Introduction
Tリンパ球は、適応免疫系の重要な構成要素である。 T細胞だけでなく、直接のエフェクター機構の様々を通して病原体に対する防御免疫応答を媒介するだけでなく、積極的な免疫学的自己寛容を維持し、免疫系の他の細胞の応答を指示するための責任がある。これらの機能は、T細胞受容体（TCR）ライゲーション、サイトカインおよびケモカインを含む統合された信号の数、および代謝産物1を介して導かれる。これらの信号のうち、TCRは、適応免疫におけるT細胞の役割を定義する特徴的な特異性を提供するので、特に重要である。 TCRは、T細胞エフェクター機能を開始する信号を提供するために、高度に特異的かつ高感度な方法でMHC（ヒトオルソログHLA）分子（pMHC複合体）によって提示された線状ペプチド抗原と相互作用する。 pMHC複合リガンドとTCRとの相互作用の生化学的パラメータだけでなく、Tに対する特異性を提供する細胞の活性化だけでなく、その後のT細胞機能2に定性的な影響を与える。したがって、T細胞の機能を研究することは、多くの場合に定義された抗原特異性を有するクローン性T細胞の応答を調べることが必要である。
約10 12αβT細胞を含むヒトT細胞区画、推定された10 7個含まれている- 10 8の異なるαβTCRs3-4。この多様なレパートリーは、防御免疫のためのT細胞応答を必要とするであろう潜在的な病原体からのペプチドの広大な配列を認識するための機会を提供する。その抗原5の前に免疫応答の非存在下で10 -7 -それは、自己MHCにより提示される特定の外来抗原に応答するT細胞の頻度は、10 -4のオーダーであると推定される。ナイーブT細胞レパートリーは、ペプチド抗原および制限が反応提示自己MHCを認識する能力を確保するために、胸腺選択することによって成形される自己ペプチド抗原に対するivity、防御免疫2を仲介するための潜在的な有用性を最大化する。しかし、この設計された反応性は、比較的大きな周波数に違反して、10 -3 -免疫学的にナイーブな個体由来のT細胞の10 -4は 、外来MHC分子だけでなく、それらが提示する内因性ペプチドの両方を認識し、同種異系の細胞による刺激に応答する6。同種異系のpMHCリガンドの認識は、自己MHCによって提示された外来抗原の認識と構造的に類似している。 TCRは同種異系MHC分子だけでなく、提示されたペプチド7の両方で重要な生化学的相互作用を行う。同種細胞8の表面上に存在するpMHC複合体の多様性から、同種刺激の結果に対するT細胞の応答の強固な性質。これは、各MHC 9、約2×10 4個の異なる内因性のペプチド抗原を提示すると推定される。このB同種刺激に対する応答のreadthは、T細胞の同種反応性に起因する、そのような宿主病（GVHD）に対する同種移植片拒絶または移植片として臨床的に関連する病理の重要な側面である。
ヒトT細胞のアロ反応性応答の研究は、伝統的に同種異系細胞での刺激の後に、ナイーブT細胞のポリクローナル応答を調べることに頼っている。限界希釈と組み合わされ、同じ同種異系の細胞株での反復刺激は同種異系HLA 10の定義された認識にクローン性T細胞を生成することができる分析。しかしながら、このアプローチは、HLAがT細胞の広範なレパートリーを刺激する特定の同種のために存在する内因性pMHC複合体の大規模で多様なレパートリーとして、個々の同種のpMHCリガンドへの応答を調べるための問題である。このバルク集団の刺激および限界希釈手法が望まをReactiでT細胞を単離するために多数のクローンのスクリーニングを必要とするシングルのpMHCリガンドに対するVITY。さらに、個々の同種のpMHCリガンドに応答するT細胞の頻度は、所与の抗原に応答したヒトT細胞クローンの効率的な生成に対する障壁を提示ナイーブT細胞集団の中でも比較的低い。
ポリクローナル集団からの抗原特異的T細胞の同定および単離は、フルオロフォアで標識されたpMHC複合多量体11の開発によって使用可能になっている。このアプローチは、ストレプトアビジン標識フルオロフォアに結合することによって標識される組換え可溶性ビオチン化MHC分子にロードされ、特定のペプチド抗原を利用する。のpMHCの多量体は、可溶性のpMHCリガンドのTCRの本質的に低い（μm）との親和性を補償、アビディティーを増加させる。標識細胞は、フローサイトメトリーによって同定し、単離することができる。しかしながら、このアプローチは依然として典型的にナイーブT細胞集団の中の抗原特異的T細胞の低頻度によって制限されほとんどのフローサイトメーター上で正確な同定と定量限界未満の桁違い。この制限に対処するために、四量体標識された細胞についてのpMHC四量体標識およびその後の磁気ビーズの濃縮方法は、12を開発してきた。この方法は、信頼できる検出、計数、および低周波の抗原特異的T細胞の単離を実証した。
