Isolasjon av distinkte cellepopulasjoner fra utviklings Cerebellum av microdissection

Summary

Nestin-uttrykke stamfedre er en nylig identifisert befolkning på nevrale stamceller i utviklingslillehjernen. Ved hjelp av microdissection teknikken presentert her i kombinasjon med fluorescerende-aktivert cellesortering, kan denne cellepopulasjon skal renses uten forurensning fra andre cerebellare regioner og kan dyrkes for videre studier.

Abstract

Microdissection er en ny teknikk som kan isolere spesifikke regioner i et vev og eliminere forurensning fra cellulære kilder i tilgrensende områder. Denne metoden ble først brukt i studiet av Nestin-uttrykke stamfedre (Neps), en nylig identifisert populasjon av celler i lillehjernen eksterne Germinal lag (EGL). Ved hjelp microdissection i kombinasjon med fluorescerende-aktivert cellesortering (FACS), er en ren populasjon av Neps samles separat fra konvensjonelle granule neuron-forløpere i EGL og fra andre kontaminerende Nestin-uttrykkende celler i lillehjernen. Uten microdissection, ville funksjonelle analyser av Neps ikke vært mulig med dagens metoder tilgjengelig, for eksempel Percoll® gradientsentrifugering og laser capture microdissection. Denne teknikken kan også bli brukt for bruk med forskjellige vev som inneholder enten gjenkjennelige regioner eller fluorescensmerket-merkede celler. Viktigst, en stor fordel med denne microdissection teknikken er at isolerte celler er levende og kan dyrkes for videre eksperimentering, som for tiden ikke er mulig med andre beskrevne fremgangsmåter.

Introduction

Den cerebellum består av flere cellelag, hver inneholdende forskjellige celletyper. Under utviklingen inneholder den EGL voksende granule nevroner forløpere (bruttonasjonalprodukt) mens den molekylære lag og Purkinje lag inneholde Bergmann gliaceller og Purkinje nevroner, henholdsvis. Dypt inne i lillehjernen ligger hvit substans, som inneholder nevrale stamceller (NSCs) og oligodendrocytter ^en.

Sonic pinnsvinet (Shh) spiller en avgjørende rolle i å regulere cerebellar utvikling og i særdeleshet, det fremmer spredning av bruttonasjonalprodukt via binding til sin reseptor Lappet (PTC), en negativ regulator av Shh signale ^2-4. Avvikende aktivering av Shh signale genererer medulloblastoma (MB), den vanligste ondartet hjernesvulst hos barn ^5,6.

PTC mutant MB transgene musemodeller er kraftige verktøy for studiet av MB og utvikle svulster ligner menneskelige MB ^7,8. Ved hjelp av dissemus, ble det oppdaget at bruttonasjonalprodukt er cellen utstedt pinnsvin-type MB ^7. Videre, i tillegg til bruttonasjonalprodukt, har vi nylig identifisert en unik populasjon av neuronale progenitorer innenfor EGL av utviklingen cerebellum som også kan gi opphav til MB. Disse cellene uttrykker høye nivåer av den type VI mellomliggende filamentprotein, Nestin, og er betegnet Neps ^9. Neps ligger innenfor den dype delen av EGL og eksisterer forbigående bare under neonatal lillehjernen utvikling. De er forpliktet til granule celle avstamning som bruttonasjonalprodukt, men er tydelig som de er passive og ikke uttrykke Math1, et veletablert markør for konvensjonelle bruttonasjonalprodukt ^10. I tillegg Neps gi opphav til MB mer effektivt enn bruttonasjonalprodukt etter aktivering av Shh signalveien ^9, noe som gjør dem en roman utstedt MB tumorigenesis.

Vi har tidligere isolert Neps fra lillehjernen EGL på postnatal dag 4 (P4) av microdissection teknikkbeskrevet her ^ni. Microdissection via direkte mikroskopisk visualisering av vev muliggjør spesifikk disseksjon av lillehjernen EGL. Dette er nødvendig som Nestin kommer også til uttrykk ved NSCs i lillehjernen hvit substans og ved Bergmann gliaceller i molekylær lag ^1,7,11,12, og det var avgjørende at disse cellene ikke inkluderes, som de ville forvirre analyse. Celler isolert fra microdissected vev kan brukes umiddelbart for molekylær analyse, eller de kan dyrkes for ytterligere anvendelser.

