Protocol
1 Preparación de medios de cultivo, citoquinas y Placas gelatinizada
- Preparar los medios de comunicación de células ES mediante el uso de Modificación de Medio de Eagle (DMEM) de Dulbecco con alto contenido de glucosa y piruvato de sodio. Añadir 20% ESC Calificación suero bovino fetal (FBS), 1% penicilina / estreptomicina, 1% de L-glutamina, 1% Tampón HEPES, ácidos 1% para no esencial amino, 0,1% de gentamicina (50 mg / ml) y 0,1% ( 55 M) β-mercaptoetanol. Esterilizar medio de células ES por filtración.
- Preparar medios OP9 al hacer 1 L de medio esencial mínimo alfa (α-MEM) a partir de polvo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Añadir 20% de suero fetal bovino (FBS) y 1% penicilina / estreptomicina. Invertir para mezclar. Esterilizar por filtración en dos alícuotas de 500 ml.
NOTA: Se recomienda el uso de medios elaborados a partir de polvo y es probable que para producir un mejor mantenimiento de células OP9 y en los resultados de diferenciación in vitro. Este enfoque se ha convertido en nuestro procedimiento estándar. Sin embargo, también observamos That hemos utilizado a veces líquidos pre-hechos α-MEM con éxito adecuada. - Preparar medio de congelación mediante la adición de 10% sulfóxido de dimetilo (DMSO) al 90% de FBS. Agitar suavemente y esterilizar por filtración. Almacenar a 4 ° C.
- Preparar 2,000x Flt-3 ligando (10 g / ml) por disolución de Flt-3 humana recombinante ligando (Flt-3L) en medios OP9 completa a 10 g / ml. Alícuota en 1,5 ml tubos de microcentrífuga y se almacenan a -80 ° C. Siga las recomendaciones del proveedor respecto a la estabilidad y el almacenamiento.
NOTA: La estabilidad de Flt-3L es corto (1 mes a 4 ° C o 3 meses a -80 ° C). - Preparar 1,000x IL-7 (1 g / ml) mediante el uso de medios de comunicación OP9 completa. Alícuota en 1,5 ml tubos de microcentrífuga y se almacenan a -80 ° C. Siga las recomendaciones del proveedor sobre la estabilidad y almacenamiento (IL-7 es estable por hasta 12 meses a -80 ° C).
- Preparar 1,000x Factor Inhibidor de Leucemia (LIF) (10 g / ml) por una dilución 1:10 de 10 7 unidades de LIF in medio de células ES. Alícuota Almacenar a 4 ° C. Asegúrese de anotar la fecha de caducidad indicada por el fabricante en los viales alícuotas.
NOTA: El producto es estable en forma concentrada o diluida al menos 18 meses a partir de la fecha de fabricación. - Preparar placas de 6 pocillos gelatinizados por añadir 1,5 ml de 0,1% de solución de gelatina en cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Deja los platos en la campana estéril a temperatura ambiente con las tapas en, dejando al menos 30 minutos para el recubrimiento. Los platos también se pueden dejar en una incubadora humidificada durante la noche. Retire cualquier solución de gelatina sobrante justo antes de la siembra de células. No deje que la solución de gelatina se seque por completo en el pozo.
2 Preparación y mantenimiento de células alimentadoras y las células madre embrionarias de ratón (mESC)
NOTA: Incubar todas las células en un 37 ° C humidificado incubadora con 5% de CO 2.
- Descongelación fibroblastos embrionarios de ratón (MEF)
- Quick-descongele un vial congelado (~ 5 x 10 6
- Añadir 8 ml de medio de células ES a las células descongeladas, de una manera gota a gota para diluir gradualmente el DMSO a partir del medio de congelación.
- Centrifugar las células a 400 x g a 4 ° C durante 5 min. Retire cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 3 ml de medio de células ES.
- Preparar un tubo de centrífuga de 50 ml con 33 ml de medio de células pre-calentado ES. Añadir los 3 ml de MEFs resuspendidos a llevar el volumen final a 36 ml.
- Distribuir 3 ml de los MEFs resuspendidos en cada pocillo de dos placas de 6 pocillos gelatinizado. Colocar las placas en la incubadora durante al menos seis horas para permitir que las células se unan y se extienden antes de la siembra de las mESCs en ellos. Estas capas alimentadoras mitóticamente detenidas pueden ser utilizables durante varios días después de la siembra inicial, si sus medios se cambian cada 2-3 días.
