תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג&#39;ין העברה על ידי Electroporation

Khujista D. Haque; Atul K. Pandey; Matthew W. Kelley; Chandrakala Puligilla

doi:10.3791/52260

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג'ין העברה על ידי Electroporation

13K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52260

⸱

12 בינואר 2015

Khujista D. Haque¹ , Atul K. Pandey¹ , Matthew W. Kelley² , Chandrakala Puligilla¹

¹Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, College of Medicine, ²Laboratory of Cochlear Development, NIDCD, NIH

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים שיטה המתארת בידוד ותרבית של צמחי שבלול מהאוזן הפנימית של עכבר עוברי. אנו גם מדגימים שיטה להעברת גנים לתוך צמחי שבלול באמצעות אלקטרופורציה של גל מרובע. תרבית הצמח במבחנה יחד עם טכניקת העברת גנים מאפשרת לחוקרים לחקור את ההשפעות של שינוי ביטוי גנים במהלך ההתפתחות.

תקציר

תאי שיער שמיעתיים הממוקמים בתוך איבר העכבר של קורטי מזהים ומעבירים מידע קולי למערכת העצבים המרכזית. תאי השיער המכנו-סנסוריים מיושרים בשורה אחת של תאי שיער פנימיים ושלוש שורות של תאי שיער חיצוניים המשתרעים לאורך הציר הבסיסי עד האפיקלי של השבלול. טכניקת תרבית האקספלנט המתוארת כאן מספקת שיטה יעילה לבידוד ותחזוקה של צמחי שבלול מהאוזן הפנימית של העכבר העוברי. כמו כן, המורפולוגיה והמאפיינים המולקולריים של תאי שיער חושיים ותאים תומכים לא חושיים בתוך תרביות צמח השבלול דומים לאלה שנצפו in vivo וניתן לחקור אותם בסביבה התאית הפנימית שלהם. צמחי השבלול יכולים לשמש ככלי ניסיוני חשוב לזיהוי ואפיון של מסלולים מולקולריים וגנטיים המעורבים באפיון ובדפוס התאים. למרות שמודלים של עכברים טרנסגניים מספקים גישה יעילה למחקרי ביטוי גנים, מספר ניכר של מוטציות עכברים מתים במהלך ההתפתחות העוברית ובכך מעכבים את הניתוח והפרשנות של פנוטיפים התפתחותיים. ניתן לתרבת את איבר קורטי מעכברים מוטנטיים שמתים לפני הלידה כך שניתן יהיה לנתח את התפתחותם במבחנה ואת תגובותיהם לגורמים שונים. בנוסף, אנו מתארים טכניקה לאלקטרופורציה של צמחי שבלול עובריים ex vivo שניתן להשתמש בהם כדי להפחית או לבטא יתר על המידה גנים ספציפיים ולנתח את התפקוד האנדוגני הפוטנציאלי שלהם ולבדוק אם תוצר גן ספציפי נחוץ או מספיק בהקשר נתון כדי להשפיע על התפתחות השבלול של יונקים^1-8.

מבוא

איבר היונקים של קורטי מורכב מפסיפס של סוגי תאים מיוחדים, כולל שני סוגים של תאי שיער מכניים-חושיים וכן לפחות ארבעה סוגים של תאים תומכים לא חושיים, מה שהופך אותו למערכת מודל אידיאלית לחקר תהליכים תאיים נורמליים כמו התפשטות, מפרט גורל, התמיינות ודפוס. בנוסף, התפתחות תקינה של סוגי תאים שונים אלה חיונית לתפקוד שמיעה תקין. לפיכך, חיוני להבין את הגורמים, הן המולקולריים והן התאיים, המווסתים את התפתחותם. עם זאת, גודלו הקטן של שבלול העכבר כמו גם חוסר הנגישות שלו מהווים אתגר מיוחד למחקרי ביטוי גנים. יתר על כן, רוב אירועי המפרט והדפוס של גורל התא מתרחשים בתקופות זמן עובריות ומסתיימים לרוב לפני הלידה. לכן, זיהוי ואפיון של אירועי איתות במהלך תקופות זמן עובריות חיוני כדי לקבל תובנה ....