Introduction
리포좀 집중적으로 연구 및 임상 응용에 가장 1,2- 생체 의용 약물 전달 시스템의 하나로서 역할을하고있다. 이들은 주로 천연 세포막의 일부를 모방하는 화합물이다 생체 둘 콜레스테롤 및 인지질로 구성된다. 친수성 물질은 수성 내부에 혼입 될 수있는 반면, 친 유성 제제는 리포좀 인지질 이중층 3 내에 내장 될 수있다. 리포좀의 수성 내부 내에 캡슐화 물질의 생체 내에서 분해에 대한 보호 기능을 부여하고 또한 종양 세포 파괴를 목표로 화학 요법 제를위한 예시적인 질병의 치료에 사용되는 세포 독성 약물의 독성 효과로부터 호스트 시스템을 방지한다. 폴리에틸렌 글리콜 중합체와 같은 리포솜 표면의 변형 (PEG 화)를 더 인해 sterical 안정화 (4)에 생체 내에서 리포솜 혈액 순환 시간을 연장한다. Moreov어, 리포좀 단백질 5, 6, 친수성 물질 7,8 효소 (9) 등 여러 가지 물질의 높은 농도를 격리한다 수 있습니다. 그러므로 그들은 암 치료 4 독소루비신으로 세포 독성 약물의 전달을 위해 자신의 승인을받을만한 신뢰할 임상 치료 및 진단 도구를 제공합니다. 유연성이 있기 때문에, 리포좀은 또한 진단 및 영상 유도 수술 목적의 형광체와 함께로드 될 수있다.
형광 이미징는 비용 효율적이며 그러나, 기본적인 요건을 요구 생체 진단 도구에 비 침습적. 이 생체 내 이미징을위한 가장 적합한 형광 색소가 빛을 분산 및 산란뿐만 아니라 물에서 발생하는 조직의자가 형광과 헤모글로빈이 낮은 범위의 특성 흡수 및 배출 최대 값이 있는지 입증 할 수있다. 따라서, 이러한 프로브는 650 nm의 10 (900) 사이에서 자신의 복근 / EM 최대 값을 가지고있다. 옵 소닌과 신속한 간극이 크게 생체 내 이미징 (11)을위한 그들의 적용을 제한 할 수 있으므로,이 외에, 시험 관내 및 생체 내 형광 색소의 안정성이 매우 중요하다. 불량한 안정성과 낮은 감도 또는 인도 사이 아닌 그린 (ICG) 12-16으로 볼 때 표적 장기에 세포 독성 효과와 같은 다른 효과는 원치 않는이며, 생체 내 이미징 프로브를 설계 할 때 고려되어야합니다. 이러한 관찰은 여러 임상 근적외선 형광 색소, 나노 입자뿐만 아니라 염증 반응, 암의 생체 내 이미징 및 영상 유도 수술 17 ~ 20를위한 새로운 기술의 적극적인 개발을 주도했다. 대부분의 전임상 NIRF (근 적외 형광)의 안정성에도 불구 염료 시험관, 간과 신장을 통해 빠르게 관류 및 클리어런스가 질환 및 염증 과정의 생체 내 이미징 광학의 사용을 방해.
ntent은 "> 따라서 우리는 다음과 같은 형광 색소의 캡슐화 프로토콜을 제시 잘 특징 근적외선 리포좀에 상대적으로 높은 농도 (21)에 자기 담금질에 그 경향이 알려져 형광 염료 DY-676-COOH. 높은 농도에서 H- 이량 체 형성 및 / 또는 파이 - 적층, 형광 분자 증가 사이 저농도. 스페이스를 형광 색소 분자 사이 포스터 공명 에너지 전이 (FRET)에 서로 포스터 반경 결과에 위치한 형광 분자 사이의 상호 작용을함으로써, 파이 - 스태킹 상호 작용을 방지하고 H-이량 체 형성 및 높은 형광 방출의 결과. 높고 낮은 농도 및 첨부 형광 소광 및 활성화 사이의 스위치는 광학 영상 (22)에 대해 이용 될 수 유망한 전략이다. NIRF 염료 고농도의 이러한 관점에서, 캡슐화 리포좀의 수성 내부에서 DY-676-COOH 더 파이다무료 염료에 비해 생체 내 이미징 vorable. 방법의 과제는 높은 농도의 염료를 캡슐화 인한 이득의 검증에서, 둘째 올바른 밀봉에 우선하고있다. 염료의 농도가 낮은 비 켄칭 리포솜 제형으로도 자유 염료의 켄칭 리포좀의 결상 특성을 비교하는 것은 필수적이다. 우리는 리포좀의 DY-676-COOH의 담금질 농도의 캡슐화가 가능하다 대체 동결 및 해동 사이클과 함께 간단하지만 매우 효과적인 필름 수화 및 압출 프로토콜을 보여줍니다. 이러한 역상 증발 법 (23)뿐만 아니라, 에탄올 주입법 24 리포좀을 제조하는데 사용하는 다른 방법은 많은 친수성 물질에 대한 높은 캡슐화 효율이 리포좀 제제를 사용. 그러나, 물질의 성질은 포위 효율에 영향을 미칠 수있는 캡슐화. 사실상여기에 제시된 필름 수화 및 압출 프로토콜은 DY-676-COOH의 캡슐화 가장 높은 효율을 밝혔다. 몇 시간 내에 염증 과정의 연구를 허용 DY-676-COOH, 자이 모산 - 유도 부종 모델의 리포좀 캡슐화의 장점을 설명하기 위해 사용되었다. 여기서, 캡슐화 DY-676-COOH 고농도 리포좀은 자유 염료 또는 낮은 염료 농도 비 켄칭 리포좀 제형보다 염증 과정의 생체 내 광 이미징 전신에 더 적합하다는 것을 입증한다. 따라서 기본 프로토콜은 형광 켄칭 리포좀 시험 관내 및 생체 내 활성 및 그들의 촬상 전위의 유효성을 생성하는 간단하고 빠른 방법을 제공한다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
참고 : 모든 절차가 지역 동물위원회 및 동물의 윤리적 사용에 대한 국제 지침에 따라 승인됩니다.
용 재료 및기구 1. 준비
- 자발적으로 형성된 소포 분산액의 제조 (SFV)
- 다음과 같은 인지질의 재고 솔루션을 녹여 준비 : 214 ㎎ / ㎖ 계란 포스파티딜콜린 (EPC), 134 ㎎ / ㎖ 콜레스테롤, 122 ㎎ / ㎖ 1,2- distearoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [메 톡시을 (폴리에틸렌 글리콜) -2000 (암모늄 염) (MPEG -DSPE 2000) 및 2 ㎎ / ㎖의 1,2- dioleoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine- N - (7- 니트로 2-1,3-benzoxadiazol -4- 유리 병에 클로로포름 및 저장소 일) (암모늄염) (NBD-DOPE).