NOTA: MEFs recién detenidos también se pueden utilizar. </ Ol>
- MESCs Siembra
- Quick-descongele un vial con un congelado clon mESC en el baño a 37 ° C y preparar las células como se describe en 2.1.1-2.1.3.
NOTA: Nos congelamos 2 viales de mESC de un pozo confluente de una placa de 6 pocillos. - Retire el medio de un pozo (por clon mESC) de la placa de 6 pocillos con monocapas MEF detenidos (preparado en el paso 2.1.5) y sembrar el 3 ml de mESCs en la parte superior de la monocapa MEF. Añadir 3 l de 1,000x LIF (10 ng / ml). Volver platos en la incubadora.
- Quick-descongele un vial con un congelado clon mESC en el baño a 37 ° C y preparar las células como se describe en 2.1.1-2.1.3.
- El mantenimiento de células ES y la tripsina mediada pasaje
NOTA: Cambiar medios diarios o Split basado en la confluencia de mESC. En condiciones óptimas, la cosecha y de división / re-placa de las células cada dos días.- Retire el medio de células ES y lavar mESCs con 2 ml de PBS. Retire PBS. Añadir 1 ml de 0,25% de tripsina y se incuba a 37 ° C durante 3-5 min.
- Recoger las células tratadas con tripsina y transferirlos en un tubo de centrífuga de 15 ml. Pipetear vigorosamente la suspensión celular a romper los grumos de mCES. Añadir 2 ml de medio de células ES completa a la suspensión celular para neutralizar la tripsina.
- Centrifugar las células a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 3 ml de células ES medios de comunicación.
- Retire el medio de placas de 6 pocillos que contienen monocapas MEF detenidos preparados. Añadir la cantidad apropiada de la suspensión celular (basado en la relación de separación deseada) en 3 ml de medio de células ES a cada pocillo para sembrar. Añadir 3 l de LIF 1,000x. Una confluencia mESC bien dividida 1: 6 estará listo para el paso en 2 días.
- OP9 / mantenimiento de células OP9-DL1
- Descongelar un vial de células OP9 (siga los pasos 2.1.1-2.1.3 utilizando medios OP9)
- Añadir 7 ml de medio OP9 a 10 cm placa de cultivo tisular. Añadir los 3 ml de células resuspendidas en una forma gota a gota, la distribución de las células de todo el plato. Colocar las células durante la noche en la incubadora.
- Compruebe la confluencia de las células OP9 al día siguiente. Si el plato contiene muchas células flotando muertos, remove los medios de comunicación y añadir 10 ml de medio OP9 fresco. Devuelva el plato a la incubadora si no se observa casi llena confluencia. Split (utilizando tripsina) 1: 4 cerca de la monocapa confluente OP9.
NOTA: Las placas deben llegar a mismo nivel confluencia de nuevo en unos 2 días. Tenga cuidado de no dejar que las células OP9 vuelto sobre-confluente. - Congelar los primeros pasajes de células OP9 como acciones de expansión.
NOTA: Nos congelamos 2 viales de células OP9 de una cerca de la confluencia placa de 10 cm. Cada vial de expansión de valores puede ser propagado a crear reservas de trabajo que se utilizan posteriormente en mESC experimentos de co-cultivo. Mantenga todas las existencias OP9 congelados en nitrógeno líquido y no en el congelador -80 ° C, ya que las temperaturas fluctuantes pueden influir negativamente en la calidad de las heladas.
3. OP9-DL1 Procedimiento Co-cultura
- Preparaciones de Co-cultura
- Aproximadamente una semana antes de la iniciación de un co-cultivo, descongelar MEFs, mESCs y sto celular OP9 trabajocks. Dado que las células OP9-DL1 no son necesarios hasta el día 8 de co-cultivo, descongelar las células OP9-DL1 durante los primeros tres días después del inicio de co-cultivo. Mantener o congelar todas las células según sea necesario.