Til hjelp i spesielt microdissecting den EGL og for ytterligere å rense Neps ble Math1-GFP (grønt fluorescerende protein) mus krysset med Nestin-CFP (cyan fluorescerende protein) mus. Transkripsjonsfaktor Math1 er spesielt uttrykt av bruttonasjonalprodukt og GFP uttrykk er godt synlig i EGL ^9,13. Nestin-CFP mus uttrykker en kjernefysisk form for CFP og kan lett visualiseres i molekylær lag ^9,14. Sammen GFP og CFP uttrykk skaper grenser for microdissection av EGL (se figur 1). CFP-positive Neps ble deretter isolert ved hjelp av FACS etter enzymatisk dissosiasjon av de dissekerte EGLs.

Foreløpig er det mest godt utnyttet metode for å isolere celler fra EGL Percoll® gradientsentrifugering av hele lillehjernen vev ^15,16. Denne metoden er imidlertid ikke i stand til å fullstendig utelukke Nestin + cellepopulasjoner fra den molekylære sjikt og hvit substans, og kan derfor ikke benyttes for studier av Neps. Laser fangst microdissection, som bruker overføring av laserenergi for å fjerne cellene av interesse, er en annen metode til å isolere spesifikke celler i en heterogen vev ^17,18 men fangede celler kan bare brukes for utvinning av DNA, RNA og protein, og er ikke i stand til å dyrkes.

Denne protokollen gir en måte å spesifikt isolere en live, ren bestand av Neps fra EGL.Denne teknikken kan også brukes på ulike vevstyper som har enten gjenkjennelig anatomisk arkitektur eller fluorescensmerkede celler / regioner. Derfor, er den store fordelen med å innlemme denne nye teknikken i celle microdissection isoleringsmetoder som celler kan bli isolert fra bestemte vev regioner for å eliminere kontaminerende nærliggende vev og cellene kan bli samlet umiddelbart for analyse eller dyrket i andre applikasjoner.

Protocol

Bruk av dyr i denne protokollen er utført i henhold til prosedyrer godkjent av Fox Chase Cancer Center Animal Care og bruk komité.

1. Utarbeidelse av instrumenter, løsninger og Dekk

1. Clean to sett med # 5 fine tang, ett sett av # 7 fin buet tang, ett stort kirurgisk saks, en microdissecting saks, en slikkepott og en perforert skje. Plasser instrumentene i en selvtettende sterilisering posen og autoklav. Hold instrumenter i posen til den er klar til bruk.
2. Forbered en 3% lav smeltetemperatur agarose løsning.
   1. Tilsett 1,5 g agarose i 50 ml sterilt Dulbeccos Fosfatbufret Saline (DPBS) deretter plassere i mikrobølgeovn og varme til bobler. Swirl kolbe og oppvarmer til all agarose er oppløst. Bland løsningen med en rørepinne før oppvarming hvis klumper vises.
   2. Oppbevar løsningen i et 37 ° C vannbad inntil nødvendig.
   3. For langsiktig oppbevaringe, lagre agarose-løsning for fremtidig bruk ved romtemperatur eller ved 4 ° C i flere måneder. Varm opp i mikrobølgeovn å kondensere. For gjentatt oppvarming av agarose-løsning, veie kolben før oppvarming for å opprettholde sin opprinnelige vekt med varmt sterilt destillert vann.
3. Forbered følgende løsninger for papain basert celledissosieringsmedium som tidligere beskrevet ^2:
   1. En papain løsning med papain (100 U / ml), cystein (0,2 mg / ml) og DNase (250 U / ml) i sterilt fenolrødt-holdige DPBS.
   2. En ovomucoid løsning med bovint serumalbumin (BSA, 8 mg / ml), soyabønne trypsin inhibitor (8 mg / ml)) og DNase (250 U / ml) i sterilt fenolrødt-holdige DPBS.
      Filter sterilisere begge løsninger og juster pH til å returnere opprinnelige fargen fenolrødt-holdige DPBS.
4. Forbered cellekulturmedia (NB / B27): supplere basalmedier med 1 mM natrium-pyruvat, 2 mM L-glutamin, 1% penicillin-streptomycin (P / S) og B27 supplement. Filter sterilisere og beskytte mot lys. Stabilisere medier ved 37 ° C og 5% CO ₂ før bruk.
5. Forbered FACS buffer: 5% fetalt bovint serum (FBS) i DPBS. Legg 2,5 ml FBS til 47,5 ml DPBS.
6. Forbered poly-D-lysin (PDL) -belagte dekkglass.
   1. Autoklav nye glass dekkglass.
   2. Coat Dekkglass med PDL (100 ug / ml i sterilt, destillert vann) og inkuber i 2 timer ved 37 ° C eller romtemperatur over natten.
   3. Vask Dekk med sterilt destillert vann. Vask en gang med NB / B27 media. La Dekk tørke helt i vevskultur hette før bruk.