- 둥근 바닥 플라스크에 대략 3 ㎖ 클로로포름 퍼니 및 EP 이루어진 리포좀을 제조하는 둥근 바닥 플라스크에 인지질 스톡 용액의 적절한 용적을 전송할C : 3 : Chol을 0.5 : 6.5의 몰비가 mPEG 2000 -DSPE. 리포좀의 이중 형광 라벨은 지질 용액에 0.3 몰 % NBD-DOPE를 추가합니다.
- 회전 증발기를 사용하여 55 ° C에서 감압 (300 밀리바) 하에서 유기 인지질 용액으로부터 클로로포름을 증발시켰다.
- 균질 인지질 막을 형성 한 후, 잔류 클로로포름 퇴적물을 제거하기 위해 1 ~ 2 시간 동안 10 mbar의 압력을 감소시킨다.
- 클로로포름이 증발되는 동안, 10 mM 트리스 버퍼 pH 7.4에서 DY-676-COOH (6.181 μM)을 녹여 액체 질소 듀어 용기를 입력합니다. 초음파 목욕에 전환하고 50 ° C로 설정.
- DY-676-COOH (6.181 μM) 자발적으로 형성 소포 (SFV) 분산이 형성 될 때까지 건조 인지질 막과 격렬하게 소용돌이를 수화하는 둥근 바닥 플라스크에 솔루션의 적절한 볼륨 (0.5 ml)에 전송합니다. 인지질의 모든 지질 손실을 방지하기 위해 분산되어 있는지 확인합니다.
- 조심스럽게 TRAnsfer 환저 액체 질소로 SFV 분산액을 함유하는 플라스크를 3-5 분 동안 분산 물을 동결. 다음 분산을 해동 1-2 분 동안 격렬하게 분산 와동 50 ° C에서 초음파 목욕에 둥근 바닥 플라스크를 놓습니다. 일곱 동결 및 해동 사이클의 총을,이 절차를 여섯 번 반복합니다.
- SFV의 압출 균질 리포솜 소포를 형성
- 1 ML의 주사기 (주사기)에 SFV 분산을 전송하고 주사기-B에 LiposoFast - 기본 압출기를 사용하여 100 nm의 폴리 카보네이트 막을 통해 분산을 돌출.
- 다시 주사기로, 주사기-B의 분산을 돌출, 다음 사이클을 열 번 반복합니다. 때문에 압출, 시간이 명확한 분산에 흐릿한 모습에서 주사기 변화의 솔루션입니다. 열 사이클 (스물 단일 압출 단계) 장치로부터 주사기-B를 제거하고 멸균 주사기 내로 직접로부터 최후에 분산액을 압출 한 후1.5 ml의 반응 관.
- 리포좀의 정제 무료 염료에서 DY-676-COOH를 캡슐화
- 10 mM 트리스 버퍼 pH 7.4 (컬럼 길이 28cm, 직경 0.8 cm)에 침지 G25 구슬을 이용한 겔 크로마토 그래피 컬럼을 준비한다.
- 겔 매트릭스에 샘플 드레인 겔 침대에 압출 소포 분산의 0.5 ml의 이동 및하자.
- 10 mM 트리스 버퍼 pH 7.4 (그림 1A)와 리포좀을 용출 및 열에서 완전히 무료 염료 배수 될 때까지 열을 씻는다. 필요하다면, 수집하고 제조업체의 지침에 따라 탈염 탈수하여 무료 염료를 재활용합니다.
- 다음 10 멸균 mM 트리스 버퍼 pH 7.4의 적절한 볼륨을 분산 초 원심 분리 (200,000 XG, 8 ° C에서 2 시간)에 의해 용출 된 리포좀을 집중.
- 캡슐화 된 DY-676-COOH 농도의 정량화
- DY-676-COOH (0, 82, 124을 용해하여 검량선을 작성,10 mM 트리스 완충액 247, 494, 988 nM의)은, pH가 0.1 ~ 7.4 % 트리톤 (Triton) X100을 포함.
- 소포를 파괴하고 캡슐화 된 염료를 해제하는 1 % 트리톤 (Triton) X100을 포함하는 100 ㎕의 트리스 완충액에서 실온에서 5 분 동안 리포좀 2 μL (50 밀리몰 / L 스톡 100 nmol의 최종 지질)을 녹인다. 이어서 0.1 %의 트리톤 X100 최종 농도 10 mM 트리스 완충액, pH를 7.4으로 시료를 희석 (V / V) 1 ml의 총 부피를 만드는. 중복의 모든 샘플을 준비합니다.
- 여기 λ = 645 nm의 방출 λ = 700 nm에서 흡수 및 배출 모든 샘플 (무료 DY-676-COOH 트리톤 - X100 처리 리포좀)을 측정한다. 정하고 캡슐화 염료의 농도를 결정하는 자유 염료의 검량선을 사용한다.
- 리포좀 특성
- 동적 광산란에 의한 리포좀의 크기와 제타 전위를 결정합니다. AC 멸균 필터 (0.2 μm의) 10 mM 트리스 버퍼 pH 7.4 리포좀 샘플을 희석100 ~ 300 μM (지질)의 oncentration. 저용량 일회용 큐벳으로 희석 샘플을 전송하고 제조자의 지시에 따라 샘플을 측정한다.
- 표준 프로토콜에 따른 리포솜 소낭들의 크기, 완전성 및 균질성을 입증하기 위해 전자 현미경에 의해 특성화 리포좀.
2. 형광 담금질의 확인 및 준비 리포좀의 활성화
- 형광 소광 활성화 및 물리 화학적 분석
- 립-Q에 대한 두 개의 1.5 ml의 튜브와 무료 DY-676-COOH 2 튜브를 준비합니다. 전송 100 nmol의 총 지질 튜브에 대응 (캡슐화 DY-676-COOH 138 ㎍ / ㎖를 함유하는 42 밀리몰 / L-Q 립 스톡 용액 2.38 μL). 립-Q의 색소 함량 (138 ㎍ / 1,000 μL 사용 립-Q μL X 2.38에서 예를 들어 결과 0.38 μg의) 무료 DY-676-COOH 상당을 전송합니다. 하나의 욕조를 품어4 ° C에서 각 프로브의 전자 및 -80 ° C 하룻밤 (16 시간)에서 제 2 튜브를 동결.
- 30 ° C까지 가열 블록을 가열. 짓 눌린 얼음 냉각 상자를 채우고 실온에 10 mM 트리스 완충액 pH 7.4의 나누어지는 평형.
- 4 ° C에서 프로브를 제거하고 5 분 동안 30 ° C에서 -80 ° C에서 프로브 (빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일에 싸서) 신속하게 해동 실온에서 평형. (또한 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일에 싸서) 실온에 전송하기 전에 1 분 동안 얼음에 해동 프로브를 진정.