- Determinar el número inicial de placas de 10 cm con monocapas de células OP9 preparados para alcanzar el 80% de confluencia en co-cultura día 0 en base a la escala del experimento (por ejemplo, número de clones mESC para diferenciarse y el número de puntos de tiempo de co-cultivo de ser analizada). Para prepararse para una co-cultura, dividido cerca plato confluente de células OP9 entre 1: 4 y 1: 6 dos días antes de que se necesitarán las monocapas.
NOTA: Uno necesitará al menos una placa por clon ESC. Típicamente, un solo clon ESC sembró en una sola placa (como se describe a continuación) en el día 0 deben producir suficientes células para sembrar placas de seis días en el paso 5. Cada placa 5 días permitirá una posterior punto de tiempo de análisis. - Desde monocapas OP9 serán continuamente necesarios para el paso de co-cultivo, tenga cuidado de siempre maintaen un número adecuado de placas de cultivo de OP9 adicionales en paralelo con el co-cultivo.
- Día 0: Inicio de la co-cultura
- Recoger mESC como en 2.3.1-2.3.4. Contar las células.
- Para cada clon mESC preparar 5 x 10 4 mESC en 10 ml de medio por placa OP9.
NOTA: Aunque no hemos utilizado, observamos que un medio alternativo que consiste en α-MEM, el 10% de SFB, y 5 x 10 -5 M β-mercaptoetanol También se ha informado para el uso en la diferenciación de co-cultivos 10. - Eliminar los viejos medios de OP9 platos y añadir los 10 ml de suspensión mESC a los platos teniendo cuidado para distribuir las células uniformemente a través de la placa. Colocar las cápsulas en la 37 ° C incubadora.
- Día 3: Cambio de medio
- Sacar los recipientes de la incubadora y observar bajo el microscopio. Las colonias deben comenzar a perder brillo y un aspecto apisonado.
- Retire el medio de platos y añadir con cuidado 10 ml de fresco OP9medios de comunicación.
- Devolver los platos de co-cultivo a la incubadora. Monitorear visualmente la formación de colonias de mesodermo, como todos los días para informar al momento de OP9 preparación monocapa alimentador para el siguiente paso (día 5), que no debe llevarse a cabo hasta ~ 80-90% de las colonias mostrar visualmente mesodermo como morfología. Aplazamiento máximo de la etapa de transferencia de células 5 días es de 2 días.
- Día 5: La tripsina pasaje mediada con pre-chapado.
NOTA: Preparar de antemano un número adecuado de placas de 10 cm con células OP9 óptimamente confluentes. Proceda con los siguientes pasos sólo si los co-cultivos muestran visualmente las características que se describen en el paso 3.3.3 (ver resultados también representativos).- Retire el medio de los platos de co-cultivo. Añadir 4 ml de PBS para lavar. Agitar el PBS y quitar. Añadir 4 ml de tripsina al 0,25% y colocar los platos en la incubadora de ~ 5 min.
- Interrumpir la capa de las células tratadas con tripsina por pipeteo vigoroso, con cuidado de no introducir burbujas de aire excesivas, hasta que unhomogénea se logra, sobre todo sola suspensión celular.
- Añadir 4 ml de medio OP9 completos y mezclar con la pipeta. Transferencia de células en un nuevo, vacío placa de 10 cm y el lugar en la incubadora durante 30 min para permitir que las células se adhieran OP9 al plato. Este paso de "pre-chapado" reduce el número de OP9 células transferidas a la siguiente etapa de co-cultivo.
- Preparar 50 ml tubos de centrífuga con células coladeras 40 micras.
- Recoger las células no adherentes de la placa de pre-chapado y pasar a través del filtro de células en el tubo. Lave el plato suavemente con 6 ml de PBS y pasarla a través del mismo filtro, dejando las células OP9 unidos detrás.
- Centrifugar las células a 400 x g 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células sedimentadas en 3 ml de medio OP9 completa. Contar las células.
- Retire el papel de placas de 10 cm con células OP9 óptimamente confluentes.
- Para cada punto de tiempo de análisis, sembrar 5 x 10 5 células en el mono OP9capa en volumen final de 10 ml.
- Añadir 5 ng / ml humana recombinante Flt-3L y colocar los platos en la incubadora.
- Día 8: hematopoyético de células progenitoras (HPC) de recogida
NOTA: Preparar de antemano un número adecuado de placas de 6 pocillos con monocapas OP9 o-DL1 OP9 celulares para que puedan ser ~ 80% de confluencia en el tiempo para este paso.- Preparar 50 ml tubos de centrífuga con 40 micras coladores.