このプロトコルは、具体的には、個々の同種異系のpMHCリガンドに反応するヒトT細胞クローンを生成するための効果的なプロトコルについて説明します。このプロトコルは、細胞をフローサイトメトリー選別および単ソートされた細胞（からのT細胞クローンの産生を可能にするために、ヒトT細胞のin vitro培養のための堅牢な方法ではアロ抗原特異的ヒトT細胞の単離のためのpMHC（HLA）多量体標識および濃縮を適用する図1の概要）。
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Protocol
注意：このプロトコルは、ヒトボランティアから末梢血サンプルを使用する必要がある。ヒト被験者を持つすべての研究はヘルシンキ宣言（2013）1996年の医療保険の携行性と責任法の遵守を確実にするために人間学部治験審査委員会によって審査され、承認されるべきである。
全血由来のT細胞の単離
- 開始する前に、室温に密度勾配媒体を温める。アリコート2-4無菌の15ミリリットルの円錐遠心管に密度勾配培地4ml（1チューブは、それぞれ10ミリリットルに希釈した血液の総容積のために使用される）。
- コーティングされた1-2ヘパリンナトリウムスプレー（緑·トップ）静脈採血管中の血液の10〜20ミリリットル得る。訓練された個人の監督下でヒト検体を収集し、治験審査委員会によるとプロトコルを承認した。
- 70％エタノールでチューブの外側を拭きます。注意深くFiのの上部を取り外し収集チューブをlledおよび無菌50ml遠心チューブに血液をデカントする。
- 各採血管10 mlの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を加える。 、PBSを収集デカント全血に追加し、穏やかに混合する。
- 25μlのヒトT細胞濃縮カクテル/ 2ミリリットルの合計容量を追加します。 20分間室温でインキュベートする。
- 密度勾配媒体の上に静かに1希釈した血液10 mlピペットを用いて、1を10mlまで層。密度勾配媒体の表面を乱さないように注意してください。
- 遠心分離機は、20 Oで20分間、1200×gでの血液及び密度勾配媒体を層状
- 密度勾配媒体及び密度勾配培地と希釈血漿の間の界面での白血球の層との界面を乱さないように注意しながら、遠心機からチューブを取り外す。を5mlピペットを用いて、慎重に白血球層を収集し、新たな滅菌50mlコニカル槽に移す電子メール。
- 50mlに収集されたPBLの音量を持参し、穏やかに混合するために、PBSを追加します。
- 20 Oで5分間600×gで遠心分離デカントします。
- 緩衝液（1％BSAを含有する滅菌濾過したPBS）をソーティングサイトメトリ10ml中のペレット化した細胞を無菌の流れを再懸濁する。細胞懸濁液のサンプル10μlを、血球計算板を用いて細胞をカウントするために1：10（90μlに追加）パンブルーを希釈（期待利回り1 -全血の4×10 6細胞/チューブ）。
- 5ミリリットルチューブに移し、1ミリリットルのアリコートを取り出し、四量体によって標識されていないT細胞の解析のために氷上に保つ。氷上で細胞懸濁液を保管してください。
アロ抗原特異的T細胞の2磁気濃縮
- 1にアロ抗原のpMHC四量体を希釈：無菌ソートバッファ100。
- 20℃。で5分間600×gで遠心細胞懸濁液（1.11ステップ9 ml）をデカントします。
- ペレット化に希釈したアロ抗原のpMHC四量50μlのを追加細胞（10 7細胞まで）。穏やかなピペッティングにより混和する。無菌5ミリリットルチューブに移す。室温で30分間インキュベートする。
- 2ミリリットルソートバッファを追加します。 20 Oで5分間600×gで遠心分離デカントします。
- 100μlのソートバッファで細胞を懸濁します。 10μlのビオチン選択カクテルを加え、室温で15分間インキュベートする。