- 100 ㎕의 최종 부피로 각각의 프로브 10 mM 트리스 완충액 (pH 7.4)를 첨가하고, 실온에서 10 분 동안 평형을 모든 프로브.
- 피펫 80 저용량 유리 큐벳 각 프로브의 μL 및 분광기상에서 400 내지 900 nm의 각 프로브에서의 흡수를 측정한다. 그에 상응하는 튜브에 프로브를 돌려줍니다.
- 적당한 유리 큐벳에 각 프로브의 80 μl를 전송674 nm에서 흥미로운 프로브에 의한 분광에 형광 방출을 측정하고 694-800 nm의에서 형광을 측정.
- 세포 흡수 및 형광 활성화
- 표준 상태 (37 ° C, 5 % CO 2 95 % 가습 분위기)에 따라 해당 문화 미디어 다음 세포주를 얻고 문화. 여기서, 뮤린 대식 세포주 J774A.1를 이용 (둘 베코 이글 배지를 10 % (v / v) 소 태아 혈청이 보충 된 수정 된), 인간 뇌종양 세포주 U-118MG (필수 비타민 및 10 %를 함유하는 MEM (V / ⅴ) 소 태아 혈청)와 인간 섬유 육종 세포주, HT-1080 (5 % FCS로 RPMI).
- 폴리 -L- 리신으로 코팅 8- 웰 챔버 슬라이드 (각 웰에 100 ㎕의 0.001 % 폴리 -L- 리신을 추가하고 10 분 동안 37 ° C에서 배양한다. 대기음 용액 챔버 슬라이드 적어도 4 마르기하자 무균 작업대에 실온에서 시간. 챔버 슬라이드를 씻어 3필요할 때까지 200 μL 행크 완충 식염수 용액으로 시간 후 39 ° C에서 파라핀, 알루미늄 호일 및 저장으로 그들을 밀봉.
- 챔버 슬라이드가 건조하는 동안 필요한까지, 4 ° C에서 리포좀과 염료 용액 및 저장을 필터 소독.
- 생체 NIR 형광 이미징 시스템에서의 전신 흡수 프로브와 분석을 위해 시험 3 세포주의 각각에 대한 5 작은 배양 플라스크 (총 15 주 형틀)을 제조. 시드 2 × 10 6 J774A.1, U-118MG과 (quintuples)에서 각각의 배지 5 ㎖와 문화 플라스크 당 HT-1080 세포는 16 ~ 24 시간 동안 성장한다. 상기 배양 플라스크에 평행하게 각각 챔버 슬라이드 2 웰에 각각의 세포주 (J774A.1 및 HT-1080) 또는 20,000 세포 (U-118MG) 30,000 세포를 시드 및 16-24 시간 동안 500 ㎕의 배양 배지에서 성장 .
- 다음날, 세포 라인 당 챔버 슬라이드 각 세포주의 한 웰에 두 플라스크 립 Q-100 nmol의 (최종 지질 량)을 추가한다.즉시 1 ~ 4 ° C에 세포주 당 플라스크 인큐베이터에 두 번째 플라스크를 전송합니다.
주 : 챔버 슬라이드에 집중하게 프로브 부피 플라스크에 첨가하고, 챔버 슬라이드를 동일한 10 배 이상 (5 ml를 500 ㎕의 배양 배지이다). 미세한 검출 플라스크로부터 세포 펠릿 결상 NIR 형광 이미징 시스템보다 덜 민감하기 때문에 필요하다. - 세포주 당 챔버 슬라이드 각 세포주의 한 웰에이 플라스크에서 세포 립-Q의 염료 함량 농도 상당액 자유 DY-676-COOH를 추가 한 다음 즉시 세포주 당 한 플라스크를 전송할 4 ° C의 (에너지 고갈) 및 인큐베이터에 챔버 슬라이드와 함께 다른 플라스크에. 해당 조건에서 24 시간 동안 모든 세포를 품어. 프로브없이 플라스크의 세포는 치료를받지 않은를 제공합니다.
- NIRF 이미징 및 반 정량 분석
- 24 시간 배양 기간 후 행크스와 세포를 2 회 세척 플라스크에서 세포를 수확 500 μL 튜브 소금 용액 (HBSS) 다음 원심 분리 (200 XG에 5 분) 500 μL HBSS에 세포 펠렛을 긁어 버퍼링.
- 여기 (615-665 ㎚) 및 배출 (> 700 nm의에서 컷)의 세포 펠렛 (및 HBSS) NIRF 이미 저와 이미지를 사용하여 필터로 튜브를 놓습니다.
- 자가 형광 공제 및 제조업체 지침에 따라자가 형광 대 대상의 강도를 평가합니다. 이것은 측정치들이 서로간에 비교할 수 있도록, 노광 시간, 카메라 이득 비닝 및 비트 깊이 스케일링 후에 카운트 레벨을 나타내는 평균 신호로서 형광 강도 (스케일링 계수 / 초)의 반 정량적 수준을 줄 것이다.
- 공 초점 현미경 분석
- 24 시간 배양 후, 500 μL HBSS로 2 회 세척 챔버 슬라이드에 세포를 수확.
- 가전 수정200 μL HBSS 실온에서 30 분 동안 3.7 % (v / v)의 포름 알데히드를 포함와 재편.
- 고정이 진행되는 동안, DNA 얼룩 장착 솔루션, 훽스트 (Hoechst)-33258 1:50 희석.
- 고정 후, 다음 HBSS와 세포 2 번 씻어 유리 슬라이드에서 챔버를 분리합니다. 챔버 슬라이드의 우물에 해당하는 각각의 자리에서 DNA 얼룩을 포함하는 50 μl를 장착 솔루션을 추가합니다. RT (어두운)에 투명 매니큐어 및 자연 건조 10 분으로 가장자리를 밀봉, 커버 글라스와 세포를 커버.
- 적합한 형광 현미경 공 초점 현미경 이미지 세포. 핵 (훽스트-33258 : 여기 405 nm의, 방출 420-480 nm의) 해당 구성 요소의 시각화를위한 다음 여기 및 방출 설정을 사용합니다. NBD-DOPE (리포좀 지질 : 여기 488 nm에서 530 ㎚). DY-676-COOH (NIR 형광 염료 : 여기 633-645 nm의 방출 650-700 nm의).
주 : 확인이 형광 현미경로만 제공은 더 높은 630 나노 미터보다 파장의 여기 및 방출을 허용 적절한 필터가 장착되어 있습니다.
3. 염증의 생체 형광 이미징에서 리포솜 기반
- 동물 및 재료의 제조
- 하우스 8~12주 된 물과식이 표준 조건에서 약 36g 무게 남성 NMRI 마우스.