- Quitar los platos de la incubadora y observar bajo el microscopio. Grupos brillante de HPC deben ser débilmente unidos a la monocapa OP9. Recoger la mayor cantidad de estas células como sea posible mediante el lavado (pero no demasiado interrumpir) la monocapa OP9 con una pipeta y los medios de comunicación existentes en el plato. Para evitar la formación de espuma, siempre dejar al menos 1 ml de los medios de comunicación en la punta de la pipeta durante esta colección HPC / paso de lavado.
- Pasar las células a través del filtro de 40 micras en un tubo. Añadir 8 ml de PBS a la misma placa y comprobar bajo el microscopio si todos nos HPCsre recogido. Repita el paso de lavado / colección con PBS y (si es necesario) con el lavado más enérgico. Colar las células en el tubo ya que contiene las células de la misma placa.
- Centrifugar las células a 400 x g durante 5 min a 4 ° C.
- Preparar una mezcla maestra de 3 ml (por placa sembró en el día 5) de los medios de OP9 con 5 ng / ml de Flt-3L y 1 ng / ml de IL-7.
- Aspirar el sobrenadante y pellet se resuspende en medios OP9 con Flt-3L + IL-7 mezcla maestra (3 ml por cada placa de 10 cm procesado). Transferencia de las células recogidas de cada placa en un pocillo de una placa de 6 pocillos con células OP9.
- Con el fin de conducir hacia las células monocíticas, células B o linajes eritroides, sembrar las células recogidas en las células OP9. Para derivar células T, sembrar las células en monocapas de células OP9-DL1.
- Coloque las placas de 6 pocillos en incubadora.
- Día 10: Cambio de medio
- Preparar un tubo de centrífuga de 15 ml para cada distinto mESC clon-alimentador tipo de células combición en co-cultivo.
- Preparar una mezcla maestra de los medios OP9 con 5 ng / ml de Flt-3L y 1 ng / ml de IL-7. Preparar 3 ml para cada pocillo.
- Recoger suavemente los medios de comunicación de cada pocillo de la placa de 6 pocillos que combina los medios de comunicación de múltiples pocillos que contienen el mismo clon de alimentador de tipo de célula combinación ESC.
- Añadir 2 ml de mezcla maestra medios OP9 (véase 3.6.2) en cada pocillo.
- Centrifugar los medios de recogida a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender cada pellet (muy pequeña si es visible) en 1 ml de OP9 maestro de la mezcla de medios (ver 3.6.2) por pocillo recogido inicialmente en el paso 3.6.3.
- Distribuir 1 ml de células de nuevo en cada pocillo de la que los medios de comunicación se recogió originalmente llevando el volumen en cada pocillo a 3 ml. Vuelva a poner las placas en la estufa.
- Día 12: Ningún pasaje tripsina
NOTA: Preparar de antemano un número adecuado de placas de 6 pocillos con células OP9 o OP9-DL1 para que puedan ser confluentes de manera óptima en el tiempo para este step. Día 12 es ideal para el análisis de citometría de flujo de eritroide en desarrollo, monocitos y células T en fase inicial.- Preparar una mezcla maestra (3 ml para cada pocillo que continuará en co-cultivo) de los medios de comunicación OP9 con 5 ng / ml de Flt-3L y 1 ng / ml de IL-7.
- Preparar 50 ml tubos de centrífuga con 40 micras coladores (uno para cada clon-alimentador tipo de célula combinación ESC en co-cultura).
- Vigorosamente pipetear los medios de comunicación existentes en cada pocillo para desagregar todas las células (incluyendo la monocapa) en el pozo. Continuar con pipeteo enérgico hasta que se alcanza un estado parecido a una suspensión de células individuales.
- Pasar las células recogidas a través del filtro en el tubo. Añadir 3 ml de PBS en cada pocillo para lavar y recoger todas las células restantes. Pasar las células a través del mismo filtro. Combinar celdas de múltiples pozos que contienen el mismo clon-alimentador tipo de célula combinación ESC.
- Desechar el filtro de células utilizado y eliminar una parte alícuota equivalente a un pocillo (~ 6 ml) para cualquier deseadacitometría de flujo (u otro) análisis a realizar en ese día. Guarde estas alícuotas en hielo antes de su uso.