- 5μlの磁性ナノ粒子を添加し、室温で10分間インキュベートする。
- ソートバッファおよびピペッティングにより穏やかに混合2.5ミリリットルを追加します。 5ミリリットルチューブに移し、100μlのアリコートを外し、前増菌細胞の分析のために氷上に保つ。
- 細胞分離マグネット中の細胞懸濁液を含む5 mlチューブを置き。キャップは、チューブの上に緩くする必要があります。室温で5分間インキュベートする。
- 優しくチューブからキャップを取り外します。一緒にチューブと磁石を保持し、新鮮な5ミリリットルチューブにチューブの内容をデカント。にチューブの内容をタップするか、振らないでください液体の最後の水滴を除去。
- 磁石からチューブを外します。 2ミリリットルの冷たいソートバッファを追加し、ピペッティングにより穏やかに混合。 2血球計数器を用いて細胞をカウントし、トリパンブルーを（10μlに追加）：サンプルの細胞懸濁液10μlを、1が希薄。
単一細胞フローサイトメトリー細胞選別のためのT細胞の調製
- （、四量体標識されていない四量体で標識された非濃縮、および四量体で標識された濃縮された）は、細胞の全てのチューブに冷たいソートバッファを追加し3ミリリットルにボリュームをもたらすために。
- 4°Cので5分間600×gで遠心分離し、デカントバッファー、細胞を回収した。
- 25μlの冷たいソートバッファでペレット化した細胞を再懸濁。 5μlのヒトFcブロックを追加します。 20分間氷上でインキュベートする。
- フローサイトメトリーソーティングのための抗体を調製する。 15μlのソートバッファ、15μlの抗CD5、15μlの抗CD14、および15μlの抗CD19を混ぜる。
- 細胞の各チューブに抗体混合液20μlを追加します。 20分間氷上でインキュベートする。
- 各チューブに冷たいソートバッファの2ミリリットルを追加します。
- 4°Cので5分間600×gで遠心分離し、デカントバッファー、細胞を回収した。
- 並べ替えバッファ内の1 -2×10 6細胞/ mlの濃度で細胞を再懸濁する。
- ヒトT細胞培養培地のアリコートを100μl（2mMのグルタマックスを補充したIscoveのDMEM、10 mMのHEPES、50μg/ mlのゲンタマイシン、50μM2-メルカプトエタノール、10％熱不活性化ヒトAB血清、および2.5 / mlの組換えヒトIL-2）を96ウェル丸底細胞培養プレートの各ウェルに。氷の上に保管してください。
単一細胞フローサイトメトリーソーティングによる四量体で標識されたT細胞の4.絶縁
- アロ抗原のpMHC四量体標識したT細胞（ 図2.A）を識別するために、フローサイトメトリー·ゲーティング·パラメータを確立します。 、ダブレットを排除するためのゲーティング戦略を確立するために、前増四量体標識された画分を使用してリンパ球にゲート、B細胞、およびCD14を発現するCD19を除外する単球を発現し、そしてCD5発現によりT細胞を同定する。 （四量体によって標識されていないサンプルからの細胞は、このゲート内に入る必要があります- - CD19 CD5 + CD14の0％を含む）四量体結合性T細胞の同定のためのゲーティングを確立するために、蛍光として四量体で標識されていないサンプルから1を引いたコントロールを使用します。
注：十分に厳しくないゲーティング戦略が過度に制限ゲーティング戦略は、単離されたT細胞の数を減少させる一方で、抗原特異的でない非T細胞又はT細胞の単離をもたらす。 - 単セルのソートのためのプレートのパラメータをプログラムする。各ウェルに四量体+細胞- CD19 - 1 CD5 + CD14を配置するソーターを指示します。ウェル（ウェルにソートされない細胞）を1ネガティブコントロールが含まれていないようにセットアッププレートと1ポジティブコントロールを直接（100 CD5 + CD14 - CD19 -四量体-細胞）各行の（ 図2.B
- 確立されたフローサイトメトリーゲーティング戦略とプレートセットアップを用いて、フローサイトメトリー細胞選別機を使用して直接96ウェルプレートに、個々の四量体結合性T細胞を単離する。
5.文化とアロ抗原特異的T細胞クローンの拡大
- 細胞選別、20℃。で5分間600×gで遠心分離板の完了後6％CO 2インキュベーター中で37°Cの時の場所培養プレート。
