Summary
Nestin-uttryck stamceller är en nyligen identifierad population av neuronala stamceller i utvecklingslillhjärnan. Med hjälp av tekniken microdissection presenteras här i kombination med fluorescensaktiverad cellsortering, kan denna cellpopulation renas utan kontamination från andra cerebellär regioner och kan odlas för vidare studier.
Abstract
Microdissection är en ny teknik som kan isolera specifika regioner i en vävnad och eliminera föroreningar från cellulära källor i angränsande områden. Denna metod var först utnyttjas i studien av nestin-uttryck progenitorceller (NEP), en nyligen identifierad population av celler i cerebellär yttre germinal skikt (EGL). Använda microdissection i kombination med fluorescensaktiverad cellsortering (FACS), var en ren population av NEP samlas in separat från konventionella granulat neuron prekursorer i EGL och från andra kontaminerande nestin-uttryckande celler i lillhjärnan. Utan microdissection skulle funktionella analyser av NEP inte ha varit möjligt med nuvarande metoder som finns, till exempel Percoll gradientcentrifugering och laser capture microdissection. Denna teknik kan också användas för användning med olika vävnader som innehåller antingen igenkännbara regioner eller fluorescensmärkta celler. Viktigast, en stor fördel med detta microdissection tekniken är att isolerade celler lever och kan odlas för ytterligare experiment, som för närvarande inte är möjligt med andra beskrivna metoder.
Introduction
Lillhjärnan är sammansatt av flera cellskikt, vardera innehållande distinkta celltyper. Under utvecklingen, innehåller den EGL prolifererande granulat neuron prekursorer (BNI), medan den molekylära lagret och Purkinjetrådsanalyser skikt innehåller Bergmann glia och Purkinje nervceller, respektive. Djupt inom lillhjärnan ligger den vita substansen, som innehåller neurala stamceller (NSCs) och oligodendrocyter 1.
Sonic hedgehog (Shh) spelar en avgörande roll i regleringen av cerebellär utveckling och i synnerhet, främjar spridningen av BNI genom att binda till sin receptor Patched (PTC), en negativ regulator av Shh signalering 2-4. Avvikande aktivering av Shh signalering genererar medulloblastom (MB), den vanligaste elakartade hjärntumör hos barn 5,6.
Ptc muterade MB transgena musmodeller är kraftfulla verktyg för att studera MB och utveckla tumörer som liknar människans MB 7,8. Med hjälp av dessamöss, upptäcktes det att BNI är cellen ursprungs för hedgehog-typ MB 7. Dessutom, förutom bruttonationalinkomst, vi har nyligen identifierat en unik population av neuronala stamceller inom EGL av framkallningslillhjärnan som också kan ge upphov till MB. Dessa celler uttrycker höga nivåer av typ VI intermediärt filamentprotein, nestin, och benämns NEP 9. NEP finns inom den djupa delen av EGL och existerar transient bara under neonatal cerebellär utveckling. De är engagerade i granulatcell härstamning som BNI men skiljer eftersom de är vilande och uttrycker math1, en väletablerad markör för konventionella BNI 10. Dessutom NEP ge upphov till MB mer effektivt än BNI efter aktivering av Shh signalväg 9, vilket gör dem till ett nytt ursprung för MB tumorigenes.
Vi har tidigare isolerade NEP från cerebellär EGL på postnatal dag 4 (P4) med microdissection teknikbeskrivs här 9. Microdissection via direkt mikroskopisk visualisering av vävnaden medger specifik dissekering av cerebellär EGL. Detta är nödvändigt eftersom nestin uttrycks även av NSCs i lillhjärnan vita substansen och Bergmann glia i molekylskiktet 1,7,11,12 och det var avgörande att dessa celler inte inkluderas, eftersom de skulle förväxla analys. Celler isolerade från microdissected vävnad kan användas omedelbart för molekylär analys eller de kan odlas för ytterligare tillämpningar.