- 세븐 일 전에 실험의 시작, 조직자가 형광을 줄이기 위해 모든 쥐에게 낮은 페오 포비 다이어트를 제공합니다.
- 24 시간 각 실험의 시작하기 전에, 원하는 영역에서 마우스 면도 (예, 뒷 다리 부종의 촬상이 요구되는 경우에이면의 전체 면적).
- 동물의 무게를 측정 및 프로브의 양을 계산 립-Q 사용의 내용을 염색 무게와 무료 DY-676-COOH (해당하는 kg 당) 10 μmol (지질 농도 마우스 (립-Q와 립 dQ를 당 주입한다) .
- 이미지 동물세포 펠릿에 사용 된 것과 동일한 설정을 사용하여 전신 NIR 형광 이미 저. 이 측정은 동물의자가 형광을 제공합니다.
- 1 ml의 등장 성 식염수를 10 mg을 모산-A를 용해하고 4 ℃에서 하룻밤 저장합니다.
- 염증 및 생체 내 NIRF 이미징의 유도
- 다음과 같은 솔루션이 포함 된 마우스에 3 주사기를 준비합니다. 50 μL 모산-A 용액 (10 ㎎ / ㎖) 50 ㎕를 등장 성 식염수와 두 번째 주사기와 하나의 주사기를 입력합니다. 제어 동물 용 립-Q와 립 dQ를 (10 μmol / kg 체중 (지질)가) (립-Q에서와 같이 농도) 시험 동물 무료 DY-676-COOH를 위해 지정되어있다 프로브와 세 번째 주사기를 입력합니다. 프로브는 150 μl의 최종 볼륨에 무균 HBSS로 희석되어 있는지 확인합니다.
- (건조를 방지하고 깊은 잠까지 2 % 이소 플루 란과 동물을 마취하고 발에 터치시 반응하지 않는하기 위해 동물의 눈에 아이 크림을 적용이)은 약 2 분 소요됩니다.
- (아직 마취) 따뜻한 매트에 마우스를 놓고 오른쪽 뒷다리에있는 모산-A 솔루션 피하 왼쪽 뒷다리에 식염수를 주입. (t 0 시간을 =로) 주입 / 측정 기록 시간을 즉시 정맥 프로브를 삽입 한 후 이후 이미지 동물을. 이미지 큐브 같은 결과 이미지를 저장하고 다른 모든 동물과 각각의 프로브에 대해 위 단계를 반복합니다.
- 이미지 동물 측정 챔버의 단계 (예를 들어, 아래 따뜻한 매트를 배치하여) 따뜻한있는 것을 확인하고 매 10 시간 게시 주사 2 시간 후에서 24 시간 후 주입, 저체온증을 방지하기 위해. 각 측정 한 후, 음식과 물을 광고 무제한으로 새장에 동물을 배치하고 온화한 동물 실에서 케이지를 배치합니다. 동물이 더 이상 터치에 반응하지 트면, 5-10 분 동안 이산화탄소 안락사 만드는 2 % 이소 플루 란 마취 제 의한 동물을 안락사반드시 동물이 완전히 호흡을 중지하고 엄격 경직이 발생.
- 표준 온라인으로 평가 될 수있다 프로토콜 (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) 및 이미지 기관에 따라 쥐를 해부하다.
- 먼저 동물 (unmixing) (식염수로 뒷다리 왼쪽) 형광도에 대한 관심과 염증이 영역의 목표 형광 (모산-A와 오른쪽 뒷다리)의 다음 할당 영역의 전체 형광을 차감 한 제조업체의 지시에 따라 측정 결과를 평가합니다.
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Representative Results
이러한 리포좀의 수성 내부에 여기에 사용 NIRF 염료 DY676-COOH와 같은 형광 염료의 고농도의 캡슐화는 형광 소광의 하이 레벨로 이끈다. 형광 급냉, 고농도 많은 형광체와 함께 볼 현상은, 대상 지역의 높은 감도 및 신뢰성있는 검출이 요구되고 생체 내 이미징 애플리케이션의 여러에서 이용 될 수있다. 리포좀의 사용은 또한 생체 내 (in vivo) 적용을위한 필수 불가결 염료의 보호를 제공한다. 리포좀의 철저한 특성화가 필요하며 생체 내 이미징을 위해 염료 캡슐화, 안정성과 리포좀의 크기, 형광 담금질 및 체외에서 캡슐화 된 색소의 활동도 적용의 수준 등 여러 가지 요인을 포함한다. 자유 염료의 비교, DY-676-COOH와 켄칭 리포좀 (립-Q)뿐만 아니라 매우 낮은 콘센트와 비 켄칭 리포솜 (dQ를 립)캡슐화 된 염료의 비율은 특히 생체 내 특성화에 대한 때문에 중요하다.
압출 전에 연속적인 냉동 및 해동 사이클 막 수화 및 압출 기술을 이용하여 제조 된 리포좀 빠르게 용출 리포좀 (비교 성공적 겔 여과 행렬에서의 장기간 보존에 의한 리포좀으로부터 분리 될 수있는 잔류 자유 염료 분자를 포함 그림 1B). 겔 여과 후의 희석의 정도에 따라 선택적 초 원심 분리 공정 (도 1C) 도시 된 바와 같이 리포좀 농도를 가능하게한다. 캡슐화 된 염료의 흡수 및 방출 특성들에 기초하여, 캡슐화 된 염료의 농도는 자유 염료 (도 1D)의 검량선의 도움으로 결정된다. 캡슐화 된 염료의 농도 게다가 후미 리포좀의 크기와 균일 성을 결정하는 것이 중요어 준비. 도 1E에 도시 된 바와 같이, 기본이되는 방법에 의해 제조 된 리포좀의 전자 현미경 사진 intravesicular DY-676-COOH를 함유하는 급냉 농도 범위 내에서 (립-Q를 리포좀 소포 주로 라멜라 형태학 공개; 606-846 μM의 DY-676 ) 또는 비 침묵 염료 농도 (립 dQ를에서 25 μM DY-676). 또한, 그들은 훨씬 1 (표 1) 아래 약 120 nm이고, 분산 지수 균일 크기 분포를 보여준다. 형광 소광에 의해, 립-Q는 하나의 피크가 청색 파장쪽으로 시프트에 의해 특징된다 수성 완충액 개의 최대 흡수를 나타낸다. 이와 라인에서 형광 방출은 무료 염료 (그림 2A와 B, 오른쪽)에 비해 매우 낮다. 주변 용액에 희석되는 염료의 릴리스의 리포좀 결과-손상을 동결. 블루 쉬프트 흡수 피크 따라서 디sappears, 립-Q의 하나의 흡수 피크의 결과. 이에 대응하여, 동결 손상된 입술-Q의 형광 강도의 증가가 해제 염료 분자의 형광 활성화가 일어나는 나타내는, 볼 수있다. 자유 염료는 관계없이 냉동 (도 2A와 B, 왼쪽)과 동일한 수준으로 유지 하나만 최대 흡수 및 높은 형광 강도를 보여준다. 환경에서 염료를 보호 고농도과 관련된 형광 소광을 유지하고 목표 트리거에 의해 활성화 된 경우에 형광을 증가시키는 것으로 인한 검출을 가능하게 할 것이다 립-Q와 같이이 발견은, 리포좀의 염료의 캡슐화를 의미한다.