- 30秒間ボルテックス刺激抗CD3 /抗CD28マイクロビーズは、ビーズを再懸濁する。
- 収集されたT細胞の刺激に必要な活性化因子ビーズの量（活性化因子ビーズ/ウェルの0.5μl）を計算します。無菌5ミリリットルチューブに刺激ビーズの計算されたボリュームを転送します。 1ミリリットルのヒトT細胞培養培地およびボルテックスを追加する。
- 磁石でビーズ懸濁液とチューブを置きます。キャップは、チューブの上に緩くする必要があります。室温で2分間インキュベートする。
- そっと取り外しチューブからキャップ。新鮮な5ミリリットルチューブに、一緒にデカントチューブ内容物をチューブと磁石を保持している。チューブの内容をタップするか、振らないでください。
- 磁石からチューブを外します。ヒトT細胞培養培地を追加します（マイクロビーズ100μlの培地/ 0.5μlを最初に添加）。
- アリコートを96ウェルプレートの各ウェルにベータービーズ懸濁液100μl。 6％CO 2インキュベーター内で37°Cの時に培養プレートをインキュベートする。
- 顕微鏡検査によって毎日の細胞増殖を監視します。培養7日間（ 図3.A） -増殖細胞の小さなクラスターが5の後、顕微鏡で観察することができる。
注：この時点でのT細胞培養物の可視化は困難である可能性があり、この段階で観察できる細胞クラスターが存在しないことは、成長しているT細胞の欠如を示すことがないかもしれない。 - 細胞単離後14日目に、慎重に文化の一番のオフとメディアの100μlのを除去することにより、フィード培養は100μと交換; lの新鮮なヒトT細胞培養培地。 6％CO 2インキュベーター内で37°Cの時に培養プレートをインキュベートし続ける。
- 顕微鏡検査と培養液の色を評価することによって毎日の細胞増殖を監視します。 3日後に培地交換 - 大細胞クラスターは2微視的に見えるはずです。巨視的に、細胞ペレットを培地交換後14日の間に目に見えるようになるはずです。
- 細胞単離に続いて28日目に、顕微鏡検査によって成長しているクローンを同定。 200μlのヒトT細胞培養培地を含む48ウェル組織培養プレートの個々のウェルに成長陽性の96ウェルプレート培養の200μlの体積を転送する。
- 刺激抗CD3 /抗CD28マイクロビーズ（ - 5.6のセクション5.2に記載のように調製）12.5μlのを含む100μlを添加する。 6％CO 2インキュベーター内で37°Cの時に培養プレートをインキュベートする。
- 微視的元によって毎日の培養増殖をモニター培地の色のアミノ化および評価。 T細胞培養物が> 2×10 6 / mlに達したとき（通常は3~5日間、再刺激した後、メディアが開始された日を推定することができる淡黄色の回転）を、24ウェル組織培養プレートのウェルに、転送文化そして500μlのヒトT細胞培地を追加します。
- 10-14日目のpMHC四量体の分析が結合（セクション3および4.1に記載されてラベル付けおよびゲーティング戦略を使用して）フローサイトメトリーによりアロ抗原特異性を評価するために、T細胞培養液200μlを収集し、再刺激に従ってください。
6.長期再刺激および培養T細胞クローンの
- 継続的に14日ごとにすることができる所望の特異性を有するクローン性T細胞培養物を再刺激し、展開します。最後の抗CD3 / CD28マイクロビーズ刺激後14日目に無菌の5ミリリットルチューブにT細胞培養を収集します。 2.5ミリリットルの容積まで、単一のチューブ内で同一のT細胞クローンの複数のウェルを組み合わせる。 2.5ミリリットルの最終容量を持参し、ピペッティングにより穏やかに混合するためにメディアを追加します。
- 培養物から古いマイクロビーズを除去して細胞分離磁石にT細胞培養を含む5 mlチューブを置きます。キャップは、チューブの上に緩くする必要があります。室温で5分間インキュベートする。
- 優しくチューブからキャップを取り外します。一緒にチューブと磁石を保持する新鮮の5mlチューブに細胞懸濁液をデカントする。タップまたは液体の最後の滴を除去するためにチューブの内容を振らないでください。
- 4ミリリットルに最終容量を持って来るためにメディアを追加します。サンプル10μlを血球計数器を用いて細胞をカウントする。