2. Dissection og klargjøring av vev Slices

1. På dagen for disseksjon, tørke ned disseksjon området med 70% etanol og dekselet med en absorberende pute.
2. Fjern disseksjon verktøy fra sterilisering posen. Legg iskald, sterile DPBS / 1% P / S til en liten petriskål og legg på is.
3. Halshogge P4 Math1-GFP / Nestin-CFP muse unger med store kirurgiske saks så hold hodet ned med fine buede tang. Fjern skinnet og forsiktig skrelle bort skallen med # 5 fine tang deretter øse ut hjernen fra skallen med en slikkepott og overføre den til petriskål som inneholder DPBS / 1% P / S.
   1. Ved hjelp # 5 fin pinsett, forsiktig skille lillehjernen fra resten av hjernen. Pass på å dissekere en valp på et tidspunkt så raskt som mulig.
   2. Samle et minimum av 8 cerebella for å oppnå nok Neps for molekylære og funksjonelle analyser.
4. Fyll en embedding mold måler 2 x 2 x 2 cm med 3% lav smeltetemperatur agarose løsning. Sikre at temperaturen av agarose er ikke mer enn 37 ° C.
5. Fjern overflødig væske fra lillehjernen ved dabbing forsiktig på et laboratorium vev. Plasser lillehjernen til mold i en vertikal stilling. Sett formen på is for å la den stivne raskt. Bruk ~ 4 cerebella per blokk.
6. Skaff liVing vevssnitt med en vibrerende blad vibratome. Trim cerebella holdige agarose blokk med et barberblad. Lim agarose blokk til vibratome plate med cerebella orientert i en vertikal stilling.
7. Fyll skuffen av vibratome med iskalde sterile DPBS / 1% P / S og sted is under.
   1. Skjær 600 mikrometer seksjoner gjennom hele lengden av lillehjernen. Samle seksjoner fra isen skuffen ved hjelp av en perforert skje. Plasser delene i en petriskål fylt med DPBS / 1% P / S på is.

3. microdissection og celledissosieringsmedium

1. Plasser petriskål inneholdende vev skiver under et fluorescerende disseksjonsmikroskop.
   1. Nøye skille EGL fra resten av lillehjernen seksjonen ved hjelp fin pinsett ved å dissekere mellom + CFP molekylsjikt og GFP + EGL (se stiplet linje i figur 1). Vær nøye med å ikke inkluderer noen del av det molekylære lag, noe som vil resultere iforurensning av Nestin-uttrykke Bergmann gliaceller.
   2. Fullfør dette trinnet så raskt som mulig og holde vevet på is for å unngå celledød.
   3. Fjern agarose rundt vevet før du går videre til neste trinn.
2. Fordøye microdissected EGL vev ved hjelp av en papain-basert protokoll som tidligere beskrevet ² for å oppnå en enkel cellesuspensjon.
   1. Re-suspendere celler i FACS buffer for innsamling av CFP-positive celler via FACS.

4. celle sortering og plating

1. Sorter celler for CFP fluorescens ved hjelp av en steril, med høy hastighet flowcytometer som inneholder en passende CFP filter og samle cellene i FACS-buffer på is. Skaffe omtrent 100.000 Neps fra hver P4 lillehjernen.
2. Sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 min. Bruk celler umiddelbart for molekylær analyse eller kultur for videre eksperimentering.
3. Til kultur celler, re-suspendere cellene i forvarmet NB / B27 media og plate på PDL-belagt dekkglass som tidligere beskrevet ^to.

Representative Results

Som vist i Figur 1A, ble cerebellare skiver fremstilt fra P4 Math1-GFP / Nestin CFP-mus, i hvilken det cerebellar EGL var dominert av GFP-uttrykkende bruttonasjonalprodukt og den molekylære sjikt ble anriket ved CFP-positive gliaceller. For å isolere Neps som er plassert i den dype del av EGL, ble skiver microdissected mellom EGL og molekylært lag (langs stiplet linje, Figur 1A). Dissekert EGLs (Figur 1b) ble deretter samlet for enzymatisk dissosiasjon fulgt av FACS.