기본 지질 리포좀 조성물 프로브 에너지 고갈에 의해 억제되는 우세한 균성 흡수를 보여준다. 이것은 고도로 균성 뮤린 대식구 세포주 J774A.1 의해 립-Q의 흡수를 통해 볼 및 수약간 식세포 인간 아교 모세포종 세포주 U-118MG 37 ° C에서와 억제 4 ° C (그림 3a 및 B)에서. 무료 염료 DY-676-COOH는 탐식 세포 라인에 모두 37 ° C에서와 리포좀 프로브 립-Q는 솔루션에 잔류 무료 염료를 포함하지 활성 흡수를 만받을 수 있음을 나타냅니다 4 ° C에서 흡수를 보여준다. 공 초점 레이저 주사 현미경 이미지는 더 식세포 (그림 3C)에서 립-Q의 이해 및 활성화를 입증. 또한, 비 탐식 인간 섬유 육종 세포주에서 형광의 부족, HT-1080 식세포 단핵구 / 대 식세포가 관련 염증의 촬상에 적합한 것, 립-Q의 흡수는 주로 식균 작용에 의해 이렇게임을 나타낸다.
배양 세포 라인에서 볼 리포좀의 식세포 흡수과 일치하고, 시간 -에 립-Q 리드의 정맥 주사를 담금질 형광 때문에매우 낮은 배경 형광 쥐 모델에서 부종 (그림 4A, 립-Q)의 형광 강도에 따라 증가. 부종의 최대 형광 강도는 립-Q의 8 ~ 10 시간 포스트 분사를 검출한다. 전체 마우스 반대로, 상대적으로 강한 NIR 형광은 무료 DY-676-COOH (그림 4A, DY-676-COOH) 또는 상시 리포좀, 립 dQ를 (그림 4A, 립 dQ를 적용 한 후 볼 수 있습니다 ). 부종의 안정적인 검출 (그림 4A, DY-676-COOH 수 없습니다 있도록 0-4 시간 포스트 분사에서 본 립-Q, 빠른 관류 및 무료 DY-676-COOH의 간격에 비해, 영상 방해 ). 또한, 비 켄칭 리포좀, 립 dQ를 8 시간까지 거의 일정하게 유지 2-4 열연 포스트 분사 내의 부종의 최대 형광을 계시 한 후 서서히 켄칭 립-Q 기반 부종 형광 유사한 감소한다. 반 정량적 항문을 수행yses, 관심 영역 (ROI를가) 배경 대 부종에 대한 설정함으로써, 하나는 다른 프로브 검출의 다른 수준에 대한 결론을 만들 수 있습니다. 그룹 (프로브) 당 5 동물의 반 정량 분석에 따르면, 부종 (P = 0.001) 무료 DY-676-COOH 또는 비 침묵, 립 dQ를보다 립-Q 검출 (그림 더 크게 할 수있다 (b)).
마우스의 이미징 기관은 프로브의 24 시간 후 분사가 제거 증거 역할을하는 간 / 담낭, 신장 및 매우 낮은 또는 비장의 형광, 폐와 심장 (그림 5)의 가벼운 생체 형광을 공개 안락사 간담 경로를 통해 프로브.
그림 1 : DY-676-COOH로드 리포좀의 제조에스. (AC)과 관련된 합성 단계의 개요도. (A) 근적외선 염료 DY-676-COOH와 막 수화 압출 설정. (B) 계면을 나타내는 자기 - 겔 여과 설치 그림 비 캡슐화 (무료) 염료와 리포좀 사이. 리포좀 먼저 용출 인해 캡슐화 된 DY-676-COOH (파란색)에 파란색 - 녹색 표시 및 통합 녹색 인지질, NBD-DOPE. (C) 리포좀 침전물 (립-Q)의 대표 이미지 초 원심 분리하여 농축 한 후. ( D) 리포좀 염료의 정량에 사용되는 10 mM 트리스 pH가 7.4 (1 % 트리톤 X100을 포함). (E) 립-Q의 곳을 알아내는 - 투과 전자 현미경에서 DY-676-COOH의 대표 교정 곡선. 보려면 여기를 클릭하십시오 그림의 큰 버전.
그림 2 :. 체외에서 형광 담금질 및 활성화의 물리 화학적 결정 립-Q (오른쪽)과의 (A) 흡수 스펙트럼 무료 DY-676-COOH 10 mM 트리스 버퍼 pH 7.4로 측정 (왼쪽), 전 또는에서 동결 후 - 80 ° C. . 무료 DY-676-COOH와 립-Q의 동결 손상 후에는 파란색 편이 피크의 실종에 비해 립-Q의 특성 이중 피크를 참고 (B) (오른쪽) 립-Q의 형광 방출 스펙트럼을 대응 무료 DY-676-COOH (왼쪽) 전 또는 -80 ° C에서 동결 후 10 mM 트리스 버퍼 pH 7.4로 측정.