- 室温で5分間、600×gで遠心分離することによってT細胞を回収する。
- 上清を除去。 10 6細胞/ mlのヒトT細胞培養培地で再懸濁し、T細胞。 24ウェル組織培養プレートの各ウェルに移し1mlアリコートを。
- 刺激性抗CD3 /αの12.5μLを含む100μlのメディアを追加することによってT細胞を再刺激するNTI-CD28マイクロビーズ（セクション5.2で説明したように - 5.6）。 6％CO 2インキュベーター内で37°Cのでインキュベートする。
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Representative Results
戦略をソーティングサイトメトリー、磁気ビーズ濃縮および単一セルの流れを経由して特異アロ抗原に定義され、このプロトコルは、クローン性ヒトT細胞培養物の生成を説明しています。 図1は 、プロセスの概要を提供します。
図1：プロトコルの概要ここで説明するプロトコルは、末梢血からのアロ抗原特異的ヒトT細胞クローンの生成のための信頼できる方法を提供する。単一のT細胞の単離および細胞培養を設定するプロセスは、約4.5時間かかると予想される。 T細胞クローンの拡大は、各服用14日間、非特異的T細胞の刺激は、培養の複数のラウンドを必要とする。クローン培養は、28日後に分離アロ抗原特異性について試験することができる、そして培養物をさらに繰り返すrounによる追加試験のために拡張することができ刺激のDS。
アロ抗原特異的T細胞の予想される収量は、ドナー、使用同種抗原、およびドナー反応性T細胞の対応する周波数に依存するであろう。 01：約20％のTリンパ球の10.0×10 6の白血球の血液/ mlで、2 04 * HLA-DR4（HLA-DRB1のT細胞の結合を測定した結果を示す図である。図 -平均健常ドナー4.5を有する。クラスII分子のHLA-DR4 13によって提示されるHLA-A2タンパク質の特異的アロ抗原、アミノ酸残基30-48（DTQFVRFDSDAASQRMEPR、A2 30-48））が陰性ドナー。
図2：単一の細胞培養物を生成するためのアロ抗原四量体標識された細胞のソーティングフローサイトメトリー。 A2 30から48のA.フローサイトメトリー同定および単離/ HLA-DR4のtetrameHLA-DR4陰性ドナーからrの標識T細胞。図示のように四量体+リンパ球- CD19 -磁気ビーズ選択により四量体標識された細胞について富化されたT細胞は、一CD5 + CD14にゲーティング、フローサイトメトリーによって選別した。四量体非標識細胞は四量体+細胞をゲーティング確立するために、蛍光マイナス1を対照として使用した。B.テトラマー+ T細胞を、100μlのヒトT細胞培養培地を含む96ウェル丸底組織培養プレートに分けた。示されるように、プレートのセットアップは、正および負の対照ウェルを含んだ。
2.0×10 7白血球の開始番号から、我々は4776分の1 T細胞のアロ抗原特異的細胞の頻度が見つかりました：
1.1×10 6四量体濃縮された細胞のx 0.992（シングレット）は0.744（リンパ球）×0.477（CD5 + CD14 - CD19を- ）×0.0034（四量体+ T細胞）X / 2.0×10 7末梢血白血球のx 0.314（前増CD3 +）
開始2.0×10 7白血球から、我々は文化のための88の個々の四量体で標識されたT細胞を単離することができた。説明したように抗CD3 / CD28マイクロビーズ刺激と文化の2ラウンドの後、私たちは（10日図3.Aに示される単一細胞の単離と培養後の成長の代表例）を顕微鏡検査によって2成長陽性の文化を同定した。説明したようにクローン培養物を1mlに拡大し、アロ抗原特異性はA2 30-48 / HLA-DR4テトラマー（ 図3.B）の結合を試験することにより評価した。