För att underlätta specifikt microdissecting EGL och att ytterligare rena NEP, var math1-GFP (grönt fluorescerande protein) möss korsas med nestin-CFP (cyan fluorescerande protein) möss. Transkriptionsfaktorn math1 specifikt uttrycks av BNI och GFP uttryck syns tydligt i EGL 9,13. Nestin-GFP möss uttrycker en kärnform gemensamma fiskeripolitiken och kan enkelt visualiseras i den molekylära skiktet 9,14. Tillsammans GFP och GFP uttryck skapar gränser för microdissection av EGL (se figur 1). GFP-positiva NEP isolerades sedan genom FACS, efter enzymatisk dissociation av de dissekerade EGLS.
För närvarande är den mest utnyttjade metoden att isolera celler från EGL Percoll gradientcentrifugering av hel cerebellär vävnad 15,16. Denna metod är dock inte helt utesluta nestin + cellpopulationer från den molekylära lagret och vit substans och kan därför inte användas för att studera NEP. Laser capture microdissection, som använder överföring av laserenergi för att avlägsna celler av intresse, är en annan metod som används för att isolera specifika celler inom en heterogen vävnad 17,18 men infångade cellerna kan endast användas för återvinning av DNA, RNA och protein och är inte kunna odlas.
Detta protokoll är ett sätt att specifikt isolera en levande, ren population av NEP från EGL.Denna teknik kan också tillämpas på olika vävnadstyper som har antingen igenkännbar anatomisk arkitektur eller fluorescensmärkta celler / regioner. Därför är den stora fördelen med att införliva denna nya microdissection teknik i cellisoleringsprotokoll att celler kan isoleras från särskilda vävnadsområden för att eliminera kontaminerande angränsande vävnad och cellerna kan uppsamlas omedelbart för analys eller odlas för andra tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Användning av djur i detta protokoll har utförts i enlighet med förfaranden som godkänts av Fox Chase Cancer Center Animal Care och användning kommittén.
1 Beredning av Instrument, lösningar och Täck
- Rengör två uppsättningar # 5 fin pincett, en uppsättning # 7 fina böjda pincett, en stor kirurgisk sax, en microdissecting sax, en spatel och en perforerad sked. Placera instrumenten i en självtätande sterilisering påse och autoklav. Förvara instrumenten i påsen tills produkten ska användas.
- Förbered en 3% låg smälttemperatur agaroslösning.
- Tillsätt 1,5 g agaros i 50 ml steril Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) därefter i mikrovågsugn och värme tills bubblor syns. Swirl kolv och återuppvärmnings tills all agaros har lösts upp. Blanda lösningen med en omrörare före uppvärmning om klumpar visas.
- Butiks lösning i ett 37 ° C vattenbad tills det behövs.
- För långtids förvae, lagra agaroslösningen för framtida användning vid rumstemperatur eller vid 4 ° C i flera månader. Värma i mikrovågsugn för att smälta. För upprepad uppvärmning av agaroslösningen Väg kolven innan uppvärmning för att behålla sin ursprungliga vikt med varmt sterilt destillerat vatten.
- Förbered följande lösningar för papain baserade cell dissociation som tidigare beskrivits 2:
- En papain lösning med papain (100 U / ml), cystein (0,2 mg / ml) och DNas (250 U / ml) i steril fenolröd innehållande DPBS.
- En ovomukoid lösning med bovint serumalbumin (BSA; 8 mg / ml), sojaböntrypsininhibitor (8 mg / ml)) och DNas (250 U / ml) i steril fenolröd innehållande DPBS.
Filter sterilisera båda lösningarna och justera pH-värdet att återvända ursprungliga färgen fenolrött innehållande DPBS.
- Förbered cellodlingsmedier (NB / B27): komplettera basalmedier med 1 mM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin, 1% penicillin-streptomycin (P / S) och B27-tillskott. Filter sterilisera och skydda mot ljus. Jämvikta medier vid 37 ° C och 5% CO2 före användning.
- Förbered FACS buffert: 5% fetalt bovint serum (FBS) i DPBS. Lägg 2,5 ml FBS till 47.5 ml DPBS.
- Förbered poly-D-lysin (PDL) -belagda täckglas.
- Autoklav nya glas.
- Coat täckglasen med PDL (100 | ig / ml i sterilt destillerat vatten) och inkubera i 2 h vid 37 ° C eller rumstemperatur över natten.
- Tvätta täckglas med sterilt destillerat vatten. Tvätta en gång med NB / B27 medier. Låt täck torka helt i vävnadskultur huv före användning.