- Centrifugar las células a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante. Resuspender el sedimento de los tubos de centrífuga de 50 ml en 3 ml de mezcla maestra por pozo a ser re-sembrado. Añadir 3 ml por pocillo de cada suspensión de células en el tipo de células de alimentación apropiada y colocar los platos en la incubadora.
- Día 14: Cambio de medio
- Siga los pasos que se indican en el apartado 3.6.
- Día 16: Ningún pasaje tripsina
NOTA: Preparar con antelación placas de 6 pocillos de células OP9 o OP9-DL1 óptimamente confluentes para este paso.
NOTA: El día 16 es ideal para el flujo de análisis de citometría de los linfocitos B y las células T de la etapa intermedia.- Siga los pasos descritos en la sección 3.7.
- Día 18: Cambio de medio
- Siga los pasos que se indican en el apartado 3.6.
- Día 20: Ningún pasaje tripsina
NOTA: Día 20 is ideal para citometría de flujo análisis de mediados o finales de etapa de desarrollo las células T.- Siga los pasos descritos en la sección 3.7. Si lo desea, realizar la diferenciación de células día 20 cambio de medio alterna pasado y no tripsina pasajes cada dos días con un seguimiento diario de la tasa de expansión de los linfocitos.
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Representative Results
Cuando se cultiva en MEFs en presencia de LIF, mESCs se pueden mantener en un estado indiferenciado. Bajo condiciones ideales, aparecen como colonias compactas de células rodeadas por un halo brillante en la microscopía de contraste de fases (Figura 1). Estos cultivos deben ser monitoreados diariamente. Dependiendo de la confluencia de las células, los medios de comunicación pueden ser cambiados o células se pueden dividir. Vecinas colonias mESC no deben llegar al punto de contacto entre sí. Un cultivo normal y saludable de mESCs indiferenciadas es un punto de partida esencial para la diferenciación in vitro de células T. Al iniciar el co-cultivo, se recomienda que las células sean totalmente confluente sin estar abarrotado. Esto es por lo que la mayoría de las células cosechadas para la siembra de células en monocapas OP9 son mESC (en lugar de células de alimentación). Si se observan grandes diferencias en la confluencia entre los diversos clones mESC ser diferenciados en el día 0, entonces sería mejor para eliminar MEFs por pre-adhesión a tisplacas de cultivo sue (como en el paso 3.4.3-3.4.6 utilizando los medios de comunicación completa de células ES) antes de contar los mESCs para co-cultivo de siembra.
OP9 células deben estar en buen estado antes de la iniciación de co-cultivo (como se describe en la sección 2.4). Además, se piensa que OP9 células pierden algunas de sus propiedades con el cultivo prolongado y / o aumentos pronunciados en su tasa de proliferación 7 Evitar relaciones de división más allá de 1:. 5 durante el mantenimiento de OP9 células, y descartando las culturas OP9 continuos después de seis semanas, ayudará a evitar estas trampas.
En la siembra de células y de transferencia de células pasos iniciales del co-cultivo (días 0, 5, 8, 12, 16), las monocapas OP9 deben estar dentro de una gama óptima de confluencia. Figura 2 muestra la baja (Figura 2A) y alta (Figura 2B), extremos de la gama de OP9 confluencia celular recomendable para su uso en forma de monocapas de co-cultivo. Un ejemplo de una placa de sobre-confluentes se muestra en la figura2C Ure. El no mantener confluencia óptima puede inducir la formación de adipocitos (Figura 2D) que, en grandes cantidades, pueden afectar negativamente a la co-cultura.
En el día 0, el co-cultivo se inicia en OP9 células en lugar de OP9-DL1 células desde la formación del mesodermo se ve favorecida en OP9 células. Las células se sembraron en OP9-DL1 monocapas de células que comiencen a 8 días para inducir la producción de células T. Mientras que algunos clones mESC mostrarán visualmente (~ 90%) la formación robusta y cuantitativo de las colonias-mesodermo como por día 5 de co-cultivo (Figura 3A-B), otros pueden mostrar retrasos en este paso (Figura 3C-F). Bajo el microscopio, las colonias-mesodermo como derivados en este ensayo se han descrito de forma variable como parecido a las ruedas de carro o cráteres (Figura 4A) o, halos o floretes (Figura 4B).