그림 3 : 입술의 세포 흡수 및 형광 활성화 osomes.에서 이미지 (A)는 지시 된 온도에서 24 시간 동안 해당 프로브에 노출 된 후 세포 펠릿의 NIR 형광 촬상하여 제조 하였다. HT-1080 세포를 4 ℃에서 24 시간 배양 기간을 생존하지 않았다. (B)에서 바 다이어그램은 각 막대는 SD ± N = 3 실험의 평균 농도를 나타내고 A.에서 세포 펠렛에 ROI 영역을 지정하여있어 형광 신호의 반 정량적 수준을 나타낸다. (C)의 이미지는 37 ° C에서 24 시간 동안 배양 챔버 슬라이드에 프로브 세포에 노출 공 초점 레이저 주사 현미경에 의해 취득 하였다. 높은 균성 뮤린 대식 세포주 J774A.1에서 형광의 하이 레벨 온화한 균성 인간 뇌종양 세포주 U-118MG에 적당한 형광을 참고. 비 균성 인간 섬유 육종 세포주 HT-1080 프로브의 형광 특성을 보여주지 않는다. NBD-DOPE : 녹색 형광 인지질.로드 / 52136 / 52136fig3highres.jpg "대상 ="_ 빈 "> 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
마우스 지 모산 - 유도 부종의 생체 내 광 이미징도 4. (A) 왼쪽 마우스 픽쳐 피하의 위치가 모산-A (500 μg의 μL의 생리 식염수 (50))와 제어 식염수인가 쇼 (50 μL) 왼쪽 측면에. 지정된 시간 지점에서 지시 된 프로브와 몸 전체 NIR 형광 이미징의 정맥 주사는 점진적으로 공개하지만, 8 시간 포스트 분사에서 최대 형광과 립-Q (상단 패널)의 부종과 낮은 배경 신호의 형광 신호의 높은 증가. 무료 염료 4 시간 포스트 분사 내 관류하고 신속한 통관 (가운데 창을 보여준다L), 립 dQ를가 낮은 신호 강도 및 전반적인 높은 배경 형광과 부종의 탐지를 보여 반면. (B)의 그래픽 프리젠 테이션은 N의 제어 영역 (식염수) = 그룹 당 5 동물에 비해 각 프로브로 검출 부종이 관찰 된 형광 신호를 유지한다. 각 플롯 (5 N =) SEM ±의 평균 형광 신호를 나타냅니다. 그래프로, 각 프로브로 검출 부종의 최대 형광 신호는 (; 립 dQ를 2-4 시간 무료 DY-676-COOH, 2 시간 포스트 분사 립-Q, 8 시간)을 쉽게 구별된다. 이 t에서 립 dQ를 대 립-Q = 0-24 시간과 부종이 유의 (P = 0.001)보다 높은 형광 강도이고, t에서 무료 DY-676-COOH 대 립-Q = 4-24 시간에. 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 마우스 24 시간 후 프로브 응용 프로그램에서 기관의 바이오 광학 생체 이미지 및 기관의 형광 강도의 대응 반 정량 분석. 각 막대는 형광 강도의 평균을 나타냅니다 (N = 4) SEM ±. 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 리포좀 제형 | 크기 [나노] | 다 분산 지수 (PI) | 제타 전위 [MV] |
| 립 dQ를 (dequenched) | 123.4 ± 0.6 | 0.055 ± 0.02 | -10.6 ± 0.4 |
| 립-Q (침묵) | 118.5 ± 0.7 | 0.04 ± 0.02 | -9 ± 2 |
| 립 NBD (w / DY-676-COOH O) | 123.0 ± 1.4 | 0.04 ± 0.03 | -11 ± 1 |
표 1 : 동적 광산란에 의한 리포좀의 특성.
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Discussion
리포좀은 또한 형광 염료 전달 시스템에 대한 역할을 할 수 있기 때문에, 그것들은 대상 질환의 촬상을 가능하게한다. 이러한 NIRF 염료, 여기서 사용 DY676-COOH, 형광 염료 등의 고농도의 캡슐화는 포획 염료의 형광 소광의 하이 레벨로 이끈다. 형광 급냉, 고농도로 많은 형광체와 함께 볼 현상은 대상 영역의 높은 감도 및 신뢰성있는 검출이 요구되는 생체 내 이미징 애플리케이션에서 여러 가지로 이용 될 수있다. 리포좀의 사용은 또한 생체 내 (in vivo) 적용을위한 필수 불가결 염료의 보호를 제공한다.
영화 수화 및 압출 기술은 필요에 따라 다른 크기 범위와 리포좀의 성공적인 준비를 할 수있는 널리 사용되는 방법이며, 서로 다른 물질 (25)의 다수의 캡슐화 등의 수정을 허용합니다. 따라서, 립의 제조에 적합osomes 이미징을 위해 NIR 형광 염료, DY-676-COOH로 캡슐화. 이 방법은 염료의 침묵 농도 내에 600-840 μM intravesicular 염료 농도와 리포좀을 얻을 수 있습니다. 자발적으로 형성된 소포 분산액의 균질화를 위해 사용 LiposoFast - 베이직 손 압출기는 1 ml의 부피까지 주사기로 인해 장치의 호환성, 작은 실험실 규모 리포솜 제제에 적합하다. 대규모 준비 시간당 1,000 리터의 용량 소포 분산을 균일화 할 수있는 큰 고압 균질의 사용이 권장된다. 겔 여과 (크기 배제) 크로마토 그래피를 비 캡슐화 (유리) 염료 분자 (26)로부터 리포좀 캡슐화 된 염료의 분리를 보장하는 중요한 단계이다. 겔 여과 칼럼의 길이는 무료 염료의 리포좀의 효율적인 분리에 매우 중요합니다. 따라서, 적어도 28cm 길이 t의 칼럼을 준비 할 필요가있다O를 성공적으로 여기에 사용되는 무료 DY-676-COOH에서 리포좀을 분리합니다. 흥미롭게도,이 길이는 한 그 무료 카복시에서 카복시 (CF)로드 리포좀을 정화하는 데 사용으로 두 배이다. 겔 여과의 주요 단점은 정제 된 시료의 5-6 배 희석한다. 고농축 리포좀이 필요한 경우는, 초 원심 분리에 의해 보상 될 수있다. 동안 초 원심 리포좀 침전물과 상등액 27 쉽게 제거 될 수있다. 투석 (28)에 의해 리포좀을 집중 할 수있는 다른 방법은 더 많은 시간을 초 원심보다 많이 소요됩니다.
필름 압출 및 수화 방법 외에, 역상 증발 법 (23)뿐만 아니라, 에탄올 주입법 (24)는 많은 친수성 물질에 대한 높은 캡슐화 효율을 갖는 리포좀 제제를 사용. 그러나 우리의 조사는 동결 및 해동 사이클과 결합 된 필름 수화를 밝혀들 DY-676-COOH의 충분한 intraliposomal 캡슐에 가장 적합한 방법이 될 수 있습니다. 필름에 사용되는 수화 초기 DY-676-COOH 농도를 증가 시키면 효과와 30 ㎜의 고정 된 지질 농도를 사용 intraliposomal 염료의 농도를 증가시킨다. 동결 및 해동 방법이 밀봉 효능에도 불구하고 사용 출발 염료 농도가 10 % 이하이지만, 그러나 이미징을 위해 요구되는 농도 소광 캡슐화 충분하다. 또한, 겔 여과에 의해 분리 리포좀 자유 염료 탈염 탈수 제조사의 지시에 따라, 가능한 한 최소의 전체적인 염료 손실 재 밀봉함으로써 재활용 될 수있다. 다 분산 지수 립-Q의 전자 현미경에 의해 본 기본 프로토콜에 의한 염료의 캡슐화는 크기 및 리포좀의 형태에 영향을 미치지 않는다.
