幹細胞から網膜色素上皮細胞の効率的な導出

Published: March 8, 2015 doi: 10.3791/52214

Peter Westenskow^1,2, Zack Sedillo^1,2, Ashley Barnett², Martin Friedlander^1,2

¹Department of Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, ²Lowy Medical Research Institute

Protocol

幹細胞由来のRPEの1.ダイレクト分化

注：全てのインキュベーションステップを、5％CO ₂中で37℃で実施される

維持培地（; 表1 MM）でのhESまたはHIPSライン（毎日餌）を維持する。ラインは、品質管理の十分な基準に達したら、マウス胚性フィーダー細胞（MEFの）の層の上にそれらを維持する6ウェルプレート250,000 /ウェルの密度で播種した。異種非含有培養もタッカーらによって設立されたプロトコルに従って生成することができます^。40。
幹細胞のコロニーがコンフルエントに到達できるように。
ニコチンアミド（; 表1 DM / NIC）に分化培地に切り替え。毎日食べます。
RPE分化を強化するために、培養3週間後、ニコチンアミドのいずれかアクチビンAまたはIDE-1（表1 DM / NIC / AAまたはDM / NIC / IDE1）で分化培地に切り替える。培養での5週間後、DM / NICに切り替える。メディア停止中のpH指示薬が給餌の翌日黄色回し一日一回の授乳は、もはや必要ありません。
（ 図2D-Fおよび3Aを参照してください）を切断して除去するのに十分な大きさであることを表示する色素性細胞の小島のを待ちます。

2.単離色素性島

コート天然の細胞環境を模倣マトリックスと24ウェルプレートのウェル（異種非含有であることが好ましい）。
注：角膜ブレードと鋭い、先の細い鉗子は、ピッキングのために非常に有用である。ピッキングしながら、分化した細胞のシート全体を切り離すことができます。慎重に作業し、当初は皿の中央にコロニーを拾い、この問題を回避してください。
必要に応じて、分化培地（表1 DM）を24ウェルプレートのような多くの井戸を埋める。この決定は、着色されたコロニーの数に依存する集めた。
解剖スコープを持つ細胞培養フードでは、手動で着色された島を切り出す。約2-6バラバラにメスを使用して、元のプレートの下にあるそれぞれの膵島を切り刻むと鋭いピンセットで着色された部分をつかむ。
各24ウェルに1-2着色された部分を転送します。
細胞が接着するまで、メディアを1週間に3回の変更を開始、その後、3〜5日間のメディアを変更しないでください。（彼らはこの時間後に付着していない場合は、可能性が、彼らは決して良いことである）。
分化培地（DM; 表1）で3~4週間細胞を増殖-典型的な培養物の画像を図3Bに示されている。細胞はまだ全体をよく埋めないかもしれないが、より長い待っていることは助けていないようです。細胞を1週間に3回を養う。
必要に応じて、約3週間後に、手動で鋭いピンセットで塊の白い細胞のクラスターを削除します。それが必要でない限り、この手順を実行しないでください - それは、汚染物質を導入することは容易である。〜するのは理想的です。ステップ1.6で、元の着色されたコロニーからRPEの最も純粋な集団を得ることを試みる。