2 Dissektion och Beredning av vävnadssnitt
- På dagen för dissektion, torka av dissektion område med 70% etanol och lock med en absorberande dyna.
- Ta dissektion verktyg från steriliseringspåse. Lägg iskall, sterila DPBS / 1% P / S till en liten petriskål och lägg på is.
- Decapitate P4 math1-GFP / nestin-CFP mus valpar med stora kirurgiska saxar håller sedan huvudet ner med fina böjda pincett. Ta bort huden och försiktigt skala bort skallen med # 5 fin pincett sedan ösa ut hjärnan ur skallen med hjälp av en spatel och överföra den till petriskål med DPBS / 1% P / S.
- Använda # 5 fin pincett, försiktigt separera lillhjärnan från resten av hjärnan. Var noga med att dissekera en valp i taget så fort som möjligt.
- Samla minst 8 cerebella för att få tillräckligt med NEP för molekylära och funktionella analyser.
- Fyll en inbäddning mögel mäter 2 x 2 x 2 cm med 3% låg smälttemperatur agaroslösning. Se till att temperaturen på agaros är inte mer än 37 ° C.
- Ta bort överflödig vätska från lillhjärnan genom att badda försiktigt på ett laboratorium vävnad. Placera lillhjärnan till mögel i vertikalt läge. Placera formen på is för att låta den stelna snabbt. Använd ~ 4 cerebella per block.
- Erhåll living vävnadssnitt med en vibrerande blad vibratome. Trim cerebella innehållande agaros block med ett rakblad. Limma agarosen blocket till vibratome plattan med cerebella i vertikalt läge.
- Fyll facket för vibratome med iskall sterila DPBS / 1% P / S och plats is under.
- Skär 600 | im sektioner genom hela längden av lillhjärnan. Samla delar från islådan med en perforerad sked. Placera avsnitt i en petriskål fylld med DPBS / 1% P / S på is.
3 Microdissection och Cell Dissociation
- Placera petriskål med vävnadsskivor under ett fluorescerande dissekera mikroskop.
- Ta försiktigt loss EGL från resten av cerebellär sektionen med fin pincett genom att dissekera mellan den gemensamma fiskeripolitiken + molekylära skiktet och GFP + EGL (se streckad linje i figur 1). Var noga med att inte inkludera någon del av den molekylära lagret, vilket kommer att resultera ikontaminering av nestin-uttryckBergMann glia.
- Fyll i detta steg så snabbt som möjligt och hålla vävnaden på is för att förhindra celldöd.
- Ta agarosen omger vävnaden innan du fortsätter till nästa steg.
- Smälta den microdissected EGL vävnad med användning av ett papain-baserat protokoll som tidigare beskrivits 2 för erhållande av en enkelcellsuspension.
- Återsuspendera cellerna i FACS-buffert för uppsamling av GFP-positiva celler via FACS.
4 cellsortering och plätering
- Sortera celler för GFP fluorescens med hjälp av en steril, höghastighets flödescytometer innehållande en lämplig GFP filter och samla cellerna i FACS-buffert på is. Skaffa cirka 100.000 NEP från varje P4 lillhjärnan.
- Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 min. Använd celler omedelbart för molekylär analys eller kultur för ytterligare experiment.
- Att odla celler, åter suspendera cellerna i förvärmda NB / B27 media och plattan på PDL-belagda täckglas som tidigare beskrivits 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Såsom visas i fig 1A, har cerebellära skivor bereddes från P4 math1-GFP / nestin-GFP-möss, i vilka cerebellär EGL dominerades av GFP-uttryck BNI och den molekylära skiktet berikas av GFP-positiva gliaceller. För att isolera NEP som är belägna i den djupa delen av EGL ades skivor microdissected mellan EGL och molekylskiktet (längs den streckade linjen; Figur 1A). Dissekerades EGLS (Figur 1B) uppsamlades sedan för enzymatisk dissociation följt av FACS.
