液
- 1×PBS中10％ヤギ血清を使用する。新鮮な作成し、使用するまで、4℃で保管してください。
2プレートコーティング
- ゆっくりと、30分間、4℃でのhESC修飾行列の1アリコートを融解し、冷却しDMEM / F12、25 mlに加えるとすぐに6ウェルプレートをコーティングする前に滅菌組織培養フード内でよく混合する。
- 滅菌組織培養フードの下で6ウェルプレートのウェルあたり1mlを加える（hESCの修飾された行列の1アリコートを、コート4つの6ウェルプレートに十分である）。
- ヒトES細胞資格の行列がフードの下室温で30分間に設定できるようにします。過剰のhESC資格のマトリックスを吸引し、各ウェルにROCK阻害剤E8培地の2ミリリットルを追加。すぐにプレートを使用するか、デス場合4℃でのIRED、店舗すぐに1週間までめっきした後、使用前に30分間室温に平衡化。
単層培養における未分化hPSCsの3継代とメンテナンス
- 6ウェルプレートで単層培養におけるhPSCsを維持し、滅菌組織培養フードの下にあるすべての手順を実行します。
- HPSCの十分に確立されている回線（> P20）を使用して、神経、epithelial-や線維芽細胞様の形態を有する細胞の存在なしに均質な形態を示す。ウェル当たり0.75×10 6で播種時の細胞が75％コンフルエンスで3日ごとに確実に増殖し、平均し、経過に確認してください。
- 少なくとも5倍で単一細胞レベルへの解離通路hPSCs最大の分化効率を確保するために、分化の開始に先立っ。通路hPSCsに、吸引E8媒体とは、1×DPBS（室温に予め温めておいた）4mlで細胞を2回洗浄する。セルデタッチの1ミリリットルを追加します。メントを各ウェルに溶液（室温に予め温めておいた）とセル境界がアップラウンドを開始するまで、3〜7分間よく乱さを残す。
- 細胞を取り除くと、DMEM / F12培地の1ミリリットルを含む15ミリリットルコニカルチューブに転送するために電球を綿差し込まガラスピペットを使用します（細胞剥離液を不活性化するため）。
- 細胞溶液の10μlアリコートを取り出し、マイクロチューブ内のパンブルー10μlのミックス。残りの細胞を室温で5分間、130×gで遠心分離によって収集している間に細胞（ 例えば自動または手動の血球計数器）を数える。総細胞数のすべての細胞数は、ベースこのプロトコルを使用して、自動化された血球計数器を使用し、今後70〜80％の生存率を期待する。
- 培地を吸引し、500μlのあたり0.75×10 6細胞の最終濃度にDMEM / F12細胞ペレットを懸濁します。
- 各ウェルcontai 6ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液を500μl添加ROCK阻害剤を用いたナノ秒2ミリリットルのE8メディア、ステップ2.3で調製した。ワークトップ上のプレートを残し、静かに均一にうまく渡って細胞を分散させるために、前面から背面へと横方向の運動で移動する。 5％CO 2、37ºCでインキュベーターにセルを返します。
- 継代24時間後に開始し、毎日のROCK阻害することなく、2ミリリットル/ウェルE8を使用してメディアを交換してください。分化開始前100％コンフルエンスを達成するために、播種密度を最適化します。シード0.75×10 6細胞/ウェル4日前に、分化の開始が、必要に応じ各細胞株について最適化する。
Wntシグナル経路の選択的調節によるhPSCsの4心筋細胞の誘導
- 日0-7中、毎日（2ミリリットル/ウェル）メディアを更新し、8日後に一日おきに。
- 0日目に、分化培地＃1 E8メディアを交換することによって、分化プロセスを開始する。各ウェルに1.2μlのCHIR（6μMの最終）を追加します。 1日目に繰り返します。
- 日2-3では、新鮮なdifferenと交換tiationメディア＃1。
- 4日目に、新鮮な分化培地＃1と交換してください。 1μlのIWR-1（5μMの最終）を各ウェルに加える。 5日目に繰り返します。
- 日6-7では、新鮮な分化培地＃1と交換してください。
- 8日目に、新鮮な分化培地＃2と交換してください。
- 分化培地＃2文化の所望の時間、一日おきに交換し続けてください。
- 必要に応じて、3.3から3.6で説明した手順に従うが、分化培地＃2とのメディアに置き換えて細胞剥離液を用いて通路心筋細胞。継代時には、〜3-10細胞の小さなクラスターに心筋細胞を解離する。うまく使ってヒトES細胞修飾マトリックスコートしたウェルおよび分化メディア＃2あたり〜6×10 5細胞シード。
フローサイトメトリー用の細胞の5集
- （ すなわち 、無菌ではない）実験台の段差5-9の残りのすべての側面を実行します。
- 吸引し増殖培地および1×PBSで2回細胞を洗浄する。各ウェルに（室温に予め温め）細胞剥離溶液1mlを加え、セル境界がアップを丸める始めるまで、3-7分間静置しておきます。細胞を取り除くし、氷上で15ミリリットルコニカルチューブに転送するために電球を綿プラグさホウケイ酸ガラス使い捨て9 "ピペットを使用してください。