Som forventet, et flertall (mer enn 85%) av cellene i det dissekerte EGL var konvensjonelle bruttonasjonalprodukt, som var positive for GFP (figur 2A). Neps (CFP +) utgjør bare rundt 5% av EGL cellepopulasjon. Nesten ingen av cellene var positive for dobbelt-GFP og CFP basert på FACS-analyse. CFP + celler renset ved FACS, ble dyrket in vitro for å undersøke differensiering potential. Som vist i figur 2B, Neps utelukkende ga opphav til β-tubulin + nevroner etter 4 dager i kultur, tyder Neps er avstamning begrenset nevrale stamceller.

Av dette microdissection protokollen, ble Neps og bruttonasjonalprodukt også renset fra EGL av Ptc mangellillehjernen. Ved intrakraniell transplantasjon, Neps utvikle MBs raskere sammenlignet med bruttonasjonalprodukt, noe som indikerer at Neps er spesielt utsatt for onkogene transformasjon ^ni.

Figur 1. Identifikasjon av regionen for EGL microdissection. Fluorescent bilder fra P4 Math1-GFP / Nestin-CFP dyr. (A) GFP uttrykk ligger i EGL, mens majoriteten av CFP uttrykket ligger i den molekylære laget. Microdissection ble gjort langs than gule stiplede linjen. (B) EGLs ble samlet for vev dissosiasjon. Dette tallet har blitt forandret fra Li et al ^ni.

Figur 2. Neps representerer en liten bestand av celler i EGL og er avstamning begrenset nevrale stamceller. (A) Flowcytometri analyse av CFP + celler isolert fra microdissected EGL. (B) Neps ble dyrket i henhold til differensiering vilkår for 4 dager og farget for β-tubulin (rød) og kontra med DAPI (blå). Dette tallet er blitt modifisert fra Li et al. ^9.

Discussion

Den microdissection metoden beskrevet her er den første fremgangsmåten i stand til å isolere en ren populasjon av levende celler for bruk i molekylær og funksjonelle analyser. Som vist av Li et al. ^9. Neps fremstilt ved denne metoden kan dyrkes og innarbeidet i forskjellige eksperimenter og på grunn av deres høye renhet, kan også brukes for mikromatriseanalyse.

Det er veldig viktig å ta tid til å bli dyktigere med denne microdissection teknikk. Neps befinner seg i den dype delen av EGL i umiddelbar nærhet til den molekylære sjikt, i hvilket Nestin-uttrykke Bergmann gliaceller kunne forurense NEP celleisolasjon og kompromiss renhet. Microdissection bør derfor gjøres konservativt å sørge for at forurensende celler i tilstøtende vev er ikke inkludert. Den store fordelen med den microdissection teknikk som beskrives her er evnen til å oppnå levende celler som kan dyrkes for furtherr eksperimentering. På grunn av dette, er det viktig at alle trinnene utføres i løpet av denne fremgangsmåten hurtig og at vevet holdes på is så mye som mulig. Dessuten må alle instrumenter og reagenser være steril. Etter disse trinnene vil redusere celledød og forurensning cellekultur. Dessuten vil montering multippel cerebella per agarose blokk hjelpe til å redusere prosedyren tid.

Denne teknikken er ikke begrenset til isolering av Neps og kan brukes til å samle celler fra andre områder av lillehjernen, så som gliaceller fra den molekylære sjikt og neurale stamceller fra den hvite substans. Ved siden av lillehjernen, kan microdissection brukes med andre vev som inneholder gjenkjennelige regioner, slik som i hippocampus, f.eks. Bruken av fluorescerende transgener, som benyttes her, kan hjelpe til å lage grenser eller identifisere områder for disseksjon, som kan være spesielt nyttig i vev som mangler lett identifiserbare områder og ellers ikke ville være i stand til å være microdissected. Denne teknikken kan derfor hjelpe i celle renselser i et bredt spekter av forskningsområder og applikasjoner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal media	Gibco	21103-049
PDL	Millipore	A-003-E
Ultra pure low melting temperature agarose	Invitrogen	16520-050
DPBS	Gibco	14190144