T細胞培養物の図3の評価。 96ウェルプレートT細胞培養のA.顕微鏡検査。 T細胞培養物10の代表例ソーティングフローサイトメトリーにより、個々のT細胞の単離後の日数。細胞を、200μlのヒトT細胞培養培地の体積の（矢印で示される例）/ウェル0.5μlの抗CD3は/ CD28ビーズで刺激した。のpMHCのフローサイトメトリー分析により評価クローン性T細胞培養物のB. T細胞のアロ抗原特異性四量体標識。単離されたCD5 + CD14フローサイトメトリーのクローン性T細胞の培養- CD19 - A2は、30〜48 / HLA-DR4テトラマー+リンパ球は、 インビトロ培養の4週間後に結合A2 30-48 / HLA-DR4テトラマーについて調べた。四量体非標識細胞は四量体+細胞をゲーティング確立するために、蛍光マイナス1を対照として使用した。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium heparin venous blood collection tube 16 x 100 mm | Becton, Dickenson and Company | 366480 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 7801 | |
| Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 15061 | |
| Dulbecco's PBS, 1x without Ca or Mg | Corning | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| Fluorophore-labeled pMHC tetramer | NIH Tetramer Facility | NA | |
| EasySep Biotin Selection Kit | Stemcell Technologies | 18553 | |
| EasySep Selection magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| TruStain FcX Human Fc blocking solution | Biolegend | 422301 | |
| Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2) | Biolegend | 300621 | |
| Anti-CD14 FITC (clone HCD14) | Biolegend | 325603 | |
| Anti-CD19 FITC (clone HIB19) | Biolegend | 302205 | |
| Iscove's DMEM, without b-ME or L-glutamine | Corning | 15-016-CV | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| b-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Gentamicin sulfate (50 mg/ml) | Omega Scientific | GT-50 | |
| Human AB serum, male donor | Omega Scientific | HS-30 | |
| Recombinant human IL-2 | Peprotech | AF 200-02 | |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11131D | |
| Media | |||
| Cell sorting buffer | |||
| PBS, pH 7.4 | 1 L | ||
| BSA | 10 g | ||
| EDTA (0.5 M) | 2 ml | ||
| Human T Cell Culture Medium | |||
| Iscove's DMEM | 351.6 ml | ||
| Heat-inactivated human AB serum | 40 ml | ||
| HEPES (1 M) | 4 ml | ||
| Glutamax (100x) | 4 ml | ||
| Gentamicin (50 mg/ml) | 0.4 ml | ||
| b-mercaptoethanol (14.3 M) | 1.4 ml | ||
| Recombinant human IL-2 (1 mg/ml) | 1 ml |
References
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