- プロトコルの残りの部分では、氷上で細胞を維持して、4℃で5分間200×gで遠心分離を行う。
- 遠心分離および吸引液で細胞を回収する。細胞塊を確実にするために繰り返し磨砕で10ml血清用ピペットを用いて10 mlの細胞洗浄溶液中に再懸濁細胞を単一細胞に分散されている。残りの細胞を遠心分離によって収集されている間のステップ3.5のように細胞を数える。
- 細胞洗浄溶液中の細胞を再懸濁し、完全に細胞ペレット及び分量丸底チューブあたり1×10 6個の細胞を分解するために注意しながら。遠心分離および吸引液で細胞を回収する。
6。固定と細胞内抗原染色のために細胞の透過処理
- 細胞ペレットを100μlの固定液を加える。液滴ずつ連続穏やかにボルテックスで、次いで氷上で15分間に設定を追加します。
- 3ミリリットルの細胞洗浄溶液を追加します。遠心分離および吸引液で細胞を回収する。
- 細胞ペレットを100μlの透過処理溶液を加える。液を滴下し、30分間氷上で設定され、連続穏やかにボルテックスで追加します。 表1に各抗体について概説したように固定および透過条件を使用してください。
- 3ミリリットルの細胞洗浄溶液を追加します。遠心分離および吸引液で細胞を回収する。透過処理後の2回の洗浄の合計に対して、この手順を繰り返します。
| 一次抗体（Clone） | 免疫原/エピトープが認識 | Istotypeコントロール | 100μl中1×10 6個の細胞当たりの一次抗体 = "2"> 金額 | 固定液 | 透過処理ソリューション | 二次抗体 | 100μlの二次抗体の量/ 1×10 6個の細胞 | |
| パーセント肯定的な測定のために | 抗原定量化のための | |||||||
| TNNI3（284（19C7） | ISASRKLQL（ヒト） | マウスIgG2b | 1.0μgの | 3.0μgの | BDのCytofix | BD PhosflowパーマIII | ヤギ抗マウスIgG2b-のAlexa488 | 600 ngの |
| TNNT2（1C11） | 全長は、天然のヒトトロポニンTタンパク質を精製した。 | マウスIgG1 | 1.0μgの | 2.0μgの | 4％PFA1％PBS中 | 1％PBS中の0.2％トリトンX-100 | ヤギ抗マウスIgG1 - アレクサ488 | 600 ngの |
| MLC2v（330G5） | FDPEGKG | マウスIgG2a | 2.0μgの | 3.0μgの | 70％メタノール/ 30％アセトン | 1％PBS中の0.2％トリトンX-100 | ヤギ抗マウスIgG2a - アレクサ647 | 600 ngの |
| MLC2a（4E7） | Eに産生されたヒトMYL7の全長ヒト組換えタンパク質大腸菌の | マウスIgG1 | 0.5μgの | 3.0μgの | 1％PBS中の4％PFA | 1％PBS中の0.2％トリトンX-100 | ヤギ抗マウスIgG1 - アレクサ488 | 600 ngの |
| IRX4 | LQEHRKNP YPTKGEKI MLAIITKM TLTQVST | ウサギのIgG | 0.5μgの | 0.5μgの | BDのCytofix | BD PhosflowパーマIII | ヤギ抗-RAのIgG-PEをBBIT | 600 ngの |
表1抗体濃度。上場は、フローサイトメトリー解析のために使用される各一次および二次抗体に対する抗体、クローン（モノクローナルば）、最適化された濃度および固定および透過条件原発である。抗体ストック濃度が同じクローンのベンダー間で異なる可能性がありますが、最終的な固定されたアッセイ容量中で1×10 6個の細胞当たり各抗体の濃度ではなく、希釈液が提供される。抗体によって認識される抗体を生成するために使用される免疫原、またはエピトープは、製造業者によって提供されるように、リストされているが、実験的に、ここで検証されていませんでした。
7。抗体染色
- すべての実験のために、固定/透過処理条件及び使用される各一次抗体のための適切なアイソタイプコントロールごとに1つの非染色コントロールが含まれています。ネガティブコントロールとして、非心筋細胞の細胞型を含む（たとえば 、多能性幹細胞または線維芽細胞）。一次抗体の対応と同じ濃度のアイソタイプコントロールを使用します（ 表1参照）。
- 細胞を分解するためにP200ピペットを用いてブロッキング溶液100μl中に細胞を再懸濁する。穏やかに揺らしながら25分間氷上で設定したサンプル。
- ブロッキング溶液除去することなく、 表1にガイドラインに従って一次抗体またはアイソタイプコントロールを追加します。緩やかに揺り動かしながら、氷上で45分インキュベートします。
- 3ミリリットルの細胞洗浄溶液を追加します。遠心分離および吸引液で細胞を回収する。一次抗体標識後の2回の洗浄の合計のため繰り返します。
- 蛍光団結合一次抗体を使用した場合、8.1に進みます。非標識一次抗体（例えば、ここに記載される全てのマーカーのような）を使用する場合、次のようにフルオロフォアにコンジュゲートした二次抗体での標識を行う。