Si bien el protocolo OP9-DL1 publicado refleja una norma de forma cuantitativa mesodermoción para el día 5 de co-cultivo, 7 nos encontramos con que no todos los clones ESC alcanzar esa norma dentro de este marco de tiempo. En estos casos, se cambia el medio en el día 5 y esperar otros 1-2 días antes de realizar el protocolo de "día 5" cosecha de células / transferencia. El objetivo de este retraso es permitir ~ 80-90% de las colonias de células madre embrionarias para convertirse mesodérmico visualmente antes de la transferencia. Es importante aclarar que esta cifra refleja un 80-90% discernible estrictamente visual criterio por el contraste de fase sencilla inspección microscópica de la morfología de colonia en los platos de co-cultivo. Se refiere sólo a la proporción de colonias que se asemejan a las ESC se muestra en la Figura 4. Es posible que algunos clones DESC no alcanzarán este criterio visual, incluso después de un retraso de dos días. En tal caso, es posible enriquecer la sangre para formar precursores mesodérmicos utilizando citometría de flujo para la clasificación de células Flk-1 + células, como se ha descrito anteriormente. 6,11 En cualquier caso, para la sake de conveniencia nomenclatura, que "reajustar el reloj" y se refieren a la fecha de transferencia de colonias de mesodermo como como "día 5"
Cuando varios clones ESC se diferencian en paralelo, es posible que algunas co-cultivos estarán listos para el día 5 en el paso del tiempo, mientras que otros van a la zaga. En este caso, es recomendable para retrasar el paso de todos los co-cultivos hasta que los clones más lentas alcanzar a los otros. El retraso no parece hacer ningún daño a los "a tiempo" co-culturas, pero beneficia a la posterior diferenciación de los clones más lentas mucho.
Día 8 (es decir, tres días después de la transferencia de colonias mesodérmico) ve la aparición y acumulación de HPC. HPC son visibles como grupos brillantes de células que se adherían débilmente a las células alimentadoras OP9 (Figura 5). Un procedimiento de lavado cuidadoso, utilizando una pipeta y los medios de comunicación en el plato, se separará y recoger los HPCs dejandola monocapa OP9 su mayoría intacta (Figura 6A-C). Este es quizás el paso más sensibles a la técnica del protocolo. Toma algo de práctica para encontrar los movimientos adecuados y la presión de eyección de medios para lograr el equilibrio deseado de la cosecha máxima de HPC con una interrupción mínima de la capa de alimentación. Es aceptable si algo de la monocapa OP9 despega, ya que la mayoría de cualquier monocapa perdida será capturado en la malla de nylon 40 micras después de la filtración. Figura 6D muestra una monocapa después de pipetear excesiva conduce a una mayor alteración de las monocapas de lo necesario. Durante esta etapa de lavado, es importante comprobar bajo el microscopio o no se han recogido todas las HPCs, y ajustar la presión de lavado en consecuencia.
El progreso de la co-cultivo se puede monitorizar mediante citometría de flujo. Para analizar específicamente la progenie hematopoyética no eritroide de la ESC, es importante primera puerta en las células CD45 + en vivo.Este paso impide la entrada de las células OP9 de los análisis, mientras que el uso de DAPI u otro colorante de tinción nuclear permite la exclusión de células no viables. Durante el día 12, muchos grupos de células pequeñas, redondas y brillantes deben ser visibles. No es necesario contar las células en esta etapa. Sin embargo, hemos observado que vivir, evento cuenta citometría de flujo cerrada están típicamente en el rango de 1-3 x 10 5 por día 12 co-cultura también. La citometría de flujo análisis de las células vivas cerrada diferenciadas en la monocapa OP9 producirá eritroide (NEG CD45, TER119 +) y monocitos (CD45 +, CD11b hi) linajes (Figura 7A). Los análisis de las células vivas, CD45 + diferenciadores en OP9-DL1 monocapas debe revelar marcadores característicos de CD4 / CD8 doble negación (DN) -1 (CD44 +, CD25 neg, neg CD4, CD8 neg) y DN2 (CD44 +, CD25 +, neg CD4, CD8 neg) células fase T (Figura 7B ng>). Durante el día 16, hay un aumento significativo en la cantidad de células pequeñas, redondas, brillantes en las culturas. En OP9-DL1s, T productos de diferenciación celular progreso a la (neg CD44, CD25 +, neg CD4, CD8 neg) DN3 y DN4 (neg CD44, CD25 neg, neg CD4, CD8) neg etapas. Algunos DP (CD4 +, CD8 +) las células T también pueden comenzar emergente por día 16 (Figura 7B). HPCs sembró en OP9 células producen células B (CD19 +) por día 16 el día 20 de OP9-DL1-mESC co-cultivo, habrá grandes cantidades de células T y DP único positivo (SP) las células T CD8 + presentes ( Figura 7B). Figura 8 proporciona un diagrama que resume los pasos clave de los procedimientos anteriores, y los puntos de tiempo de análisis sugeridos durante el co-cultivo.