3.継代幹細胞由来のRPE

37℃で5-8分間（好ましくは、トリプシンの希釈を通して不活性化することができる試薬であることが好ましいていない）細胞解離溶液と200μlの持つ細胞を剥離し、DMで希釈し、それを不活性化する。すべてのセルを洗い流すためにと（2つの24ウェルから細胞をプールすることを検討、数個の細胞のみが含まれているだけでなく、選択している場合）、それらを再懸濁し、200μlのピペットを使用してください。
遠心機（5分間800×gで）、上清を捨て、そして3ミリリットルDMのメディアで再懸濁します。
再プレート細胞1つ（または2つ）ウェル当たりDM 3ml中の一つのマトリックスコートした6ウェルに24ウェルから（1：5の拡張）。
細胞が約90％コンフルエントになるまで1〜2週間を展開。完全に分化した純粋培養の画像は、図3Cに示されている。
1ミリリットルの細胞dで細胞を剥がし37℃で約5-8分間issociation溶液は、DMで希釈し、それを不活性化する全ての細胞を洗い流す1,000μlのピペットを使用し、それらを再懸濁する。
スピンダウン（5分間800×gで）、上清を捨て、そして18ミリリットルのDM培地で再懸濁します。
（6展開1）又は1でコーティングされた75センチメートル²フラスコ（1：7.5の拡張）は、6マトリックスに1つの6ウェルの各々から再プレートの細胞をウェルあたりDM 3mlの6ウェルをコーティングした。
十分な細胞が得られるまで繰り返して、必要に応じて3.4から3.8を繰り返します。
注：むしろ各通路はRPEの脱分化を誘導するので、継代を経由しての文化を増幅することを計画よりも拡大のための可能な限り多くのコロニーを収集してみてください。

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Representative Results

図1に示すように、本稿で説明する手順は、以前に報告されているように^10,12を容易に幹細胞からRPEを生成するために使用することができる。数週間のiPSラインを維持した後、着色されたコロニーが5-7週間後（7週齢の培養物は、図2A-Cに示されている）の後にコロニーに現れ始める。これらのコロニーは培養が維持されているように週間成長し続けることができます。 図3Aに示すように、 図2D-F（8週目の培養）に示すように、十分な大きさに達したら、それらを手動で切り出すことができる。非RPE細胞の混入を避けるために慎重な切除が大幅に十分に純粋RPE培養（ 図3B-C）の生成を促進する。

図1：回路図を描いたIPS-RPE導出 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2：アクチビンA ANDのIDE-1のiPS-RPEの収率を向上させる。（A）小色素性コロニーは、いくつかの（6ウェルプレートの底に付着して単一のシートで非RPE細胞との間の自然発生的に、培養中の7週間後に現れ始める）矢印でマークされている。（BおよびC）、さらに色素性コロニーの出現でIDE-1またはアクチビンAの結果の補給（一部はACに矢印でマークされている）、アクチビンAまたはIDE-1のいずれかでその補充を実証するには、RPEを強化分化。（DF）8週間後、IDE-1またはアクチビンAの補充の効果がさらに顕著である。着色された島の数や大きさの両方が監督分化後大きくなっている。スケールバー= 5ミリメートル

図3：拡張との最終分化物品税に十分な大きさである色素性のiPS-RPEコロニーの着色されたIPS-RPE。（A）代表画像。非RPE細胞を、6ウェルプレートの底にコロニーを囲む。青のアウトラインは、第一膨張工程後の培養でコンフルエント後の未熟IPS-RPE細胞の（B）画像。切除されるであろう地域にマークを付けます。（C）2ヶ月古い最終的に分化したiPS-RPE細胞。高度な分化を示す明白なセル境界と色素沈着の均一なレベルの存在に注意してください。スケールバー=100μmの

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Discussion

この原稿では、効率的に純粋なIPS-RPE培養を大量に生成するための手順の概要を説明します。私たちは強くトランスクリプトミクス、プロテオミクス、メタボロミクス、および機能性に基づいてhRPEに似たiPS-RPEを生成することができますアクチビンAと、この指示分化プロトコルを使用して、以前に示されており、RCSラット^12,31,32のに移植するとき、彼らは網膜変性を遅らせること。のiPS-RPEを生成するプロセスは、時間がかかり、面倒ではない（ 図1）である。のiPS培養物がコンフルエントに達すると、彼らは日常的に分化培地を供給する必要があります。私たちは、アクチビンAまたはより安価な低分子IDE-1のいずれかでメディアを補完し、一般的には5-7週間後（ 図2A-C）の後に表示される着色されたIPS-RPEコロニーのための文化を監視しながら、2週間の餌を続ける。一度十分な大きさに達した（ 図2D-Fおよび3A）、コローニESは手動で削除すると拡大のための新たなプレートに移す。これは8週間後に、大きく発生し、プロトコル全体の中で最も困難なステップです。