- DISAにP200ピペットを用いてブロッキング溶液100μl中に細胞を再懸濁ggregate細胞。
- 表1にガイドラインに従って、二次抗体を追加します。緩やかに揺り動かしながら氷上で30分間インキュベート。
- 3ミリリットルの細胞洗浄溶液を追加します。遠心分離および吸引液で細胞を回収する。二次抗体標識後の2回の洗浄の合計のため繰り返します。
フローサイトメトリー用の細胞の8。準備
- 細胞を分解するためにP1000ピペットを用いて400μlの細胞維持液中の細胞を再懸濁。
- 50μlの細胞維持液で事前に湿らせた丸底管上のセルストレーナーキャップを準備します。チューブを氷上に設定してください。フローサイトメーターを詰まら細胞凝集を防止するために、セルストレーナーキャップを使用してください。
- セルストレーナーキャップに細胞溶液を移し、細胞懸濁液は、重力によって排出させる。細胞はチューブに収集し、可能な限り迅速に氷上に戻って設定されるように、必要に応じて作業台の上に静かにチューブの底をタップします。そう250μlの細胞の維持とストレーナーをすすぐリューションは、細胞の最大回復を確実にする。
- 氷上で細胞を維持し、フローサイトメトリーで分析するまで、光から保護します。
9。フローサイトメトリー分析
詳細な取得の設定は楽器によって異なります。最適なデータ収集のために考慮すべき基本的なパラメータは以下の通りである。
- 最適なストリームの安定性のために、ノズルサイズは、セルの直径が分析されている5-6x超えていることを確認してください。
注：これは楽器によって異なりますがアナライザーおよび細胞選別のための適切なノズルサイズを選択することの両方が重要な考慮事項である場合があります。 10日目の心筋細胞の平均直径は（8-14ミクロンの範囲）は11μmである。したがって、アナライザの標準150μmの試料注入管が適しています。 - 細胞凝集体を分散させることが簡単にボルテックス各チューブ、データ分析の直前に。
- フォワード最適化に基づいて、各細胞型のための側方散乱電圧設定関心のある集団がスケール上にあり、（ 図2A）を中心とするように、実験に用いた各固定/透過処理条件の未染色コントロール。
- 一回の実験を通して、これらの設定を維持し、大幅なシフトは、フローサイトメーターまたは試料調製の潜在的な問題を示している可能性がある、同じ機器上で実験する実験から一貫している。
- 各フルオロフォアについては、アイソタイプ対照を分析し、ピークの左右両エッジを表示する蛍光ヒストグラムを得るために必要な最小強度を決定するために、適切なレーザー電圧を調整する。抗体染色サンプルを、対応する上でデータを取得する際、各アイソタイプコントロールのためのレーザーの設定を維持します。
注：信号がドリフトしばしば同じ楽器で時間をかけて行われます。これは、適切なアイソタイプコントロールに基づいて各実験の開始時にレーザーの設定を調整することが重要である。 - の最小値を収集10,000事象。 50,000件のイベントが好ましい。
- 統計分析のために、ゲートの破片（ 図2A）を除外するための生きた細胞集団。 図2B、Cに示すように、アイソタイプコントロールから≤2％の貢献を可能にするマーカー配置に基づいてゲートされ、集団内陽性細胞パーセントを決定します。
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Representative Results
0日目に、細胞は、コンパクト形態および最小の細胞破片100％コンフルエントである。 1-2日間で、それは有意な細胞死（40-50％）を観察することが一般的であるが、付着した細胞は、コンパクトな形態（ 図1A）を保持する。この間、培地は、オレンジ、濁っている。ピンク色のメディアは、過剰な細胞死を示し、この場合には、トリパンブルーで確認し、細胞死が70％を超える場合に中止する。細胞は日3-4中に回復すると密度が増加します。 5-6日間、最小限の細胞死が起こり、緻密なパッチが現れ始めることができる。日7-8により、密集単層は、緻密なパッチが点在する、コンパクトな形態で達成される。細胞は、自然発生的に一日8によって収縮し始めると最初の収縮は、多くの場合、高密度のパッチに表示されます。 10日目では、より堅牢な収縮が観察され、その後の日中の文化全体に広がっていきます。 α-アクチニンとTNNT2ショーサルコメア構造のための免疫細胞化学染色（ 図1A）。定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）によって測定されるように、中胚葉および心筋コミットメント表示時間プロファイルの基準マーカーのmRNAレベルは、心臓マーカーのホメオボックスタンパク質NKX-2.5（NKX2.5の強い発現を有する（ 図1B）予想通り）、TNNI3、MLC2a、MLC2v、およびミオシン-6（MYH6）。平滑筋（ミオシン重鎖11、MYH11）および骨格筋の非検出可能なレベルに非常に低い（ミオゲニン、MYOG）マーカーはルーチンがある。式はTNNI1とTNNI2が確実に日7-8中に検出されたアイソフォームトロポニン、成人20,27,28に骨格筋に限定される前に両方の心筋および骨格筋で観察される初期の開発と一致。