간단한 몇 가지 방법이 evaluat하는데 사용될 수있다전자 제조 된 형광 liposomes.DY-676-COOH의 활동은 아마 H-이량 체 형성과 염료 분자 사이의 파이 - 스태킹 상호 작용으로 인한 높은 농도 21,29에서 자기 담금질에 높은 경향이있다. 높은 농도에서 염료 분자의 포스터 반경의 근접성으로 인해 발생하는 이러한 상호 작용은, 희석 (30)에 의해 소멸 될 수있다. 따라서, DY-676-COOH 고농도의 밀봉은 이에 높은 농도를 유지하고, 청색 - 시프트 된 흡수로 검출 할 수 형광 소광을 유지, 생체 내뿐만 아니라 주변의 버퍼로부터 옵 소닌에서 염료를 보호하지 않는다 피크 및도 2에 도시 된 바와 같이 낮은 형광 방출. -80 ℃에서 서서히 리포솜을 동결 경솔 30 ° C에서 해동시 리포솜 막에 손상을 초래 수성 내부 (31) 내에서 얼음 결정의 형성을 유도. 릴리스, 희석 및 형광 ACTI립-Q 따라서 높은 담금질 농도를 담즙산이 있음을 나타냅니다 하나의 흡수 피크에서 밝혀 고정한 후 버퍼에 내 리포좀 DY-676-COOH의 vation 및 형광 강도의 거의 2.5 배 증가 (그림 2) DY-676-COOH 및 기동입니다. 둘 다 많은 형광 염료 (32)의 분광 특성에 영향을하기 때문에 다른 방법은, 이러한 자유 염료 및 리포좀 캡슐화 된 염료 사이의 분명한 차이를 공개하지 않기 세제 또는 유기 용매의 사용으로 리포좀의 지질 이중층에 손상을합니다. 느린 동결 따라서 여기에보고 거친 해동 방법은 리포좀의 형광의 높은 캡슐화 및 그에 따른 형광 담금질을 확인하기 위해보다 안정적이고 유망한 방법으로 제공합니다. 그대로 립-Q (도 2)의 흡수 및 방출 스펙트럼에서 잔여 형광의 일부 레벨을 검출 할 수있다. 이 리포 내의 비 켄칭 염료 단량체로부터 발생할 수SOMES 또한 정전 기적 상호 작용과 인지질 극성 머리 그룹 (33)에 의해 캡슐화 된 색소의 영향에서.
도 3에서 알 수있는 바와 같이, 매우 식세포 뮤린 대식구 중성 균성 인간 아교 모세포종 세포주 립-Q의 별개의 축적, U-118MG 34하지만 그렇지 않은 균성 인간 섬유 육종 세포주 HT-1080로 표시한다 식세포는 염증 과정의 핵심 선수이기 때문에 그게 염증의 립 Q- 기반 이미징은, 유리한 것입니다. 에너지 고갈은 무료 DY-676-COOH 흡수를하지 립-Q의 흡수를 폐지하지만 사실은 립-Q의 식세포 흡수의 특이성을 입증 할 립-Q는 실험 기간 동안 유지되고있는 점 계시 염료의 다른 버전과 에너지 독립 흡수는 감지 형광 선도 자리를 차지할 것입니다. 녹색 형광 인지질을 포함, 리포좀 이중층의 NBD-DOPE는 현미경 이미징 및 discriminatio 수 있습니다N 사이에 이전 (32)보고 된 시간에 따라 흡수 실험 완료 특히 휴대 전화 성능이 저하 된 리포좀에서 비 저하. 현미경 이미지는 37 ° C에서 배양 한 후 반 정량 분석에 의해 결정되는 바와 같이, 세포 펠릿의 형광 농도의 수준과 상관, DY-676-COOH의 NIR 형광도를 보여준다. 인간 아교 모세포종이 DY-676-COOH와 이전보다 NBD-DOPE 모두 낮은 형광 공개 반면 이에 따라, 뮤린 대식구 세포주, 높은 형광을 나타낸다. 인간 섬유 육종 세포주를 예상 한 바와 같이, HT-1080 리포좀 성 염료 또는 립-Q 흡수, 식세포 작용에 의해 주로 사실을 강화 자유 DY-676-COOH, 어느 하나의 형광을 공개하지 않는다.
의 전위를 조사하기 탐식 구동 염증 생체 이미징은, 복수의 컨트롤 고려한 립-Q 기반. 자유 DY-676-COOH가 phagocyt 의해 흡수 될 수 있음을 고려OSIS, 립-Q의 옵 소닌은 식세포에 의해 흡수 될 수있는 염료가 방출 될 수 있습니다. 이를 방지하기 위해, 립-Q는 5 몰 %의 PEG 화하여 제조 하였다. 또한, 염증으로 인한 기반 EPR 효과 및 활성 흡수 및 형광 활성화에 흡수를 구별 할 필요가있다. 이 문제를 해결하기 위해, 평가 및 모산에 의한 부종 베어링 생쥐의 세 가지 프로브, 즉 상시, 립 dQ를, 침묵 립-Q 및 무료 DY-676-COOH의 비교가 필요했다. 사카로 미세스 세 레비 시아 칸디다 알비 칸스의 세포벽로부터 제조 모산-A는 dectin-1과 같은 수신자 2/6 수용체 (TLR 2/6)를 통해 사이토 카인 분비의 천연 자극제이다. 차례로 분비 사이토 카인하여 비장 저수지 (35)뿐만 아니라 호중구, 염증 사이트에 자신의 마이그레이션에서 단핵구 / 대 식세포의 intravasation / 혈관 외 유출을 완화, 혈관 누출이 발생할 하류 계곡의 활성화를 유도(부종) 36 ~ 39. 모산 기반 단핵구 / 대 식세포의 혈관 외 유출 및 마이그레이션 프로세스는 모산에게 염증 과정 36 ~ 39 절을 연구하기위한 전략적 도구를 만드는 유일한 4.5-6 시간을 필요로한다. 때문에 염증 동안 발생할 혈관 누출로, 정맥 주사 프로브 중 하나 염증 사이트 나 extravasate 그들의 마이그레이션 중 단핵구 / 대 식세포 (식세포)에 의해 흡수 될 수 있으며, 부종 사이트 (EPR 효과) (40)에서 채택 될 주입. 비 켄칭 립 dQ를 사용 립-Q보다 부종 신호에 전체적으로 강한 배경, 단핵구 및 대 식세포의 이동을 반영 부종의 형광 증가를 보여준다. 실제로, 부종의 최대 형광 이미 립 dQ를 2-4 시간 포스트 응용 프로그램을 볼 수 있으며 8 시간까지 거의 일정하게 유지된다. 립 dQ를 립-Q에 반대, 자유 DY-676-COOH는 주사 후 빠른 관류를 거쳐 부종의 독특한 영상이 불가능하도록, 4 시간 이내에 삭제됩니다. 에terestingly, 부종의 형광 강도와 매우 낮은 배경 신호의 지속적인 증가 립-Q 결과의 사용. 립-Q와 형광 강도에이 지속적인 증가는 리포좀 발표 염료의 활성화를 형광에 기인한다. 이와 함께, 그것은 립 dQ를 4 시간 포스트 분사에서 최대 형광 (EPR 효과와 단핵 세포 마이그레이션을) 공개 이후 립-Q 기반 이미징의 EPR 효과의 기여도가 최소한의 것으로 결론을 내릴 수있다. 따라서, 리포좀 캡슐화 보호 차례로 독점적 식세포에 의해 내재화 및 분해 (형광 활성화) 후 부종의 생체 내 이미징에서 더 신뢰할 수있게 DY-676-COOH의 독특한 배달을 제공합니다. 지금까지 형광 리포좀 촬상 특성을 검증하는 자이 모산 - 유도 뒷발 부종의 사용은 신규하다. 본원에보고 된 프로토콜은 상이한 형광 염료의 캡슐화 및 다른 DRU의 억제 효과를 이미징 모두에 의해 확장 될 수있다염증의 유도에 GS는, 따라서 준비와 바이오 메디컬 이미징에 적합한 프로브의 특성 분석을위한 유용한 도구를 나타냅니다.