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Figura 1. Fase imagen de microscopía de contraste de mESCs indiferenciadas (colonias de bordes afilados) que crece en la parte superior de una monocapa MEF (aumento de 100X).
Figura 2:.. Fase imágenes de microscopía de contraste de confluencia monocapa OP9 (A) (B) más altos niveles de confluencia aconsejables para co-cultivo pasaje / siembra (aumento 40X) (C) Ejemplo de un (ampliación sobre-confluente monocapa OP9 40X más bajo y ). (D) (magnificación Over-confluente monocapa OP9 200X) con la formación de adipocitos (grande, vesícula que contiene, células).
Figura 3: Fase microscop contrasteimágenes Y de la formación de colonias-mesodermo como de "día 5" de co-cultivo. (A) Vistas 40X y (B) 100X de placas de co-cultivo con> 90% diferenciación colonia mesodérmico. Estas placas están listas para el día 5 de paso. (CF) Ejemplos de placas Día 5 de co-cultivo que requieren 1-2 días aplazamiento antes de la transferencia (C & E, magnificación de 40X, D & F, un aumento de 100X).
Figura 4: Fase de imágenes de microscopía de contraste de la variedad de formaciones de colonias mesodermo como en el día 5 de co-cultivo (A) La morfología de la colonia conocida como "cráteres" o (B) La morfología de las colonias que se refiere. "Rueda de carro." como "estelar" o "florecillas" (aumento 200X).
Figura 5. Fase imagen de microscopía de contraste de día 8 Placa de co-cultivo con racimos de pequeñas, HPCs brillantes, redondas sobre una monocapa OP9 (aumento 40X).
Figura 6:.. Monocapa OP9 después de la recogida HPC en días de co-cultivo 8 (AC) gama apropiada de interrupción de la monocapa OP9 después de lavado cuidadoso para cosechar HPC (D) Un ejemplo de una monocapa OP9 que ha sido sobre-interrumpido por el día procedimiento de recogida 8 HPC.
Figura 7: citometría de flujo Representante (FACS) analiza en particular los puntos de tiempo durantemESC diferenciación in vitro. (A) Tinción para eritroide (izquierda), monocítica (medio) y células B (derecha) los productos de mESC-OP9 co-cultivo en el día 12 o 16 como se indica. (B) tinción para el desarrollo de las células T en los puntos de tiempo indicados mESC-OP9-DL1 co-cultivo. Por favor, véase el texto para una descripción detallada de los inmunofenotipos.
Figura 8 Diagrama de los pasos del procedimiento mESC-OP9 co-cultivo. (A) Los pasos clave de los primeros ocho días de co-cultivo de transferencia de células. El número aproximado de células sembradas en células OP9 en día se indican cero y cinco. (B) El paso de transferencia de los días 8 y los productos de diferenciación celular esperados detectados por citometría de flujo en los puntos de tiempo clave de co-cultivo. Por favor, véase el texto para una descripción detallada de los inmunofenotipos.