他の報告と一致して、このインビトロ差別化戦略は、初期の心臓前駆体の特性に心筋細胞を生成する（MLC2a、MLC2vの共発現、形態を四捨五入）19 30,32にコミットしているようである。フローサイトメトリー、光散乱プロファイルは、細胞型間で変化し、固定/透過処理条件（ 図2A）間でかなり変化する。これらのさまざまな細胞調製条件の下では、フローサイトメトリー分析、アイソタイプ対照と抗体との間の明確な区別（ 図2B）を持つ単一のピークとアイソタイプコントロールを明らかにする。多能性細胞または他の非心筋細胞は、ここで使用されるマーカーに対して陰性である。
この分化及び染色プロトコルを用いて、得られた細胞集団は、典型的には、フローサイトメトリーによって測定される分化の10日目に99％のTNNI3、96％IRX4の+、91％MLC2v +、96％MLC2a +である。 99％のTNNT2 +細胞（ 図2C、2D）観察されたが、前述したように、TNNT2が一意ではありませんしている開発中の心筋細胞への、したがって、細胞が10日目、99％本物心筋細胞であるという主張は、TNNI3タンパク質に基づいています。これは、相対的な遺伝子発現レベルは、タンパク質の安定性及び3.2及び3.5日の代謝回転速度と一致して、定量RT-PCRによってモニター発現をピークに比較して減少するが、10日を超えて継続培養で、構造タンパク質のタンパク質レベルは高いままであることに留意されたいそれぞれ、TNNIとTNNT 33。この観察の例はTNNT2（11日目にピークmRNA発現（ 図1B）、堅牢なタンパク質レベル日20 +で（ 図2E）について示されている。
図1 hPSCsおよび代表的なデータから心筋細胞への分化の全体概略。心筋細胞differentiatioの（A）の回路図 n個のプロトコルは、系統および/または細胞運命のコミットメントの対応する段階で注釈。分化プロセスの主要な段階の細胞の代表的な位相差画像。 =10μmのスケールバー。右端=α-アクチニン（緑）の免疫細胞化学イメージは中にTNNT2（赤）と核（青）。（B）定量RT-PCR解析（プローブセットのため、材料表を参照）18、参照中胚葉のと心臓発達マーカーでオーバーレイ分化の最初の17日間。すべてのデータは、各エラーバーは平均の標準誤差を表す三連で分析した3つの生物学的複製物の平均値であり、アクチン（ACTB）に正規化される。すべての時点へのメッセージレベルは、Ct値（ すなわち Ctは<35）検出可能な分化の最初の日を基準としています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
フローサイトメトリーおよび電気生理学による心筋細胞の図2キャラ。（A）は 、さまざまな固定および透過条件下での10日目hiPSC由来心筋細胞の光散乱プロフィール。 50,000件のイベントを集めた後、統計的分析のために使用ゲーテッド集団（ すなわち、破片を除く）が赤で示されている。（B）IRX4のヒストグラム分化の10日目方法のうち、効率染色の違いを示す3つの異なる固定化/透過化条件を用いて。挿入図は、各条件を使用してhiPSCs上IRX4の染色の違いを示している。 differentiの10日目TNNI3、TNNT2、MLC2v、MLC2aのこれらのデータは、メタノール/アセトンによるhiPSCsが少ないが、検出可能な、染色IRX4避けている理由を示している。（C）ヒストグラム 0.5μgの99％のTNNT2 +細胞を測定するために必要な最小量であることが、2μgの飽和点であることを示す、抗体滴定実験からTNNT2のヒストグラムは、表1に詳述最大パーセント陽性細胞（D）のための最適化された染色条件を使用してation定量のために必要。単一のイソタイプ対照が示されているが、滴定実験は、アイソタイプ対照のそれに対応する滴定各抗体との比較に基づいて計算される。TNNT2タンパク質の（E）定量心筋細胞に分化の0-24日目に、中央値蛍光強度の差として表される各時点パッチクランプ技術の全細胞電流クランプ構成を使用して、分化の46日目に単自発的に収縮する心室のような心筋細胞から記録された。（F）アクション電位用抗体およびアイソタイプ対照の間である。ES / ftp_upload / 52010 / 52010fig2highres.jpg "ターゲット=" _ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Accutase cell detachment solution | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | 53817 | |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | |
| Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor | R&D Systems | 1254 | |