적절한 이미징 프로브를 정의를 향한 또 다른 중요한 단계는 자신의 약리학 적 특성 및 제거 경로의 확인이다. 이와 기관에서 간과 신장뿐만 아니라 짧은 유지 및 적절한 제거 등의 배설에 중요한 역할을하는 기관에서 프로브의 분포는 프로브가 훨씬 가능성이 환자에 악영향을 보여 없다는 것을, 일반적으로 표시입니다. 이에 따라, 마우스의 기관을 통해 리포좀 형광의 바람직한 제거를 의미 립-Q 또는 무료 DY-676-COOH 공개 경증 간 / 담낭의 형광 및 신장의 24 시간 후 분사를 준비 간담 경로. 이들 기관의 프로브와 그들의 효과적으로 제거의 짧은 숙박 시설은 7 FOL에 의해 입증된다장기의 D 높은 형광 신호는 립-Q 또는 무료 DY-676-COOH (32)의 6 시간 포스트 분사를 준비했다. 이러한 관찰은 리포좀 (41)의 제거에 따라하고 프로브를 특성화 생체 분포 연구 등의 중요성을 백업합니다. 이러한 활성화 42,43 보완하고 피부 자극 등의 부작용이, 임상 적용에 사용 리포좀 제형보고되었지만, 이러한 효과는 기본 리포솜 검출되지 않았다. 또한, 마우스 기관으로부터의 프로브 간극을 완료했다 프로브 주사 후 2 주 면역 결핍 마우스의 관찰 (도시 생략).
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Acknowledgments
이 작품은 독일 연구 협회의 HI-698 / 10-1 보조금과 RU-1652 / 1-1에 의해 지원되었다. 우리는 우수한 기술 지원과 종류의 지원에 대한 회사 DYOMICS GmbH에, 예나에 대한 도린 월 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials and equipments for preparation of liposomes | |||
| egg phospahtidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051P | Dissolve in chloroform and store in glass vials (214 mg/ml) |
| cholesterol | Sigma | C8667 | Dissolve in chloroform and store in glass vials (134 mg/ml) |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880120P | Dissolve in chloroform and store in glass vials (122 mg/ml) |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 810145P | Dissolve in chloroform and store in glass vials (2 mg/ml) |
| Sartorius MC1 (d = 0.01 mg) | Sartorius AG | Research RC 210 P | used for weighing the phospholipids |
| Rotavapor | Büchi Labortechnik AG | R-114 | used for hydration of phospholipid film |
| Waterbath | Büchi Labortechnik AG | R-481 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacuum Controller | Büchi Labortechnik AG | B-720 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacobox | Büchi Labortechnik AG | B-177 | used for hydration of phospholipid film |
| Circulation Chiller | LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG |
WKL 230 | used for hydration of phospholipid film |
| DY-676-COOH | Dyomics GmbH | 676-00 | Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C |
| Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan | Applichem | A1086 | buffer 10 mM, pH 7.4 |
| Trichlormethan | Carl Roth GmbH + Co. KG | Y015.2 | used for liposome preparation |
| Sonicator | Merck Eurolab GmbH | USR 170 H | used for liposome preparation |
| Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00) | Scientific Industries Inc. | SI-0256 | used for liposome preparation |
| Sephadex G25 medium | GE Healthcare Europe GmbH | 17-0033-01 | used for liposome purification |
| Triton X100 | Ferak Berlin GmbH | 505002 | used to destruct liposomes for dye quantification |
| LiposoFast-Basic | Avestin Inc. | used for the extrusion of liposomes | |
| Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U) | VWR | used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic | |
| Fluostar Optima | BMG Labtech | used for dye quantification | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | used for the determination of liposome size and zetapotential | |
| Ultracentrifuge | Beckmann Coulter GmbH | XL 80 | used for concentration of the samples |
| Rotor | Beckmann Coulter GmbH | SW 55 TI | used for concentration of the samples |
| Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging | |||
| Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae | Sigma | Z4250-250MG | used for induction of inflammation |
| Isotonic Saline (0.9%) | Fresenius GmbH | PZN-2159621 | used for the dilution of Zymosan-A |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda Isotec 4 | used for anesthesizing animals | |
| Isoflurane | Actavis GmbH | PZN-7253744 | anesthesia |
| Thermo Mat Pro 20 W | Lucky Reptile | 61202-HTP-20 | used to keep animals warm during anesthesia |
| Omnican-F (1 ml injection) | Braun | PZN-3115465 | used for subcutaneous and intravenous application of probes |
| Panthenol eye cream | Jenapharm | PZN-3524531 | used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia |
| Hanks buffered saline solution | PAA Laboratories /Biochrom AG | L2045 | w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells |
| 8-Well chamber slides | BD Biosciences | 354108 | used for cell culture followed by microscopy |
| Cell culture flasks | Greiner BioOne | ||
| Cell culture media | Gibco (life technologies GmbH) | ||
| Fetal calf serum | Invitrogen | ||
| Poly-L-Lysine solution (0.01%, 50 ml) | Sigma | P4832 | used to coat cell culture chamber slides |
| Mountant Permafluor | ThermoScientific | S21022-3 | Mounting solution for microscopy |
| Hoechst-33258 | AppliChem | DNA stain for microscopy | |
| Hera-Safe | Heraeus Instruments | sterile work bench used for cell culture | |
| HERA cell | Heraeus Instruments | Incubator used for cell culture | |
| LSM510-Meta | Zeiss | used for confocal microscopy | |
| Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system | CRi, Woburn | used for whole body fluorescence imaging of small animals | |
| Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV) | GE Healthcare | used for measurement of absorption | |
| Spectrofluorometer (Jasco FP-6200) | Jasco | used for measurement of fluorescence emission | |
| Animals | |||
| NMRI mice (8-12 weeks old, male) | Elevage Janvier, France | used for inflammation trials | |
References
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