Som förväntat, en majoritet (över 85%) av cellerna i den dissekerade EGL var konventionella BNI, som var positiva för GFP (Figur 2A). NEP (GFP +) utgör endast cirka 5% av EGL cellpopulation. Nästan ingen av cellerna var dubbel-positiva för GFP och GFP baserat på FACS-analys. GFP + celler renade genom FACS, odlades in vitro för att undersöka differentierings potential. Som visas i figur 2B, NEP gav enbart upphov till β-tubulin + neuroner efter 4 dagar i kultur, tyder NEP är linjebegränsade neuronala stamceller.
Genom detta microdissection protokoll, var NEP och BNI också renas från EGL av Ptc bristfällig lillhjärnan. Vid intrakraniell transplantation NEP utveckla MBs snabbare jämfört med BNI, vilket indikerar att NEP är särskilt mottagliga för onkogen transformation 9.
Figur 1 Identifiering av regionen för EGL microdissection. Fluorescerande bilder P4 math1-GFP / nestin-CFP djur. (A) GFP uttryck ligger i EGL, medan majoriteten av GFP uttryck ligger i den molekylära lagret. Microdissection gjordes längs tHan gula streckade linjen. (B) EGLS insamlades för vävnadsdissociering. Denna siffra har modifierats Li et al 9.
Figur 2. NEP utgör en liten population av celler i EGL och är linjebegränsade neuronala stamceller. (A) Flödescytometrianalys av GFP + celler isolerade från microdissected EGL. (B) NEP odlades under differentieringsbetingelser för fyra dagar och färgades för β-tubulin (rött) och motfärgades med DAPI (blå). Denna siffra har modifierats Li et al. 9
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den microdissection metod som beskrivs här är det första förfarandet kunna isolera en ren population av levande celler för användning i molekylära och funktionella analyser. Såsom demonstreras av et al. Li 9, NEP erhålls med denna metod kan odlas och införts i olika experiment och på grund av sin höga renhet, kan också användas för microarray analys.
Det är mycket viktigt att ta tid att bli skicklig med denna microdissection teknik. NEP är belägna i det djupa området av EGL i mycket nära anslutning till det molekylära skiktet, i vilket nestin-uttryckBergMann glia kan förorena NEP cellisolering och äventyra renhet. Microdissection bör därför göras försiktigt för att se till att kontaminerande celler i intilliggande vävnad ingår inte. Den stora fördelen med microdissection teknik som beskrivs här är förmågan att få levande celler som kan odlas för further experimenterande. På grund av detta är det viktigt att alla åtgärder under detta förfarande ske snabbt och att vävnad hållas på is så mycket som möjligt. Dessutom måste alla instrument och reagenser vara sterila. Efter dessa steg kommer att minska celldöd och förorening cellodling. Dessutom kommer monterings multipel cerebella per agaros blocket bidra till att minska procedurtiden.
Denna teknik är inte begränsad till isolering av NEP och kan användas för att samla celler från andra områden i lillhjärnan, såsom gliaceller från det molekylära skiktet och neurala stamceller från den vita substansen. Bredvid cerebellum kan microdissection användas med andra vävnader som innehåller igenkännbara regioner, såsom hippocampus, till exempel. Användningen av fluorescerande transgener, som utnyttjas här, kan hjälpa till att skapa gränser eller identifiera regioner för dissektion, vilket kan vara särskilt användbart i vävnader som saknar lätt identifierbara områden och skulle annars inte kunna vara microdissected. Denna teknik kan därför hjälpa till cell reningar inom en rad olika forskningsområden och tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka James Oesterling för flödescytometri hjälp. Denna forskning stöds av ett bidrag från US National Cancer Institute (R01-CA178380, ZY) och en US National Institutes Postdoctoral utbildningsbidrag (5T32CA009035-37, LWY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| PDL | Millipore | A-003-E | |
| Ultra pure low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 |
References
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22, 103-114 (1999).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
- Riobo, N. A., Manning, D. R. Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs. Biochem J. 403, 369-379 (2007).
- Dahmane, N., et al. The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis. Development. 128, 5201-5212 (2001).
- Marino, S. Medulloblastoma: developmental mechanisms out of control. Trends Mol Med. 11, 17-22 (2005).
- Yang, Z. J., et al. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
- Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Sutter, R., et al. Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas. Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).
- Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells. J Neurosci. 14, 124-133 (1994).
- Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).
- Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Espina, V., et al.