| L-Ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261-10G | |
| Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human) | Invitria | 777TRF029 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | R&D Systems | 4144-TC-01M | |
| Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) | Peprotech | 100-21 | |
| DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| CHIR-99021 HCl | Sellekchem | S2924 | |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Life Technologies | 11875-093 | |
| B-27 Supplement Minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B-27 Supplement (with Insulin) | Life Technologies | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| Flow Cytometry Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (10x) | Quality Biological Inc. | 119-069-151 | |
| Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14175-095 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Phosflow perm buffer III | BD Biosciences | 558050 | |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28906 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 179957-4L | |
| Acetone | Mallenckrodt Chemicals | 2440-16 | |
| Triton X-100 | Amresco | M236-10ML | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Materials | |||
| 5 ml Round bottom polystyrene tube (without cap) | Corning | 352008 | For preparation of cells for flow cytometry |
| 5 ml Round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap) | Corning | 352235 | For preparation of cells for flow cytometry |
| 2 ml rubber bulbs | Fischer Scientific | 03-448-24 | |
| 9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipets | BioExpress | P-2904-2 | |
| 0.65 ml Microcentrifuge tubes, graduated, green | GeneMate | C-3259-G | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes, graduated, red | GeneMate | C-3260-R | |
| TC20 automated cell counter | BioRad | 145-0102 | |
| Counting slides for TC20 | BioRad | 145-0011 | |
| 6-well Flat bottom tissue-culture treated plate | Corning | 353046 | |
| 20 ml Syringes | BD Plastipak | 300613 | For filter sterilization of aliquots |
| Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfone | VWR | 28145-501 | For filter sterilization of aliquots |