最も挑戦的な側面は、偶然に着色されたコロニーの中や周辺に不要な隣接セルを収集することにより、拡大培養における非RPE細胞の混入を避けている。汚染の程度に応じて、非RPE細胞の島が膨張時に手動で除去することができ、毎回が培養物は、細菌または真菌汚染物質を導入する追加のリスクが増加して処理される。それは私たちの経験では、IPS-RPEが実際に継代工程中に混入細胞の数が少ない「打ち勝つ」ことができることは注目に値する。しかし、我々は強く、彼らがこれらの手順に頼ることを避けるために可能な限り純粋であることを確認するためにコロニーを選ぶ際に十分な注意を取ることをお勧めします。第二または第三の通過により、IPS-RPE培養は十分に純粋と基本仕様である細胞のcient番号が特性評価および移植のための利用可能です。

ここで報告技術は確かに幹細胞由来のRPEを導出するための唯一の方法ではありません。実際には、最も簡単でも、最速でもない。最も簡単で最も広くメソッドは、自発的な分化を使用することです。（ただし、2週間IDE-1の補充は、安価であり、非常にのiPS-RPEの収率を増加させる。）のiPS-RPEはまた、表面に付着するように強制することができる偏光のRPE細胞の球に分化する胚様体に生成した培養プレートと単層として展開します。 RPE細胞はまた、非常に積極的に特徴づけられて強くhRPE ²⁷に似ているこの方法を使用して生成する。 RPEは、プロRPEは、ニコチンアミドaを因数追加後でその後、神経網膜前駆運命にそれらを変換するためにニコチンアミド、IGF1、ノギン、Dkk1の、およびbFGFでメディアを補完することにより、幹細胞から（のみ14日に）非常に急速に区別することができますNDアクチビンA ^37。 RPEはまた、cMYCは、MITF、OTX2、RAX、およびCRX ⁴⁴を含む転写因子の最小セットで線維芽細胞を形質導入することにより約1ヶ月での線維芽細胞から直接的に一層迅速に生成することができる。しかし、これらの結果は非常にRPEを奨励している間は、これらの最後の二つの技術はまだ厳密にin vivoでそれらを注入することによって特徴付けられていない生成。したがって、我々は彼らの研究で採用しているかを決定する際、読者が慎重にすべてのRPE導出オプションを検討することを示唆している。

ここで概説したプロトコルを使用することの利点は、その単純さと非常に高品質のRPE ³¹の一貫して高い歩留まりである。 IDE-1ではなくアクチビンAの補充が大幅に全体的なコストを削減し、組換えタンパク質を使用することに伴うリスクを低下させる。選択肢が持つ異なる分化方法を使用する場合、それはまだ明らかではないので最終製品への影響は、異なる研究室で生成されたRPEの間の直接の比較は（おそらく特に疾患モデルの場合）が必要となる場合は特に、標準化されたプロトコルを利用することが有利であり得る。少し専門知識および試薬を必要とし、それはIPS-RPEの高収量を生成し、このような単純なプロトコルは、このような状況のための理想的な場合があります。

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corneal knife	Surgipro	SPOI-070	knife x 1
DMEM/F-12, HEPES	Life Technologies	11330-032	500 ml x 4
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X w/out Ca or Mg	VWR	45000-434	500 ml x 6
Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated)	VWR	45000-736	500 ml x 1
FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein	Life Technologies	PHG0021	100 µg x 1
IDE-1	Stemgent	04-0026	2 mg x 1
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM	Life Technologies	25030-081	100 ml x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Life Technologies	11140-050	100 ml x 1
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G	100 g x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-148	20 ml x 1
Recombinant Human/Murine/Rat Activin A	PeproTech	120-14E	10 µg x 2
Synthemax-T Surface 6 Well Plates	Corning	3877	Case(12) x 1
TrypLE-Express Enzyme (1X), no phenol red	Life Technologies	12604-021	500 ml x 1
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.1µm pore, 500ml	Corning	431475	Case(12) x 1