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Discussion
El sistema OP9-DL1 de co-cultivo se ha utilizado para estudiar el papel de los diversos productos de genes durante el desarrollo de tipos de células sanguíneas a partir de células madre. 8,12,13 También ha demostrado ser un modelo eficaz para estudiar la función del ADN reguladora del gen durante la diferenciación celular. 9,14 Con este enfoque como una alternativa a los modelos enteros de ratón puede producir un considerable ahorro en tiempo y coste de los experimentos que abordan muchas cuestiones básicas en la hematopoyesis. Sin embargo, la adaptación de este protocolo para estos fines requiere conocimiento del potencial de variabilidad entre clones mESC que serían utilizados en estos procedimientos. La línea de tiempo del protocolo publicado es esperable a partir de la media, en buen estado, línea mESC no manipulada. 7 Además, los clones mESC seleccionados para la generación de ratones quiméricos por lo general son de mayor calidad y llevará a cabo muy robusta en OP9 co-cultura . Por otro lado, los clones mESC emergente directamente desde establestransfección con un transgén ectópica integrado mostrará diversos grados de eficiencia diferenciación inicial que van de medio a medio por debajo. El protocolo descrito aquí proporciona un retraso estratégica 1-2 días de la etapa de paso de 5 días para igualar estas diferencias potenciales antes de la inducción de la hematopoyesis in vitro.
El paso día 8 es el paso en el que la ejecución de este protocolo tiene el mayor potencial para el error. La paciencia, la práctica y la observación cuidadosa le permitirá a uno para desarrollar la técnica que optimiza la cosecha HPC un mínimo de perturbaciones monocapa OP9. Más allá de las claves día 5 y el día 8 pasos, los parámetros críticos implican el mantenimiento meticuloso cultivo de células (particularmente células OP9, como se describió anteriormente) y especial atención a los reactivos utilizados en el protocolo. El reactivo más crítico es el FBS. Lotes distintos de FBS variarán notablemente en su capacidad para apoyar este procedimiento. Múltiples lotes deben ser probados en order para determinar que producirá robusta diferenciación en este ensayo.
Este sistema de co-cultura tiene sus limitaciones. Por ejemplo, este modelo no es compatible con la diferenciación de células CD4 positivas individuales. Una razón para esto es la falta de expresión de complejo mayor de histocompatibilidad infraestructura de la presentación de antígenos (MHC) de clase II en las células OP9. Se requiere 1 de la célula de presentación de antígenos de superficie por MHC de clase II para el adecuado desarrollo de las células CD4 SP. Las células CD8 SP que hacen emerger representan una mezcla de fases de timocitos CD8 SP maduros e inmaduros. 1 Por otra parte, el éxito del trasplante de mESC deriva progenitores de células T en un ratón requiere aprobación previa a través de cultivo de órganos del timo fetal. 1 Sin embargo, esta tecnología ha demostrado su prometer como un poderoso enfoque de investigación a ambas preguntas celulares y moleculares en la sangre y el sistema inmunológico de desarrollo que antes eran sólo es posible explorar en vivo. De este modo, además de proporcionar una nueva forma de avanzar más rápidamente en estas preguntas, una adopción más amplia del sistema de co-cultivo OP9-ESC tendrá el impacto más amplio de reducir el uso de animales de experimentación.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| Stem cell qualified FBS | Gemini | 100-125 | Heat inactivated |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| L-alanyl L-glutamine | Corning | 25-015-CI | |
| HEPES buffer | Millipore | TMS-003-C | |
| Non-Essential Amino Acids | ThermoScientific | SH30853.01 | |
| Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml) | Life Technologies | 15750-060 | |
| β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS | Life Technologies | 21985-023 | |
| Filter Unit | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm PES membrane |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CM | |
| α-MEM | Life Technologies | 12000-022 | Powder, reconstitute per manufacture recommendation |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| FBS | ThermoScientific | SH 30396.03 | Testing of individual lots required |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma | D2650 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand | R&D Systems | 308-FK | |
| Recombinant Murine IL-7 | PeproTech | 217-17 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | |
| Utrapure water with 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| MEFs mitomycin C treated | Millipore | PMEF-CF | Any mitotically arresteded MEFs can be used |
| DPBS | Corning | 21-031-CV | |
| Cell strainer (40 μm) | Fisher | 22363547 | |
| Tissue culture dish 100 x 20 mm | BD Falcon | 353003 | |
| Multiwell 6-well | BD Falcon | 353046 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | Tubes for FACS |
| ES R1 cells | ATCC | SCRC-1011 | |
| OP9 cells | Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan). | ||
| OP9-DL1 cells | Cells can be requested from the Zúñiga-Pflücker laboratory. | ||
| FlowJo software | Tree Star | FACS data analyses | |
| Flow Cytometer | BD | FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab |
References
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