| 250 ml Filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding | Corning | 431096 | For filter sterilization of bulk media |
| 500 ml filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding | Corning | 431097 | For filter sterilization of bulk media |
| Antibodies and Isotype Controls | |||
| Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7)) | Abcam | ab19615 | Primary antibody |
| Anti-TNNT2 (clone: 1C11) | Thermo Scientific | MA1-16687 | Primary antibody |
| Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5) | Synaptic Systems | 310111 | Primary antibody |
| Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7) | Abcam | AB131661 | Primary antibody |
| Anti-IRX4 | Bioss | BS-9464R | Primary antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1 | Life Technologies | A21121 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a | Life Technologies | A21241 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b | Life Technologies | A21141 | Secondary antibody |
| Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG | R&D Systems | F0110 | Secondary antibody |
| Mouse IgG1 | BD Biosciences | 557273 | Isotype Control |
| Mouse IgG2a | eBiosciences | 16-4724-81 | Isotype Control |
| Rabbit IgG-PE | R&D Systems | IC105P | Isotype Control |
| TaqMan Probesets for qRT-PCR | |||
| ACTB | Life Technologies | Hs01060665 | |
| Brachyury T | Life Technologies | Hs00610080 | |
| CASQ2 | Life Technologies | Hs00154286 | |
| IRX4 | Life Technologies | Hs01100809 | |
| ISL1 | Life Technologies | Hs00158126 | |
| MESP1 | Life Technologies | Hs01001283 | |
| MYH11 (SMMHC) | Life Technologies | Hs00224610 | |
| MYH6 | Life Technologies | Hs01101425 | |
| MYL2 (MLC2v) | Life Technologies | Hs00166405 | |
| MYL7 (MLC2a) | Life Technologies | Hs01085598 | |
| MYOG | Life Technologies | Hs01072232 | |
| NKX2.5 | Life Technologies | Hs00231763 | |
| NPPA | Life Technologies | Hs01081097 | |
| POU5F1 | Life Technologies | Hs04260367 | |
| SOX17 | Life Technologies | HS00751752 | |
| TNNI1 | Life Technologies | Hs00913333 | |
| TNNI2 | Life Technologies | Hs00268536 | |
| TNNI3 | Life Technologies | HS00165957 | |
| TNNT2 | Life Technologies | Hs00165960 | |
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